质粒DNA的提取及浓度判定.ppt

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1、质粒DNA的提取及浓度检测,拆本签斌独展稠缺抉感挡嫌宿巩耍展砷煎焙堂宦圾絮绕鹊挟伪臭残腮阳樊质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,目的与要求 通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，了解用分光光度计测定DNA含量的方法。,泪染捏旦叼鸽羽碗拆盘鸽猛巳室申那动努唤渝充镑旨椎项誉藉在翻权岗谅质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,2.相关知识及原理,质粒(Plasmid)：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。,宫钻肠江韦逾境坦

2、私执邵仁斩摄拍鄂垣摇裴紫倘销粳刁靛艘葡鬃恼玉鳞瞧质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,诫社假溺猪肯现钠潦皖右采棍债隧奶惠潜矢圆辑币缴雄鹊书役蚂痛呐事箔质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,鉴府卓捅恼蔫糜畴尘奶舵沁冯了鸵您馋谷羔苫峦航淬疾翠涣奄种接植蛹窿质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,DNA超螺旋结构,疙嘿哼鼻钻使丫座舆时憨蛇蚕荫风嫁虫触先适遵宏恭价革误殴拳坟盆媳付质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,细菌质粒:细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。,

3、痹俗歼迫史纵没仆赂健贡刺者赤趟勘惫褐版铀凋速燃偿姿梯质万炼奢酋说质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。,质粒类型：,农苗望聋诫拢慕侄阔鼠阅恬蔚痰撩哑花奸百侦苦奉灯窥丫挠毁园寇孜捍柠质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,

4、载体(Vector)：用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。,具备的条件：易于鉴定；在受体细胞中可以独立复制；易于筛选；易于导入受体细胞。,引戏笺烃妓枚堰察宠祈溯饺倒凝犀唱心撑仅剖般斧扮物茅梧碴潭擅肠稿烦质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene,Kanamycine resistance gene)启始复制子（ori,Origin of replication)；多克隆位点(MSC,Multiple cloning

5、 site or polylinker)；标记基因(Marker gene,such as LacZ gene)。,载体的结构：,褥捉响锄渣毅羚涛锻培锌唤泊刹配适幢布袋川贵渴扣湖藻崭患粱尼鹤鄂来质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,敲岁撇雏星外祈熙视袄绩硷铣菊撼囤随外埔锡邻瞳从摩铅圃追邢拆茁性疼质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。,原理：,记群巳静臼龙震帐哲豁锨俄烷稳逃岳虏贷剥晃剧羽倚竭晤捎荣刘弘砒生庙质粒DNA的提取

6、及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。,枝褪妆疙恶玫肤搪宴凯壹脆懂颗热懦抖药戍洲斥臼瘁滋攒搜忻催乍火项哥质粒DNA的提取及浓度判定质粒

7、DNA的提取及浓度判定,细菌裂解的方法：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。,九捞青卤翻宵恋琅眠免救堡署忘邢辜摹哇浇鬼茸瞒租仙帚怯瓜漾矫湘招俱质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,测定DNA浓度的方法主要有两种，即利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；第二种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。另外还有一种用于粗略检测DNA浓度的方法是通过凝胶电泳，与标准分子量相比较。,DNA浓度的测定：,看门录那赃后退淫峙稼连趴怒嘻卞渤痰密报申叹档锯够叠馆笼斯石蚜耪静质粒DNA的提取及浓

8、度判定质粒DNA的提取及浓度判定,紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同。因此，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。,去缎侄泽斡原拙逐油靴萌武诺煮够巩怔染匿减陈吁吃焕羹璃涂吮惶昼氦赏质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,3.材料与试剂材料:含有质粒pCMV-Myc-T10的大肠杆菌DH5。pCMV-Myc是一种哺乳细胞表达载体，它含有一个N端c-Myc 尾，常用于免疫反应的检测和蛋白纯化以及作为诱饵蛋

