HLAB27高分辨基因分型的临床.ppt

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1、HLA-B27高分辨基因分型的临床应用,天津秀鹏生物技术有限公司,剃譬柒求氦毕搐连竖早男陨麓湖稽操愁铆蹋忧功淀愉砧植垢滇贸噎衫霖羌HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,稚篮啪垒蚕奶惊沛合鲍晚虑郊贺空诌灭宜歼皋巫份筏宴囚铲铺女筑展鳖盒HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,1.HLA-B27抗原分子及其等位基因,领髓风蛰霉栽痘匹鹿株锥占静快餐抖佐羔柜接钠戴政柱秸狠治硬移馈粳恰HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,HLA-B27抗原分子结构及其特点,HLA-B27抗原分子是由位于人类第六号染色 体短臂上B*27等位基

2、因编码的糖蛋白,分子量 为56103U。由两条多肽链组成，一条为链或重链，分子 量约为44103U，包括胞外区，跨膜区，胞 内区三个结构域，其中胞外区又分为1，2，3三个结构区；另一条为链或轻链即2微 球蛋白，分子量约12103U，二者结合共同 组成HLA-B27抗原分子。,硼紫憨磊慌桨蕊附卵靶茫储汇每铁腮结戳簿奈绿拾磁努陷幸墟靶望冈仟恿HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,HLA-B27抗原分子结构,掀养腆巩把保均喻纺浓胆簇授醛锄用蔷夸咆栗哭慕塔惦步镜旗封焊韩函拨HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,1区与2区的肽链折叠后共同构成一个抗

3、原 结合凹槽，槽内形成A,B,C,D,E,F共6个袋状结 构，其中B袋在HLA-B27分子中是最保守的结构。凹槽的作用是结合抗原肽，使抗原肽与HLA-B27 分子牢固的结合。,烘酸今千蜕翟喷线区陛醒特孰捡党示淆柒郴蚊过饺奉傅熄翌吉孺暴罢佩沼HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,HLA-B*27等位基因结构及其特点,2002年WHO正式命名的HLAB*27 等位基因达到了24个，其中只有15个 有相对应的抗原表达。到2009年11月 WHO正式命名HLAB*27等位基因 达到59个(B*2701一B*2759)。HLAB*27等位基因呈多态性，主要 是因为个别的碱基突

4、变造成的，编码蛋 白的差异主要集中在l、2结构区内。,舌娄票矩州宋祁俞庙标沁虚粹两郊煞撬盛脓刽贞瑚淬此咀伤祷名亦振艇亨HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,其中HLA-B*2701与HLA-B*2705编码的蛋白 在78-81范围内有2个氨基酸的不同；其中HLA-B*2702与HLA-B*2705编码的蛋白 在78-81范围内有3个氨基酸的不同；其中HLA-B*2703与HLA-B*2705编码的蛋白 仅有1个氨基酸的差别，即在59位前者 为组氨酸（His），后者为酪氨酸（Tyr）；,踞削达碗淀逸股谓慰姿断盐饲剁园兰甚仁搔灯崔碰鲸糯甫滦赏俭丫广漱饮HLAB27高分辨

5、基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,HLA-B*2705基因分布最广，几乎见于所有人种。甚至认为其它等位基因都是由HLA-B*2705基因发 生突变、移位形成的。HLA-B*2705编码的蛋白最为显著的特点就是在B袋 上的45位发生氨基酸的突变，这一改变直接影响 HLA-B27分子在细胞表面的表达，影响HLA-B27分 子与抗原肽的结合，同时影响了HLA-B27分子对胞 内外抗原的递呈。,瘁频搀馅陨贺矗韭杆滦秆貉菠佯驴镀蝎泄凌油芜逃富诧拨霄失胸昆叮柄敦HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,2.与HLA-B27相关的疾病,晤卧珐蔷多理坊鲤签播斤总绢漱捍邢膘

6、事策便恼受遂歧瞬炙术各血妨雷柄HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis AS）幼年类风湿关节炎（juvenile rheumatoid arthritis JRA)急性前葡萄膜炎(acute anterior uveitis，AAU)白血病等疾病,吟夏圈削绷砰仿子忽绩鼓旬清披免击你祥氨帝喀烤臼屯蹿逞蝴臀齿萧蓬谅HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,强直性脊柱炎（AS）,1973年Brewerton和schiosstein发现 强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis

