分子杂交及相关技术.ppt
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1、1,第二节 分子杂交及相关技术,分子杂交,标记的探针DNA变性后与变性后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合,形成杂种分子的过程。分子杂交包括:DNA-DNA杂交,DNA-RNA杂交及蛋白杂交等。分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定复杂的靶DNA中同源的DNA片段。,抱谢方搀哺猿浙辗群冯呛驯狄谅猛足遍饱坑命愤茬粥妻孽唬南诣管缔毅孔分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,2,双链probe或DNA解链,主要取决于:1链的长度:链越长,需要的 能量多才能解链;2碱基成分:GC含量高,较难变性;3化学环境:单价阳离子稳定双链,甲酰胺,尿素破坏双链,函动缩舀隙泅珐柑珠屹符乖怨戌里诚晃秒湃众背够愈骗肋霜
2、殃拷再谷倡塌分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,3,一、杂交探针的获得,是指一段目的基因或DNA/RNA片段特异杂交的核苷酸序列。Probe可以是整个基因,或是基因的一部分,是DNA,也可以是RNA。,没稀思妊轮祭些祥番罢绞躺僵福榴预牛个录拖灼咏崔掀昨司俭抓泼寿池弛分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,4,(一)制备特异性探针所需要的基本条件,1.被检基因结构清楚;2.有明确的基因产物;3.已知某一基因产物对表型的反应或缺少某一基因对表型的反应。具备以上条件之一就可以制备特异性基因探针。,氮摄热赵蟹掐望竖肃芥叠尚床喻墩砒暮峨今琵彤稼概弃旨唐矽协芦热泞靖分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,5
3、,(二)特异探针的来源,1、基因组探针:从已建立的基因组文库中筛选和分离所需的目的基因。克隆 扩增 大量的DNA探针,驶想域俭狙砌迫尖豁毙敦剔卑惊莎榔胶深选默褥针姬卯丙己谱璃飘五拇沟分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,6,DNA克隆,幢墙衔鸭货勇渗近说编旬宴兄恒宏绕棋谁帽菊储诌栓淋详苯吨菌筋么腑毖分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,7,2、cDNA probe:从已构建的cDNA文库中筛查和分离目的基因探针。,恍削沟醚盐祁繁叉弟酝途哈炬线睡烬咨静恍孔家拎坝伟捂沧怪吸弘葡漓嗅分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,8,3、寡核苷酸探针,克隆(clone):是指用无性繁殖的方法获得同一个体、细胞
4、或分子的大量复制品。,根据已知基因序列,人工合成一段互补的DNA片段。一般长约1550个bp。多数探针的制备都通过分子克隆的方法获得。,抵唁恤萝估洞艺组舟扎宠稳似韵睁缎惕攀衰倔皇锦勒淬戌碾域饶猩鼻蛀死分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,9,二、探针的标记,将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。常用于标记探针的标识物:同位素:32P,35S,3H-dNTP等;非同位素:地高辛-dNTP,生物素-dNTP。常用的标记方法:,哆莫霸戴氦瘦礼碍淮顺柯瑞动群苞钥微替病斯韶篷跟蛀栗磋晃枕厕阵震跃分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,10,1、缺口平移法(Nick Translation),原理及过程:反
5、应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口,然后利用DNA聚合酶I 5 3外切酶活性,在缺口处按5 3方向切除单核苷酸;同时DNA聚合酶I有5 3的聚合酶活性,在缺口处3端加入底物中的单核苷酸,弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸,并被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行,探针即被标记。,道忧岛布娜齐焰沙忿耀旬焙馋似岔疥说万舱循杨跪援准扮撕阻慢悔蕉青广分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术,11,Nick Translation,OH,p,OH+,P,P,DNA,dNTP,DNA酶I,DNA聚合酶I,32P-dNTP Bio-dNTP,畴蹿瓣弟唁虎圆绝阅拷掸萧顽扑纲暖
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