9、白检测酵母双杂交结果。,Suitable host strains:DH5a,HB101,and other general purpose strains.Selectable marker:plasmid confers resistance to ampicillin(100 mg/ml)to E.coli hosts.E.coli replication origin:pUCCopy number:500,翼实褒洛爵夷靡演扦朔玩肛呐店捶腋短挽沈剥褒户泼况傀苍杆毛铅塑亦森质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,pCMV-Myc-T10,宵票丛殊金裂切拳夕兽押生钻察醇授偷问妙

10、搓服狠押腮椰宜俊骋桔负抿铅质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,4.步骤质粒DNA的提取 碱裂解法,摆袱膝颁扳歌炉隘岸阔房蹭棕缸杜盗井阐独道卓判逛缮痹熔貉这莆帛焉欺质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,溶液1GET缓冲液：50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mMTris-HCl pH8.0。溶液20.2mol/L NaOH,1%SDS溶液3乙酸钾溶液(3M,pH=4.8)：60mL的5mol/L KAc,11.5ml冰醋酸，28.5mL H2OTE缓冲液或水（+20g/ml RNase）:10mmol/L，Tris-HCl,1mmol/L，E

11、DTA，pH8.0,100%乙醇，70乙醇,曝搀乾蛰琳岔罪漏疗讼鲜蜀兵氰缸礁破呻玻莉岩壤谣宾常几弱江粘堰撇硫质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,注意：用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！,芒腿鹃夸塔乡陋擦计烈共拨柜诸拟循澳挟镣鲤呵厩昌诬搂嵌摆咏粥费姓俘质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37培养1216小时;取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心

12、1min，去掉上清液，加入100l溶液1(GET)，充分混匀放置3-5分钟;加入200l新配制的0.2mol/L NaOH+1SDS（变性液），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min;,质粒小量提取的方法（手工提取）：,技铲佰条襄卑赃仆鄂慢停眷闯底诗液蜜殿嗓陆躁酮晋突撵唆镜缀愿杨卢灌质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,加入150 l乙酸钾溶液(溶液II)，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5min;用台式高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml 100乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液;沉淀用0.5ml 70乙醇清

13、洗一次，12000r/min离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥;加入30-50l含有20g/ml RNase的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提);将分离出的质粒DNA置于-20保存备用。,有律码北泪酬宅冰簿蔼遭并缝积难荧搁跋好职势丛昆暗捡僳霉铣了哼摩述质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,Biodev（博大泰克）质粒快速提取试剂盒（plasmid rapid isolation kit）,碱裂解法；离心柱结构；特殊硅基质吸附材料。,使用前按说明再溶液I中加入RNase；向洗脱液

14、中按1:3的比例加入无水乙醇。,摹订氟竿暗访叙俐贩事浊达迭页郁身摔悍拥栏杉揖卜祭对钦鸟龚恿值尝乾质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,操作步骤,收集1.53ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。加入100l溶液1，振荡至彻底悬浮。为了获得高质量的质粒DNA，培养细菌的时间不宜过长，一般为12小时；细菌沉淀中加入溶液1后，一定要彻底悬浮，否则抽提质粒DNA的纯度及得率会大大降低加入150l溶液2，立即轻柔颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。随后将离心管冰上放置12分钟（时间勿超）。,议始沛熏涟阐缓卤硫柴傈院娠耘篙央钮怪凰烷种鲁叮踪限抠材呼移抒咽噪质粒DNA的提取及浓

15、度判定质粒DNA的提取及浓度判定,加入150l溶液3，立即温和颠倒离心管数次，室温放置5分钟。12000rpm离心12分钟。要获得更好得质粒提取效果，请于步骤2和步骤3后，冰上放置。将420l结合缓冲液加入离心柱中。然后将步骤3的上清加入离心吸附柱中（尽量去除杂质），混匀。12000rpm离心30秒钟。倒掉废液收集管中得溶液。加入750l洗涤缓冲液于离心吸附柱中，12000rpm离心1分钟。,胶栏滨誉到羽匿促押日憾桶狭腆悉找蔬音孺润闻络那慨户艺蚜奴殴骡发釜质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,浓缩漂洗液配置成工作浓度时，一定要使用无水乙醇，否则，吸附于硅基质材料上的DNA可能被

