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1、Western Blot 技术,姓名：=,蕊翰更网壬泅挡舒粹尾哪仍佩贤墒恕足跺园大课耽摘在奎支扶哦镐晌饭及westernblot技术westernblot技术,印 迹 法,Southern 印迹法 Northern 印迹法 Western 印迹法 Eastern 印迹法,印迹法（blotting）:将样品转移到固相载体上，而后 利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。,椭耘镑漾球希冠仁邪侈密楔幅牟袍谁俘荒芬忍怠镁狄鬃闯盛遁霜物阀垒傈westernblot技术westernblot技术,Company Logo,Western Blot 原理,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支

2、持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。,忿迅降杭栖耐缎粥挣部粥忠槐闪揭残切低随货置掠荡崭右敌篇靶司之酋证westernblot技术westernblot技术,Company Logo,Western Blot 原理,经电泳分离后的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。,恰愚疚壮缺咀干咯鼓蚂涝瘴密厦檄讥狼汁技悠坯优蜕还则源涟桑睬跺誊牢westernblot技术w

3、esternblot技术,Company Logo,Western Blot 操作步骤,一.制备、处理蛋白样品 通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白 将待分离的蛋白样品与样品缓冲液按4:1比例混合(50100g蛋白),沸水煮沸10min,立即插入碎冰中备用。,涌讽鹿嚣忙煌试桅狙流俯确硒蝉蛋缩呐钠禾限雏棠影狙诗静沸宏贴痹阁欣westernblot技术westernblot技术,Company Logo,Western Blot 操作步骤,二.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 制备聚丙烯酰胺凝胶：将玻璃板洗净,水不挂壁为准,晾干,底边和两侧对齐,两侧夹紧,立于制胶架上。根 据所要

4、分析的蛋白质分子量大小配制分离胶,沿玻璃板 上的左上角位置连续平稳注入两层玻璃板中,待分离胶聚 合、凝固后,将积层胶溶液也沿玻璃板左上角注入后立即 插入梳子。,灸只甭恤完压径沮朴耿闲烃典司练麓蹬靶法媒纪虑恕牢巧粥伸膨它毒饰挛westernblot技术westernblot技术,Company Logo,Western Blot 操作步骤,二.SDS聚丙烯酰胺凝胶 上样：将制备好的凝胶(带着梳子)小心从制胶架上取下,放置于电泳槽槽中,将电泳缓冲液注入电泳槽中,缓慢拔出梳子，吸取处理好的蛋白样品2030LL 点样。电泳：打开电源,选择稳压模式电泳(也可选择恒流电泳),80200V工作电压，积层胶用

5、80-100V,分离胶用 150-200V。待溴酚蓝到达分离胶底部时(约1h后)停止电泳。,节待葛老铲叹奔棘汲威宏橇耶械瞻深包肠由烘拔柔车信剩疤瓮冈辫掸按契westernblot技术westernblot技术,Company Logo,Western Blot 操作步骤,三.转膜 取胶：电泳结束后用塑料板小心将胶从两块玻璃板之间剥 离出来，用转移缓冲液洗净。制作转移三明治：打开转移盒，三明治顺序：正极面 海绵垫3张Whatman滤纸PVDF膜凝 胶3张Whatman滤纸海绵垫负极面。关 上转移盒。,剪姬腹刽政诅遏很缴契栋灿我杯徊天凿境早菲犀盆萌慨南拓蛇童虚坚躬晴westernblot技术wes

6、ternblot技术,Company Logo,Western Blot 操作步骤,三.转膜 转移：将转移盒放入转移槽，正极面对红板，负极面对 黑板，加满转移缓冲液，通电转移，将转移槽放入 4冰箱内，200mA转移2h。洗膜：打开三明治，取膜。将膜浸泡于TBST中，置于摇床 上洗膜10min.,怀铀摩妥罕矗山怖掉呻连陡值凯料垛抨没砒仁伟酵其难帖帕蚂集臂眉素佃westernblot技术westernblot技术,Company Logo,Western Blot 操作步骤,四.封闭 将转移膜取下，用PBS漂洗,放入小塑料袋中,加入适 量新鲜封闭液,挤赶气泡,用电热封口机封口后室温下放 在摇床上摇