7、 AS）与HLA-B27抗原有 非常强的相关,这是目前唯一有临床 价值的血型相关抗原,这在迄今已知 的HLA与疾病的关联中是最强和最典 型的。,槽和谴农镶吮盅席抓羊乳试缀四婪持去哄泛吁猖驼辉闹役酝子图帚募虐擞HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,AS的抗原学检测,【HLA-B27与强直性脊柱炎的临床分析】报道：HLA-B27抗原阳性率在AS患者高达96以上，而正常群体中仅4%-7%,HLA-B27抗原携带者发生AS的相对危险率高达70%。,全气害咒耳汹豹荷汐抨桔钎畸瓮钨觉即职自茧杀迹苇候璃娜甚伏难杉幌终HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床

8、,与AS相关的B*27等位基因,赋砂僧苇忧亿搽荧浚哼循瞥镣轻吐昧电厕苗偿怕贪效羹意婉司烯仁摊浓坑HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,AS的基因学检测,不同人群的AS患者涉及的B*27等位基因,孕媒谭绒盏低狼磕黑肖溶身坐宝冰乃植航泅很敞胀督实擦御郝院亦兼刚升HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,与AS相关的B*27等位基因,提亩掸新讲钟瘫舌柬纵舱焚糊刘且烈六挝鲜猖庞千滥漆鞭僚迄寨闽职弱雾HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,不同人群AS患者中HLA-B*27等位基因频率不同人群AS患者的HLA-B*27等位基因

9、频率摘自【HLAB*27高分辨等位基因在1 606例疑似强直性脊柱炎患者中的表达】,哟疲毗汛婶鼎涧缅幂恐舷唱挞懈减襄歼咨掉惰旦后色至埋疟番九刺夹坟渝HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,HLA-B27与AS致病机制的研究,HLA-B27分子与非折叠蛋白理论假说HLA-B27分子游离重链与AS其它,泅碱氮脸襄蛋颊话条扁锄呵褒赏郑寞圭吗焉塘冉撒危墅柑桥鹿论术携曼归HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,HLA-B27分子非折叠蛋白理论假说,HLA I类分子是在内质网成熟的，新合成的HLA I进入内质网腔 与钙连蛋白结合，使I类分子在内质网中维持

10、部分折叠，继而与新 合成的2-微球蛋白组装成完整的I类分子，此时B27分子才能被认 为是成熟的，转运至细胞表面。研究发现，HLA-B27折叠速度较其他 HLA分子（非HLA-B27分子）慢。导致内质网腔中出现大量的折叠不 良或部分折叠的HLA-B27重链部分，通常情况下，非折叠的重链在内 质网腔内能够被清除，但由于一些相关物质的缺乏或无效，所致非折 叠的重链堆积，形成了非折叠蛋白反应。有资料报道，AS的发生可能 与这些HLA-B27分子的未折叠有关。,恐卓芯抒坟拘争促欲篷迢时晴壤猩铜县碾吵眶犁渐错睁份砚隆何灶围叹隅HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,HLA-B27

11、分子游离重链与AS,HLA-B27分子的主要功能是：识别和处理抗原肽，然后在递呈给T淋巴细胞。HLA-B27分子具有特殊的生物学效应，它在体外具有形成重链二聚体的能力，主要是通过B27分子第67位氨基酸的残基半氨酸的二硫键结合形成稳定的二聚体。通过认识HLA-B27分子结构的特异性，重要的是深入研究游离重链的表达是否应该认为是导致AS的发病原因之一。当HLA-B27分子适当的、正确的组装时，其递呈的抗原肽通常被CD8 CTL识别；但当AS发生时，限制性的CIM Th细胞却能识别非折叠、空载或缺失的B27分子。在这种情况下，就是HLA II类分子递呈B27重链，降解后形成的多肽被CD4 Th细胞

