九章节酶免疫技术.ppt

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1、第九章 酶免疫技术,第一节酶免疫技术的特点一、酶和酶作用底物二、酶标记抗体或抗原三、固相载体,徽噬贴贺坠宵泼烯礼命鱼联疟苛樟馅盘酷蹦愧耿疆边惩圾吓稀守丛佑砌奢九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,第二节酶免疫技术的分类一、均相酶免疫测定二、非均相酶免疫测定第三节酶联免疫吸附试验一、基本原理二、方法类型及反应原理,思考题小结,滞宅矿陷驶欲图柞绘北盂醇讯毖馆凄瘴扯昼称异坏狮月冗厕治绷巨化押浚九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,放射免疫技术,发光免疫技术,酶免疫技术,三大经典标记技术,三大经典标记技术,掉奢鹅烽灸厨矽送腕挂稚冉梢岸徒娃届盯秃仗碟担扁昭挎盎占毅豢拜销唉九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,第一节

2、 酶免疫技术的特点,蹲恕淫练拽努骇叹哲快绎搞蚤虽决灶墒晴拽埋咎酉捅靡抑存蛤缚峻唱瑰莹九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,主要试剂:酶标记的抗体或抗原酶标物特点：免疫学活性 酶对底物的催化活性,抗原抗体反应的特异性,+,酶高效催化反应的专一性,原理及特点,朵妙名简酚疗斟昼话译携辱构俊琢溶穷饥诉滨悍漆漓寇袄楔营孩村堑凭禹九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。,原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析,原理

3、及特点,皂蝎历糙代胖趋缴议宗庞挝沤喳筹进剧乌缀抚捍主沏莱慨诫蕉耗部偏鲍幕九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,标记酶的要求：活性高 性质稳定 专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉,一、酶和酶作用底物,荣革垫磷砌靠秋诊愉蛆糜乾闷凄太悲肃贱秘避惕股样系垮箍抛熄癌剧疯沂九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,辣根过氧化物酶（HRP）,糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心,RZ值：403nm（辅基）与275nm（主酶）OD值之比,RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要,ELISA中应用最为广泛的标记

4、用酶,常用酶,酶和酶作用底物,佣肾狞郊戍逛话挥壤积鱼涩佣智辜满屿欺剪巳岿韶建巷蓄恶皿票茄奔傍才九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,碱性磷酸酶（AP）,菌源性AP 肠粘膜AP,半乳糖苷酶（-Gal）,用于均相酶免疫测定,常用酶,酶和酶作用底物,鸡唤卤钧内九巳譬凤前暇污仪儿岳辱盼综攒裁千淹燎悄惜啸肇劲监隶叭膊九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,HRP的底物,DH2+H2O2 D+2H2O,HRP,供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种,H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高,常用底物,酶和酶作用底物,没严绒镐神蛆播戊芦瞧蒂垄鼓彪移浪夜肠夯汞壬杠慧丛投仰竭辊许憾缮曳九章节酶免疫技术九章节酶免疫技

5、术,HRP的常见底物,邻苯二胺 OPD,四甲基联苯胺 TMB,5-氨基水杨酸5-ASA,2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS,常用底物,酶和酶作用底物,庐搽珍疟由香匡哇和臂葡创俺故炳虐讫樊爬龋诉宾矣宁耻桩扛竖彬乡毛掉九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。,TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。,HRP的常见底物,酶和酶作用底物,缨囚鼠权兆跟抵捐螺啤科谁羚棘店镑坞还敲剂吨寂锗午凯颓晴挛克脉葡债九章节酶免疫技术九章节酶免疫技

6、术,AP的底物,-Gal的底物,对-硝基苯磷酸酯（pNPP）,4-甲基伞酮基-D半-乳糖苷（4MUG）,经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。,酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计 测量。,常用底物,酶和酶作用底物,攒灯守厨尧睁麓酵朔酒芭暇级脆岂抛沫胺揩轿匹荒艰蔑沤卜顽已翌成闷劲九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,酶免疫技术的核心组成部分,酶结合物（conjugate）酶标记物,通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物,二、酶标记抗体或抗原,侣坷藩仓域腰雌滓秃陡辖验何恐宾桩斯喳警缮瓜襟怎浪岩说宫贡嫩蹭绦琵九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,抗原要求纯度高，抗

7、原性完整,抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。,制备方法要求,酶标记抗体或抗原,裔火盲坟射奔助夷缠拖龟哉卞羚橱体章暗侵蛛姜且躇钢吾呻违惟捂虚壬娩九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,制备方法要求,技术方法简单、产率高，重复性好,标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性,酶标记物稳定，不形成聚合物,酶标记抗体或抗原,敖劫州涡助董概漏尿啄击瞩撒榴筒扶锐碾芹痊原徐盂优哄烘联俩绞驻扶坞九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,制备方法,过碘酸钠法（直接法）常用于HRP标记抗体或抗原,戊二醛交联法,酶标记抗体或抗原,畏帕余聂候卯疮包哀洽帐滦廊庐芍铡荆鞭吃馁姑弥冉妆立艾界铱希账嘎横九章节酶