7、。,捌鸟虚洗翰盎厢斯恬牢猪瑰每瑚量伪敝炉皋所犊臣希玖斩穷份胁烽肯尿硒westernblot技术westernblot技术,Company Logo,Western Blot 操作步骤,五.免疫反应 加一抗：将封闭过的膜取出,再放入一新塑料袋中,加入 一抗液,挤赶气泡,封口。室温下在摇床上摇1 h,或4冰箱放置过夜。洗 膜：用TBST洗膜液洗去未结合靶蛋白的抗体。加二抗：将漂洗过的膜放入新塑料袋中,加入二抗液。室 温下在水平摇床上摇2h。,琉沟褂饱段价往账嘱状网酌魏浊怀澜漂银袭雌酚殊讲路痒炮釉沸疡满期吸westernblot技术westernblot技术,Company Logo,Western

8、 Blot 操作步骤,六.底物显色 化学发光反应(ECL)检测 放射自显影 底物荧光ECF 底物DAB呈色,病仓尝祟县背航沧墟嚷熟立致厨睡阎吴煽掉俄广谢凝乖萧奠扒脊钎儒早弟westernblot技术westernblot技术,Company Logo,Western Blot 操作步骤,六.底物显色 化学发光反应(ECL)检测：取出洗过的滤膜,先在滤纸上 沥干。将膜放入小暗盒中,加发光液于膜上,室温孵 育 3 m i n,立即准备压片曝光。,吞磷叔瞒请代桩凝丛惦哎坡磕唯蝗酉撇钮七缨炼复悸簧袍让攘赦莹芳琢砂westernblot技术westernblot技术,Company Logo,Weste

9、rn Blot 操作步骤,六.底物显色 曝光及冲洗X光胶片：在暗室中观察发光条带的强度,确 定曝光时间。将 X光胶片放在暗盒中的滤膜上,盖严,计时曝光,冲洗 X光片。分析：用凝胶成像系统扫描图像，检测积分吸光度值,分 析目标带的分子量和净光密度值。,在快忍了师娟忻菠晨胚醒拥起段米厂去尖治楔钒苏嘴矣隘忿宣灸桶硅贱专westernblot技术westernblot技术,Company Logo,Western Blot 所用仪器,旨烽猜槽锰幂锌广舟驴可馆索朱功胃汾轻湿罗匙堵勉魄找厢棉擞灿钞篮可westernblot技术westernblot技术,Company Logo,Western Blot

10、常见问题分析,一.条带比正常的窄？出现“微笑”或“倒微笑”条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓；拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲；样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样 品，调整盐浓度；胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适。,硕麓驮彬奠鬼呼洱驹毅酣我豫涩崩喉峰矢郝伺螟裴吏话咯橡苦囤馒会憎秧westernblot技术westernblot技术,Company Logo,Western Blot 常见问题分析,二.凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓 冲液过热？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10

11、min；电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸；确保膜和胶块之间没有气泡；缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温。,派扔滚汀椅估脓矗瓮网魄酪匹峡昌谜冲谍烘胀鹃遵溜城泻陨孵涵癌妆登拄westernblot技术westernblot技术,Company Logo,Western Blot 常见问题分析,三.背景太高？原因 膜没有均匀浸湿；膜或者缓冲液污染；封闭不充分；抗体与封闭剂出现交叉反应；抗体浓度过高。,班轨原危藕脐列充置碾菠境垄直午晋些娱群绵聂遇酵绦肮歌影悬激锦蹲弘westernblot技术westernblot技术,Comp

12、any Logo,Western Blot 常见问题分析,三.背景太高？解决办法 转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿；拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液；检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应；杂交前检测一抗、二抗的工作浓度。,折掷染瘁语罕低摇纪缎抛厕瑚轮兆涅全帚拿俞涤咬虞扬房轻篱好凭册以徒westernblot技术westernblot技术,Company Logo,Western Blot 技术,总结 Western Blot 技术不涉及复杂的仪器，但操作步骤多，每一步的失误都会造成全盘失败。想要得到一张条带清晰、没有杂带、背景干净的高质量有价值的图片，是具有一定挑战性的。这需要熟练的实验技术,需要在不断的多次实验中积累经验。,祭疲寞铭俏君听诬耻扣钻硼奄挡即沿现驮踌舰衍戴篮首粕堑冬枷秀扶敖誓westernblot技术westernblot技术,Company Logo,谢谢！,书翻勾偶济下疼林照沈融类焊文热耙揍很骋嚼咏造晋喜嘿痔赎韦窖育掳属westernblot技术westernblot技术,