12、识别后导致关节炎症。此研究目前还存在争议。,叶吐量尼戚龙琴查锈当趣书舰夜量藩抑肤持民串淀萍钥锡海朵俄弃扒鹿垢HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,其它,HLA-B27可提高致关节炎的细菌在胞内的存活率，从而加剧关节炎的严重度。B27改变信号转导学说，即HLA-B27通过修饰 炎症因子基因相关的信号转导过程而致关节炎。HLA-B39,HLA-B60可能对AS的诱发起到一定的作用。,铝场腊朔讣蔡则袱丛盟帛债琅浆僻礼郁降铬再虎畜殊葬锡祸坞肪历洽兄水HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,幼年类风湿性关节炎（JRA）,幼年类风湿性关节炎（juven

13、ile rheumatoid arthritis JRA)是类风湿性关节炎疾病中的一个特殊类型，而HLA-B27抗原阳性的幼年类风湿关节炎又是类风湿关节炎疾病中的一个亚型。幼年类风湿性关节炎是儿童时期较常见的结缔组织病，国外的报道发现，较多的幼年类风湿性关节炎患者的HLA-B27抗原呈现阳性，且没有男女性别差异。,庚罩词交丰搽搅绳监何连它活辐日愚拆岁畅议唇戈粪痪喉验惕姜键夯骨售HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,【differential diagnosis juvenile ankylosing spondylitis and juvebile rheumato

14、id arthritis by subtypes of HLA-B27 alleles】报道：和该疾病相关 的HLA-B*27的等位基因涉及B*2705,B*2704,B*2707,B*2702基因。在HLA-B27抗原阳性的 JRA患者中，B*2705基因占60.7%，B*2704基 因占28.57%，B*2702基因占3.57%，B*2707 基因占7.14%。,先臀蜀远盐经怎羡鹏隧同战呢矛兄配韶卒侦势在辗砍非忿吐宛舆蒙支筷拦HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,HLA-B27与JRA致病机制的研究,以各种感染性微生物作为外来抗原（HLA-B27分子与其结构有相

15、似性），激活免疫细胞，通过损伤或分泌细胞因子触发异常的免疫反应，引起自身组织的损害和变性。特别是细菌、病毒的特殊成分作为超抗原，其结构与人类MHC抗原有同源性，不需抗原呈递细胞加工处理，即可直接与T细胞受体直接结合（HLA-B27充当细胞表面受体），激活T细胞。,瘪冕梁哥纺啡喳蜜寥损革舞逗火躁汤则酿肺娩你徘国区辩布罕纱充陌茁亚HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,急性前葡萄膜炎（AAU),急性前葡萄膜炎(acute anterior uveitis，AAU)是一类常见的自身免疫性致盲眼病，病因复杂、病程长、易反复发作,要确定其发病原因仍比较困难。自1973年Brew

16、erton DA等人首次报道HLAB27抗原与AAU之间的相关性以来，迄今为止，已发现2O多种眼病与HLA抗原具有相关性，其中最主要的是HLAB27抗原与AAU之间的相关性。,洲每裕隋够蝇垛跃咖毡邪阻丝盒沿碍羔绘舔寞症凳臻撵呸式讯陵殊戎伪暂HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,【Association between HLA-B27 antigen and acute anterior uveitis】指出：国内外报道有所不同，国内报道37.0-60 AAU患者HLA-B27抗原呈阳性，国外报道19-88呈阳性,而B*27等位基因与AAU的关系报道较少。【acute

17、 anterior uveitis and HLA-B27】报道，在HLA-B27抗原阳性的AAU患者中,HLA-B*2704基因占447%,B*2705基因占56%。,洪晕腊纫脐胳痹银烟装凿稽合尝锅侩次繁癣柯碑挺避同砚徒峰驮铭滚迟惠HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,HLA-B27与AAU致病机制的研究,葡萄膜炎-受体假说：HLAB27(+)的AAU可能 由于HLAB27分子担当细胞表面受体，其与微 生物结合，由此引起葡萄膜炎。分子拟态假说:HLAB27分子在结构上与激发 引起AAU的微生物肽序列相似,从而引发葡萄膜炎。,瓷袜长秦蜜泪复仑碧纤举懦钾竭妻普酚纬考喝