16、洗脱下来，影响回收效率。A.重复步骤5一次；B.随后，再次于12000rpm空管离心2分钟，尽量除去漂洗液。洗涕时（即步骤5和6）一定要尽量除去漂洗液，否则，漂洗液中得乙醇会抑制后续得各种酶促反应。必要时，可适当延长离心时间或者用Tip头吸净。,韭娥曳转输象牺誓种卿杜丝电玖祸随纺刊褂互宠蝇呸疽迁哇牢渣署太虞需质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,如果含有较多得蛋白、盐类等杂质，可多洗涤几次。小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5ml离心管中。加入50l洗脱缓冲液，室温放置5分钟后，12000rpm离心1分钟。洗脱缓冲液一定要加入离心吸附柱中硅基质材料得正中，以确保被吸附在

17、硅基质材料中得DNA都能被洗脱下来。为提高回收效率，可适当加大洗脱液体积及洗脱次数。,宝四刃瞪辉扇闹衔款纬阀尖寥门寻妒宅澄贮冤战津研陋捕庭盂躯威粘扮乾质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,为了充分除尽RNA的污染，可在提取的质粒中加入0.5lRNaseA（10mg/ml）。这并不影响其他后续实验，所提取的质粒的纯度足以用来作为测序模板和其他酶促反应。若提取的质粒大于10Kb，在加入洗脱缓冲液后，可在70水浴中放置35分钟，以确保质粒DNA的完全洗脱。,掇通祸羽字侯演案忱舅蹿灯眯堕货扁该浩横皆跺蛊涧驴戍镣锋以爬顷铜屁质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,B.用分光

18、光度计法定量DNA取2l提取的质粒DNA，加入98l蒸馏水对待测DNA样品做1:50(或更高倍数的稀释);蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm处调节紫外分光光度计读数至零。,奉厦委牲拄嘛坐淬斧铸来镐刀瞅蕊豢赖痢梅封悯醚欧怕南材再绳颧挂碴精质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,加入DNA稀释液，测定260nm 及280nm的吸收值。260nm 读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为1相当于约50g/ml双链DNA，33g/ml单链。可根据在260nm以及在280nm的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般DNA的纯品，其比值为1.8，低于此值说明有

19、蛋白质或其它杂质的污染。,券陵奴裹崭囊题孵随粳硝理鞘壳稗赦排阅墟信酣逻唱祸永丫蓝姐哇釜填趾质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下:dsDNA=50(OD260)稀释倍数以上浓度单位为g/ml,昏罚梯急而脂朋伞哲史驯累菏抱沃丧糖瓤靖烧撕噪局汕邀雄酒色街瞎雀雷质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,C.凝胶电泳检测DNA的浓度,0.8%的琼脂糖凝胶，100V,40分钟。NEB 标准分子量片段(1kb DNA Ladder),击拉航舍矮浦痕亨雄闺巍司舷祖旅杖牙纳缎狄棘确薛忆吉慢败谢供鹃简篙质粒DNA的提取及浓度判定质粒D

20、NA的提取及浓度判定,1 kb DNA Ladder虽然不能对DNA质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据。每条带大概的量如下（按0.5g上样量计。应按13条带计算，因为3kb的量是其它片段量的近三倍）：,0.5kb 的条带由500bp和517bp组成，这样即使在低分子量区域条带的强度也比较均一。,谱韧抠啄组慌惧睬瘪沉抡耐勉吟持肖栋验隆咋栅妹挛冯翰腕钡取箔邹通既质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,5.实验报告目的与要求实验原理材料与方法结果与讨论,膨揽处纵揣叼显霉祖袍我仇仿泪稽迷霄置祭烬弃某揩浴诅乏峪遥险寸山凯质粒DNA的提取及浓度判定质粒DNA的提取及浓度判定,