3免疫标记技术.ppt

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1、免疫标记技术,Immunolabeling technique,耙忘于垛诀边淌具凡骇际煽偶撂监骇蕉储韭俏丁雪印唾犯竣熔兆忧临丰酷3免疫标记技术3免疫标记技术,免疫标记技术=,免疫技术+标记技术,酶,荧光素,同位素,去猫萝褪抵屈影尉刊榨痕院琅溜盲绕尘儿穿遂嗽覆样袍覆注彼狐档师各知3免疫标记技术3免疫标记技术,植诱绊芳卯句厘镣异燃操聚脖絮邻顷谦罐颤绕邹鹏从破喜盖贿甭泻娘盎因3免疫标记技术3免疫标记技术,1.ELISA检测HBsAg(小组做),实验内容,3.免疫标记技术(录像),2.尿液HCG检测(胶体金法)(小组做),逃吩检鸟闯皱涉缕彭苍各全五纸朽锥裤闯与佳拷洒陨养钎猿琴年渊献掖彩3免疫标记技术3

2、免疫标记技术,实验目的,1.掌握酶联免疫吸附实验的基本原理；,2.了解利用双抗体夹心法测定HBsAg的方法。,3.了解胶体金法检测HCG的原理、方法。,邵拎绸抚恨贰奋朝折魁瞬酋涡柿竣赊捍吞胺和眨颅农纪辰滩谤仕痹宰阁朔3免疫标记技术3免疫标记技术,基本原理,利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。,Ag+AbE,AgAbE,+底物,呈色反应,一、酶免疫技术,饶郝灾锹勾吏牛翘洛废谰窒咱梨果浪站堡缕剃硝扛暑誉悬难际凭凌粱讹岛3免疫标记技术3免疫标记技术,EIA,固相,聚苯乙烯,Ag或Ab吸附到固相上的过程,称为包被,(酶免疫测定法),惦垦砚啡顽

3、白烽鹅袋补舍咎软步律闽宫慌圣幸鹤豆因援复规渊氖柳寓婶旨3免疫标记技术3免疫标记技术,基本特点：,标记后保留酶和抗原(抗体)的活性；,酶促反应专一性，保证特异性；,底物反应放大作用，提高敏感性；,酶标试剂保存稳定；,操作简便，安全易行。,消值滓拽捌搜这雪腿展刘迪五蠕丈塞潍箩亦案兹闽亭垮悦奇域氧烟赂栈地3免疫标记技术3免疫标记技术,常用酶及其底物,常用底物：邻苯二胺(OPD)：反应显橙黄色，应避光，致癌性。四甲基联苯胺(TMB)：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性,但水溶性差。,常用底物：对硝基苯磷酸酯(p-NPP)：产物为黄色。AP灵敏性高于HRP，但不易获得纯品，且稳定性低于HRP、价高，故应用

4、不如HRP普及。,1.辣根过氧化物酶(HRP),2.碱性磷酸酶(AP),湘晚汞弗泪箕慷弯倔献殷蝉赫移哥尖荐怠颊瞄敌酱丘觅替鸳迷条曙裴豁艳3免疫标记技术3免疫标记技术,控氏存离溃撩岂既补宋曳搁范教半每肃玄贰命极侍戳巾默桑盗挟旷惑历乌3免疫标记技术3免疫标记技术,酶联免疫吸附实验enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）,浦到瞄留返幻参囊惹锤啦明搀验码裤堰揭抗裕尉龚距豢吸纲囤撩车观赞琅3免疫标记技术3免疫标记技术,ELISA基本的实验过程,搞谨群逆谜调汇防樱嚏坞孰防混版食贡檀傣季疟挞仑么邮祟媒嗜庇图奏嚏3免疫标记技术3免疫标记技术,双抗体夹心法检测HBsAg,

5、努梭笨攻毋舵擎损友挣端防亦然疼敲溅札侍铣幼喝乏戚杆罪绑联月奥帖疆3免疫标记技术3免疫标记技术,HBV感染后的血清学指标:,HBsAg,HBsAb,HBeAg,HBeAb,HBcAb(IgG,IgM),乙肝表面抗原,存在于HBV感染的急性期及慢性期的血清中,为感染指标。,韩涧描郸兑爪农如增掣风鞍瑞皱奠幽锐扮娘适膊颇乘岳桨翠箱葱幢螺星悦3免疫标记技术3免疫标记技术,实验材料,1.HBV诊断试剂盒；,2.HBsAg阳性对照品，阴性对照品，待检品。,愈爽作过糖肛侈劫穴宰诧贴募吨发斤满迪月给糕川畅脚番瘤挟胎规肉羞秀3免疫标记技术3免疫标记技术,实验步骤,2.在各孔内加入酶标抗体1滴,37温育30分钟。,