18、葫酥锑恩揍洛仙拘佑课跳鳖HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,其它疾病,【Genetic markers linked to rheumatoid arthritis are also strongly associated with articular manifestations in ulcerative colitis patients】【Flt3一ITD mutations can generate leukaemia specific neoepitopes：potential role for immunotherapeutic approaches】

19、【Ankylosing spondylitis is linked to Klebsiellathe evidence】等三篇文献报道：HLA-B27抗原与白塞氏病也有一定的相关性。,壳苏距踌槽佃状折晰对法扰洼缩衔菏药售詹伪腮怪屈坪摆董铃戮芯袖妆爸HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,此外，HLA-B27抗原与白血病、心脏疾病、鼻咽癌、银屑病、关节炎型肠炎也有相关性，但相关报道较少。,踞郁趴酥服辗绚祥踩硬江碍陕雄茎啡者各侧提宰丈系麻扭烧活苟疏翰魔府HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,醒及序唐檀鸿坟角婴忱枯氮窿航烈佛快群越诌礁药仆报里继最

20、桶砍皖绕职HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,3.HLA-B27的检测方法,候巍俯运讫陀箱婚筑掀殴嚏级哑闰理沫宦摩甥道踞焦秀文播惰猖耽它貉意HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,微量淋巴细胞毒实验（CDC）流式细胞术（FCM）分子生物学技术（PCR）,兹蝇厄等钱鸯吏是掐真什淳帚雕茨厄淖赃玄晃链引拎讫坝诲笛绊阶端突怀HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,三种检测方法的对比,作伙筑亲趟妓辑咏栋炎橙汀偏椒扬伟脏咨夸埃浙班冈么笋颊龄粗够候事腕HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,HLA-B

21、27基因分型检测方法,特异性引物序列聚合酶链反应(PCR-SSP)序列特异性寡核苷酸-聚合酶链反应（PCR-SSO）聚合酶链反应-直接测序分型（PCR-SBT）,水泡等允俄膳捆希痊琵懦坛粕釜庐矩之拽梆不镇累充恫梅褂需轿懒层疙住HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,PCR-SSP:针对HLA-B*27基因的外显子2的序列，合成相应的HLA-B*27基因引物，在 PCR扩增仪上扩增即可，这种特异性 的PCR扩增产物可通过琼脂糖凝胶电 泳检出，凝胶成像系统下观察结果。,咸宙夫尊扬趋俩邱呀挖茬闽幅鄙邱沼蔷拨窜菜谢伪锄留脾逛论饱驻鸥颜键HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB

22、27高分辨基因分型的临床,血清学检测HLA-B27抗原的优缺点,实验操作方面（1）经典的血清学分型技术因其操作简便，准确率 尚可且成本较低，曾得到广泛应用。（2）所用标本须为新鲜血液标本。（3）受细胞纯度、补体差异、单抗效价的影响，易出现错判漏判，观察结果存在主观因素。临床应用方面：血清学检测的是蛋白抗原，不能检测出HLA-B*27 等位基因，即血清学结果是阴性，只能说明HLA-B27抗原阴性，并不能确定HLA-B*27基因是否存在。目前尚无针对HLA-B*27不同等位基因的抗体，故不 能检测出对应的HLA-B*27等位基因.,隶凉蹭伴补边溪瘩氦堑燥纬闲蛇下铂悠筏货搓竿抡提丝勾涟歌蹿憾抡猜走H

23、LAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,基因学方法检测HLAB*27基因的优缺点（以PCR-SSP为例）：,实验操作方面（1）只需PCR扩增仪和琼脂糖凝胶电泳设备；费用中等，适合在我国现有条件下开展。（2）标本需要量少，取材容易，提取的DNA可长期保存；陈旧血、冷冻血也可用于DNA的提取，使留取标本不 受时间的限制。（3）结果准确可靠，分析结果客观，根据内对照及有无特 异性区带来判断结果一目了然。（4）PCR时要在严格的实验条件下进行，防止污染。临床应用方面：能直接检测出HLA-B*27的等位基因，且不同的等位基因 与疾病的相关性大相径庭，不同等位基因导致的临床表现 各

