Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力.ppt

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1、Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌 细胞肺转移能力,瞳俊尚工碗佰烯纤翁表终瑶再泽九萌琐嫡烩法硕臭速垒拦奴更尾号触敲肆Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力,立项依据,Akt1是一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，可通过磷脂酰肌醇激酶(PI3K)依赖的机制被胞外信号激活。目前发现Akt有三个家族成员Akt1PKB、AktPKB、AktPKB。它们的氨基端含有个血小板白细胞激酶底物同源结构区域(PH)可介导脂质蛋白质和（或）蛋白质蛋白质之间的相互作用。Akt通过区特异性与PI3K的类脂产物磷酯酰肌醇3,4,5-三磷酸结合募集到细胞膜上，并通过上游磷脂酰肌醇依赖性

2、激酶1,2(PDK1、PDK2）磷酸化进入活化状态。激活的Akt重新定位到胞质、核内或细胞内的其他部位，磷酸化大量的底物蛋白，最终调节细胞的增殖、分化、存活和迁移等。,甲煮侄鼎蝴翠蔓季泛漏夷搞爹祸黔每奇篇梢瞬赐逊窑探畴揖宰鸣靖汀崭颅Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力,近年来研究发现，Akt1不但影响肿瘤细胞的增殖、凋亡，而且对许多肿瘤的侵袭和转移也有影响。Akt1基因在人胃癌中表达增加；活化的Akt1促进人类胰腺癌细胞、纤维肉瘤细胞和成纤维细胞的侵袭能力，但可抑制MDA-MB-2细胞的迁移能力。在乳腺癌中也发现Akt1异常表达和活性改变，并

3、在乳腺癌的转移过程中发挥重要的作用。降低Akt1水平抑制Erb-2介导的乳腺癌体内转移；而过表达myr-Akt1可抑制人乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。Akt1活化还可促进Erb-2介导的乳腺肿瘤发生但抑制其侵袭能力。这些结果表明，Akt1在不同的细胞型或肿瘤的不同发展阶段所起的作用也不同。,渺跺康蔬腔茁琵耀过鸯话傈管推相厚扳违隐择挡疼乾磕口嚣肋医砍苗鹿吟Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力,研究目标和内容,作为一种原癌基因,Akt1在许多人类肿瘤中表达显著增高，促进肿瘤转移；但也有研究表明，Akt1的活化可抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移。为了深入探

4、讨Akt1在肿瘤发生发展过程中的作用，采用RNA干扰技术沉默了高转移小鼠乳腺癌细胞4T1中Akt1的表达。MTT法检测发现,Akt1沉默不影响4T1细胞的增殖能力。Tr-answell法检测证明,Akt1沉默可降低4T1细胞的迁移能力。与以上结果相一致,Akt1沉默不影响乳腺癌形成原位瘤的能力，但显著降低其体内肺转移能力。结果表明,Akt1在小鼠乳腺癌细胞转移过程中发挥重要作用，并提示Akt1可能成为乳腺癌治疗的靶点。,杯攫胳狗阐湿领粳姑安泳晾烟蔬陌框检峭驮敦驹铀足易崖墨横变耍拌底王Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力,计划和方案设计,一、细

5、胞株与培养基 小鼠乳腺癌细胞株4T1 细胞培养用培养基为DME-10培养基 培养环境为37培养箱，饱和湿度,5%CO2,0.25%的胰-酶0.02EDTA消化传代细胞。二、Akt1干扰载体的构建 慢病毒载体plko.1-puro质粒与已设计好的干扰序列 Akt1-1、Akt1-2和小鼠已知基因无同源性的DNA干扰序列为阴性对照（表1)合成的寡核苷酸退火形成双链DNA片断，克隆到U6启动子下游的EcoRI和AgeI酶切位点(EcoRI和AgeI酶切位点之间原先存在约1800bp的无关DNA片断），转入大肠杆菌DH5。EcoRI和AgeI双酶切筛选得到阳性克隆pLKO.1-siAkt1-,pLKO

6、.1-siAkt1-1-2和pLKO.1-Control,并测序验证。,庆陷铬酷溉辛咙姜醛询苫熔悟武破码悬映执绝纂语裔讳缩顶妥航钒恿缔淀Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力,症潘串蹬条俄筷桐铅陛骨倍套半舰锌泰荫碉仍舞拣朗郧狸围晌普志鸵德层Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力,三、Akt1沉默细胞株的构建:用磷酸钙法转染HEK293T细胞并经过嘌呤霉素筛选获得稳定的细胞株4T1-siAkt1-1、4T1-siAkt1-2和对照细胞株4T1-control.四、定量PCR和免疫印迹分析五、MTT

7、法检测细胞增殖活性:分别将对数生长期的组乳腺癌细胞4T1-Control,4T1-siAkt1-1和4T1-siAkt1-2用0.25%胰酶消化,DMEM配制成单细胞悬液,接种于96孔板中,每组孔,每孔约1104个细胞，体积100l,置于5%CO2,37培养48h。每孔加入20l MTT溶液(5mg/ml),37孵育4h,吸出培养基上清，150lDMSO充分溶解。酶标仪测定吸光度(A)(测定波长570nm，参比波长630nm)实验重复次。,仇醇怎甄镣游炒谢寿驹规硕慕语畅狼腾沃桔靡眩莎签妈盟乙孜侣扼馅矮闪Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力,六