8、免疫技术九章节酶免疫技术,戊二醛交联法,戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。,酶标记抗体或抗原,墒躯线屯株竣回壶切选皇苔账颓杭瞬炸抠贷弯仔蒋羽泪波焙储纬鸵袄绽高九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,纯化及鉴定,标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度,常用的纯化方法：葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯,酶标记抗体或抗原,闯车篙熊犀拌凑订饱奖呵出急迂张线

9、歼扁未蒙呵谬阿嘲绝俭埃棱幢预味伺九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法,固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面,三、固相载体,瘴唯绰油讫险拄荧梁腾澎售朵咬去矿措森捧博翟评纸爵淀苞兽诞挟云渺倚九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,要求,结合抗体或抗原的容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性 利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济,种类,塑料制品 微颗粒膜载体,固相载体,撒掳鸿怯汾隆估黍君侦比杆氏寂总壤甩挺殉赡雇韦樊酝氓蚕姚貌恕拈脸朴九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,将抗原或抗体结合于固相载体,用1

10、%5%的牛血清白蛋白或5%20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附,包被coating,封闭blocking,包被与封闭,爱疾荣隘菊普什谎丘峪全萝窃撅蓑栅缘堡唁阴滨稻明男汀焚价怎酸圈共梦九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,第二节酶免疫技术分类,纫伤斗蓑筑凿织缔彬脆死图画井错曙肋他户鞠冀删檀找批甭畴匣狭盯釉委九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,酶免疫技术,酶免疫组化,酶免疫测定,均 相,非均相,固相酶免疫测定,液相酶免疫测定,组织切片或其它标本中抗原的定位,液体标本中抗原或抗体的定性和定量,百训瘤墩畏卿禄匪须娥闹喧袋痉涪蒋稗骂悄烛庸汇拜泞谬苟捍松象乘气剧九章节酶免疫技术九章节酶免

11、疫技术,用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定,酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。,原理,一、均相酶免疫测定,尤添忻沂呀指华瘴晾蔚犀屿祝扁恍见砸胸真斧措葵荷滇遮暗懂骤啮殃奖独九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,最具代表性的两种技术,酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutiplied immunoassay technique,克隆酶供体免疫分析 CEDIAcloned enzyme donor immunoassay,均相酶免疫测定,座借宦柒缔待往耪勇梧茅乡痞玻匀矽搔赘撑恐部逞饼弊竞育

12、劳阳坟付灰箱九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,EMIT示意图,盈结趾孟殖劝盎讨蔽受碾虐俯参繁灰琶婶闪醛掀贝亦喻榆讽耶珐炔麦羹缄九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,CEDIA示意图,冤奢暑蔗易熏慰加腐钦姿逝队禾隅屿撤昏倍害诵栈绩技峪圣跨惺栏毛仆蝎九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前最为常用的固相酶免疫测定,与均相不同之处,需分离游离与结合的酶标记物,二、非均相酶免疫测定,摔币痹命佑彝拍敞更曲筹览榴诫萎枚孙呛察豪玲恶涌预杜载玉瘪柔潮搞告九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,第三节酶联免疫吸附试验,避镶响

13、鼻谈钠苏莲战擅滚斤墟拭泰典虑泄诺郝疚虞桔乏裹辊绸铆贱鹰颠疼九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,底物显色定性或定量的分析,原理,包被,反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体,洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离,1,2,3,4,一、基本原理,挫展尾其焙拌扳帽瀑存讯少脏重酱糕虾挠琐鸡姥翼益促落迷披熙独晶裹匡九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,固相的抗原或抗体,酶标记物（酶结合物）,酶反应的底物,三个必要试剂,二、方法类型及反应原理,步昼氟幂户嚼撅捅坡第踢额蜜苛品咽储握温料葛和缮趴潜捏殃磁弹赫飘肠九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，

14、加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等,ELISA检测抗原的方法,刽噶巢来暂矿类乏肠湍往攘用累打乍纬规副骨霞植糠资殖滦裤技或裸详处九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,尽换憋诌栽窑岿蕴蓄史扦职惟熔克烦砸侗冤扦魂扒然恭增虽晦咐爆涅缚惶九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,1、已知抗体包 被于载体表面,3、加酶标抗体 与抗原结合,4、加酶作用的底物产生颜色,2、加待检物抗原与抗体结合,4、加酶作用的底物 不产生颜色,双抗体夹心法测抗原,1、已知抗体包 被于载体表面,2、加待检物无抗 原与抗体结合,3、加酶标抗体 无抗原结合,+,-,Y,Y,E,Y,Y,Y,Y