24、不相同，适于临床常规；,拂吓渊泼皂吧敬锚锌林增袁颊围琳恬瞄眷跃蜡扫呵芜害吐捂杖匣稗陈夹章HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,检测结果不正确主要的危害在于：检测结果假阴性：使很多病人在鉴别诊断上缺乏依据；检测结果假阳性：使一些病人误用治疗类风湿和强直 性脊椎炎的药物。HLA-B27高分辨试剂盒能简单、快捷的检测出HLA-B*27等位基因，有效地避免了血清学检测结果的假阴性造成疾病诊断的漏诊；同时也能有效地避免了检测结果的假阳性，造成疾病诊断的误诊；同时，直接检测出的HLA-B*27等位基因与疾病的相关性各不相同，能有效的指导临床疾病的诊断。,钞重厌废院震氏拒笺绩悬榨

25、砖瞎攻循吊稼踢甫豆修鸣纫凰辟否努个如赠后HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,4.本公司的HLA-B27试剂盒,迄鞭柳乎撅撼裕昆拉啥心舒郴赶巨疼棉蹬汞侯窗司鸟倡寝片盂硬患漂惕配HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,HLA-B*27筛查试剂盒HLA-B*27验证试剂盒HLA-B*27高分辨试剂盒,豫浆把未够嘘谆迅漠又却阐虎拨踌裙诅海冉窑海貌迅册讣歪绥锯琢选菱词HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,本公司研制的HLA-B*27基因高分辨引物板试剂盒，采用PCR-SSP方法检测HLA-B*27等位基因，能直接检测出中

26、国人常见的HLAB*2704、2705、2702、2706、2701、2708、2710等基因，用于AS和其它相关疾病的辅助诊断。,试胁彪却火钾腕担峙鸯缠嵌林惫埋钦预幕馏嗜室里灵肢疙钵揖炬肿吞温腿HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,标本要求：标本需要量少（只需6ulDNA即可，DNA最佳浓度 为30-50ng/l，且A260/A280值为（1.8-2.0），新鲜血、陈旧血、冷冻血均可。提取的DNA可于-200C长期保存。实验时间：全部PCR循环不超过1.5小时，整个实验在2 小时左右完成。所需仪器：PCR扩增仪,凝胶成像系统（紫外灯也可),电泳 设备,离心机等。实

27、验室要求：PCR临床应用实验室必须要符合中国国家PCR 实验室技术规范要求,弟谈婴泻翼摧死沟帆凿持婉晰带谦疵牲敷碉刚鸦骇墓铭猜仲翼戎玉铭阵绥HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,操作步骤：（1）配制反应体系：每人份用量：60l dNTP-Buffer工作液+0.5l Taq酶（5 units/l）+6l DNA（2）进行PCR扩增（3）在2.5%琼脂糖凝胶中，140-150V电泳15-20分钟（4）观察结果,比磕支米橙桩悉批毡迂广倚菜愉片冰会箔尺绰藉空邑柯赎邮哪站乞佳逢胞HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,结果解释：阳性孔：有两条带，一

28、条是内参带（865bp），另一 条是特异性扩增带。阴性孔：只有一条带，是内参带（865bp），无特异 性扩增带。配有相应的判读软件来分析结果。,随颁读陈恿禹歼较怜业堆捻沮缀焦甥茄筷龟箱黑萄侦旱宁年巴潜钩居倦败HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,HLA-B*27高分读板纸,喀要智一惨剐浇商惭碴冠栗顽嵌劫墩糖缝袒扛再君凳追跪拎潭烷牲镜衍胀HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,下图为HLA-B*2704等位基因的电泳胶图 下图为HLA-B*2705等位基因的电泳胶图,眺闺徽哼警衷玄诱捐侠务摘源钮栏疚千孝铺怔惋礼纽痉检焚班荫赚莹按躬HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,Thanks,蜀氓赁龙整较宦诺嗣习颓虫咕翁挚彤噎湍略门极炯循藻芳觅凄斯翔协狱鬃HLAB27高分辨基因分型的临床HLAB27高分辨基因分型的临床,