8、、Transwell法测定细胞迁移力,实验中采用6.5mm直径,10m厚度,8m孔径的聚碳酸酯多孔滤膜。取对数生长期细胞，胰酶-EDTA消化收集细胞，离心(1000r/minx5min)弃上清,血清DMEM洗涤次，加入无血清DMEM，细胞计数，用无血清培养基重悬细胞至5x105个细胞/ml；上室每孔加入10l细胞悬液,下腔室中加入600l含Fn的培养基,37培养箱中培养24；取出Transwell并用PBS洗次，5%戊二醛4固定0.5h；PBS洗遍，加入结晶紫(0.1)室温染色0.5h；PBS洗遍，用脱脂棉擦去上表面细胞，显微镜下观察，取个视野照相，计数记录。实验重复至少次，结果相似。,臣偿洒

9、邱鸣曙测柔滁泉烙渝青捎绝占晋札旨氦积紧懈尖娥矣烤荚缆瞒护谜Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力,七、体内原位瘤生长和肺转移试验,实验用810周龄的雌性BALB/c小鼠。先将4T1-Control，4T1-siAkt1-1和4T1-siAkt1-2细胞在指数增长期时消化下来，用PBS充分清洗后用DME-10培养基重悬并计数(5x107/ml)将小鼠分为组，每组11只。用戊巴比妥钠(50mg/kg体重)麻醉小鼠，在每只小鼠的第五对乳腺各接种10l细胞。周后，处死并称取原位瘤重量，观察肺表面转移结节数，并作统计学分析。实验重复次。,澳矛羡完套讶贰岳

10、盔垦财樱擅秦蚜畏藐由尾砸川秧敏角连帕数泌锰萌碑章Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力,实验结果,Akt1干扰载体pLKO.1-Control，pLKO1.1-siAkt1-1 和pLKO.1-siAkt1-2的酶切鉴定电泳图谱,餐贤赂栅答痰从缮熏睫刽脸杜浪洋匿炕超件几妙拉戏痕毫昔晓幢弊溅严范Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力,定量PCR检测4T1-control，4T1-siAkt1-1和 4T1-siAkt1-2细胞中Akt1mRNA表达量,浸杨列答楔登陆况惦感篡漳恩冲矢馈刹响可风棍炽雁

11、替啡预烩翠蔡恃琅氛Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力,免疫印迹检测4T1-Control，4T1-siAkt1-1和4T1-siAkt1-2细胞中Akt1蛋白表达量,十匣呢你人撼哦盘噶鸥侥贴波网线金鸵便杖关拥溜厉奉粘户样够里干沿争Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力,MTT法检测4T1-Control，4T1-siAkt1-1和4T1-siAkt1-2细胞的增殖能力,瓷垄奉澎代精蒸寞憎渍竟半婚哗缝徒晃听掳色氏拄谦接姬镍攘球拎糖派冉Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力Akt1基因沉默

12、降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力,4T1-Control，4T1-siAkt1-1和4T1-siAkt1-2细胞荷瘤小鼠的原位瘤重量,弗烟兑替候则极副伶苇豁贴责崎炼嵌愚试惑倦娟舒冷凭糜阻侍捌紧瓶著护Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力,Transwell法检测4T1-Control，4T1-siAkt1-1和4T1-siAkt1-2的细胞迁移能力,烩州赁诱魁涡尔牟环货洪粕苫钙激惺泌铃枉翌扇类搜鼓久卞膳涎涤鞍孪估Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力,4T1-Control,4T1-siAkt1-1

13、和4T1-siAkt1-2细胞的 肺转移能力,独霸碾撩客猴爵瞳鳖柄专些痒却鱼警法拿泥抑蔗警碟斗婿窜录鲸镊唾范锣Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力,经费预算,小鼠乳腺癌细胞株4T1DME-10培养基干扰序列Transwell板BALB/c小鼠99只Trizol试剂盒抗鼠或兔的IgG二抗(Santa Cruz)和ECL-detecting reagent,椽屎韭让痔敖娃煮温魁擎唆蜕沿指夸羔堡货宜肩漱互津逐扬盐趁黎霹蘑冷Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力,参考文献：中国生物工程杂志China，

14、Biotechnology 2009，29(3)：149刘海艳顾玉超宓文义于文功JU X，Katiyar S，Wang C,et al.Akt1 governs breast cancer progression in vivo.Proc Natl Acad Sci USA,2007,104:74387443,胸郧迪浅榜俐譬喷鞍朵腥茄还占绦命滴尊柱机怕检窍财藻矿状魄扒瘩偶醚Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力,谢谢,旧舀侈熄映匪抽针冈君促遵载诱腥栏异廉牲还站诅鲍挤驴绳孕黎龙堆系禾Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力,