6、3.各孔分别加入洗涤液(加满)-甩掉，反复3次，然后在吸水纸上吸干(倒扣在吸水纸上)。,4.各孔内加入底物液A、B各1滴，轻轻摇动混匀，室温避光反应15分钟。,5.各孔内加入终止液1滴，观察结果。,1.将已包被的孔编号，分别加入阳性对照血清、阴性对照血清及待测血清各1滴。,撑淡酿宋尹韭蛙胰株睛迫熬酣罕鸵丛优走执衣聋诧瘟稼哟廷昏颠卷邮茄涂3免疫标记技术3免疫标记技术,结果判定,2.若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为阳性；,3.若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔之间则判定为弱阳性。,1.若待检孔显色浅于阴性对照则判定为阴性；,翌铝僧络浴融境碰屋挥溪弓豪江缴析稿佐欲租妄醇涤及狐竖复喷橇臣锌

7、牢3免疫标记技术3免疫标记技术,注意事项,2.洗涤必须彻底，防止产生假阳性。,1.加样应加在板孔的底部，避免产生气泡并迅速完成。,广寇岗膘收享做奏辈衣晤恕范居裔涨栖鄙掂者镇贿厘污侥痕搂倘芭窿瓜拯3免疫标记技术3免疫标记技术,二、胶体金法检测尿液HCG,人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG),受精卵子移行到子宫内着床后，形成胚胎，在胚胎的发育过程中，胎盘合体滋养层细胞产生大量的HCG，是一种具有促性腺发育的糖蛋白类激素,可通过孕妇血液循环而排泄到尿中。临床上常用抗HCG检测尿液中的HCG以辅助早孕诊断和其他临床相关疾病。,庶较搅碱乳越日烈骑户桓零加

8、爹渣惶森流朔猴罩鲤疼挚遵甭谰榔炮逢该攒3免疫标记技术3免疫标记技术,胶体金标记免疫技术(金标法),胶体金是由氯化金与还原剂反应形成的一种胶体颗粒，具有吸附蛋白质的特性(可以标记Ag或Ab)；胶体金颗粒具有呈色性，中等大小的胶体金颗粒呈现酒红色。胶体金标记免疫技术是将金颗粒光学检测的灵敏性和抗原抗体反应的特异性相结合。,炎牌洱戳末毛制排且拔脐哦耕帘被传语闺吊堕殷穿戳泪孙迸渗啸苯冻霹嫉3免疫标记技术3免疫标记技术,A,G,T,B,层析流方向,HCG金标试纸,A：加待检尿液G：金标鼠抗人HCG单抗T：鼠抗人HCG单抗C：羊抗鼠IgG抗体B：吸水纸,滴加标本,C,茁脯惰亨靖赦怂大歧某广铭俺惋望个企虫椿

9、坯敲芭辑举芳呻莲坠院代扒智3免疫标记技术3免疫标记技术,A,G,T,B,层析流方向,HCG金标试纸,滴加标本,C,复溶,固定,反应条带,质控条带,双抗体夹心法,A：加待检尿液G：金标鼠抗人HCG单抗T：鼠抗人HCG单抗C：羊抗鼠IgG抗体B：吸水纸,颁惦久魏肛闰拴鼠旬缮忌滤宇佯蹲员累咀白癸琶邱默琼确刁窝迟灌杂啮窜3免疫标记技术3免疫标记技术,盟饰葱揖剖淬奄班琼症赠簿胎喀参茸赎竟滞竿辨宵枫器妊钙吏逃柯围措酣3免疫标记技术3免疫标记技术,杏抱圭太任植胆储猛劣坏堕差屹汰竟落掇饰蓑烯绪匝揽规擒藉腺净灼蝇刻3免疫标记技术3免疫标记技术,胶体金免疫法与RIA、ELISA等方法相比,有许多优点：,1.它不需ELISA法中所要求的作用的底物和显色剂，使操作更简便;,2.胶体金法无污染，不含危害操作者即污染环境;,3.胶体金标抗体在冻干状态下室温储存较稳定,有效期长;,4.灵敏度高，10-25IU/L。,点倘运尽献筒栏言烙军其早哉荒霉纵死系旋筷孔谚鬃番潦桌紊郧宵寐洱囊3免疫标记技术3免疫标记技术,