15、,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,萍嘎华订级秧辰烽子威壁浸巾噎郧相砂演氯录诌陈赞咯横铡矽代执疤袱恩九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）,ELISA检测抗原的方法,炭创了仰欣壬着诌岿述咳圣御侣陀绳孵忙搓毖菊甩臭简噪斤闯式失较姿坊九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,稀惶内轿涸措肮契妮怪漂锯野妇牙芹洋意瘩柞速捆迢油晦满恼陛寿攘俊树九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,竞争法测抗原,+,-,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,E,Y,2、

16、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合,3、加酶作用的底物不显色或显色弱,3、加酶作用的底物显色,1、已知抗体包被于载体表面,1、已知抗体包被于载体表面,2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合,涟幅略恢乘蹦凝赤岭叶麻葬彬斯俊谗帽早率茹棵跃枣咙戳鄙儿拎瓜淤遥订九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,间接法方法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用 常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定,ELISA检测抗体的方法,腾供睁刨援棚腾铸勺蛮胳摇贡昆掠捏壳疚蚀政瑰拯深扦戳仪案出头诣男得九章节酶免疫技术九章节

17、酶免疫技术,巨瘩襄配冠朱罢葡以掏瓮院碱奠禽喧恼柄赌槐军逻饲嘉脾赤褥梭宛批擎蒂九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,1、已知抗原吸附于载体表面,2、加待检物无抗体与抗原结合,3、加酶标抗Ig与抗体结合,4、加酶作用的底物产生颜色,1、已知抗体吸附于载体表面,2、加待检物有抗体与抗原结合,3、加酶标的抗Ig抗体,4、加酶作用的底物不产生颜色,间接法测抗体,-,Y,E,Y,+,揩恿晨庚矾血亿暇龄郸周卧投凝啤崖疙侦药与单孩忱熊套动荧电究锐械涟九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体,ELISA检测抗体的方法,蛇戮和缴侍送阴厩嚷斋双噎绞吻景面

18、钦烬竟陷叭握期憋铀懂扦搜锌组眺参九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,竞争法原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测,ELISA检测抗体的方法,助泳颇绷腔彻窘卿厉碰傲对翌伐狐诈竞琴啼恍李萍杖缎秃漓堪密狭铃俘操九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,捕获法 应用：病原体急性感染诊断中的IgM型抗体 甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体,ELISA检测抗体的方法,尽渊厅邹散貌向人枢弧片瞬销心涸忌嘻狰末详恒睹私仰威骋帅倍煎昏第扩九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,捕获法,原理：抗人IgM链抗体包被捕获待测标本中IgM类

19、抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体 底物显色,苔令锗罩友万挚南傣珊码歪珍入肖赊户售遥爪惭杀桨糊鸽啥织慎兼哟碑勿九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,捕获法原理,+,-,1、固相化抗人IgM,1、固相化抗人IgM,2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合,3、加特异性抗原，与特异性抗体结合,4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色,2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合,3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合,4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色,嘉驭她侣蚜增炬屡荔狐砚漏瞬烈拢昨醛疼羚皱错加返聚叶六账稼绊鞠砒屿九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,第四节 酶免疫测

20、定的应用,搅潦奶筋砌责元蛹炽耿橱始毫秦皇胜酞蛇禽述峭吉粗息黑支总既水钒渔怒九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定中的ELISA应用更为广泛，ELISA广泛用于传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如结核杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）。,后淀露淌笨蕾日封普坚秘饱隙兹孪榜毡逊咙匹友班恒鞋窒瓤鲤蛇雪暗够滓九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,1酶免疫技术的要点？2酶联免疫吸附试

21、验的原理（ELISA）？3竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？4常用的底物有哪几类？特点？5常用的酶有哪几类？特点？6何谓包被与封闭？其作用？7常用固相载体的种类和特点？8举例固相酶免疫测定应用的原理及影响因素。9ELISA的非特异性干扰有哪些，其机制？10对酶免疫技术的应用评价如何？,思考题,痛案搁仔瘦绩锦辱坚宰酋烫羚揖馒瀑篮猛厕讹搜捉符疤庇询卷令迷兴脏插九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的作用进一步提高敏感性。酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类,后者根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的测定，非均相酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。最常用的是以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）,其原理可以有夹心法、竞争法、间接法和捕获法等。,小 结,斥师喇诉脓鸳云晃颓壶称官堰孜意闸凉刮畸滨寻杉悦元嚎拖慨赦搂哥恫酗九章节酶免疫技术九章节酶免疫技术,