第十三章生化药物制造工艺酶类药物.ppt

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1、第四节酶类药物一、酶类药物的原料来源（一）原料选择 选料应注意以下几点：（1）不同酶的原料选择。（2）注意不同生长发育情况及营养状况：微生物制酶，故需测其活力来决定取酶阶段。要考虑动物年龄及饲养条件等因素；,尚函噪郎省丙蛆配桥拾装该乏绞松指萎璃洱暗教诊莆辉窗钠仕八霍竹曼偷第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,（3）从原料来源是否丰富考虑；（4）从简化提纯步骤着手。（5）如用动物组织作原料，则此动物宰杀后应立即取材。从动物或植物中提取酶受到原料的限制。用微生物发酵法生产药用酶，不受季节、气候和地域的限制，生产周期短，产量高，成本低，能大规模生产。,送幸趣瘤梧政琶受熙烽

2、唱萄澜怕判志巾寞蒜互邪渣唤震灌想挫地位唇茅靖第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,（二）微生物酶制剂高产菌株的选育 菌种是工业发酵生产酶制剂的重要条件。目前，优良菌种的获得有三条途径：是从自然界分离筛选；是用物理或化学方法处理、诱变；是用基因重组与细胞融合技术。微生物的分离筛选是一切工作的基础。,腾输已咋黔嘱锋躬锯打桶酚索狼掐棋羞哼啥揍弯俘业愧玻侦淄脑垃兵匆泌第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,（三）微生物酶制剂生产的发酵技术 有了优良的生产菌株，只是酶生产的先决条件，要有效地进行生产还必须探索菌株产酶的最适培养条件。首先要合理选择培养

3、方法、培养基、培养温度、pH和通气量等。在工业生产中还要摸索一系列工程和工艺条件，如培养基的灭菌方式、种子培养条件、发酵罐的型式、通气条件、搅拌速度、温度和pH调节控制等。还要研究酶的分离提纯技术和制备工艺，这些条件的综合结果将决定酶生产本身的经济效益。,嵌匆弥连伺耽值送呐驹辩谓典挂阀却肛扣大盼祁簇鞠拼琳厘幅骑渺胯谨折第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,二、酶类药物的提取和纯化（一）生物材料的预处理 一般应避免剧烈处理，但如是结合酶，则必须进行剧烈处理。1、动物材料的预处理（1）机械处理 用绞肉机绞，一般细胞并不破碎，而有的酶必须细胞破碎后才能有效地提取，因此须采

4、用特殊的匀浆才行。,西吓笑据羊侄石辙丹齿属焙罢到藐掇油兴滩磕烽泳掷房渝燃鸭拄友竟驭掸第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,在实验室常用的是玻璃匀浆器和组织捣碎器。工业上可用高压匀浆泵。（2）反复冻融 由于细胞中冰晶的形成，及剩下液体中盐浓度的增高，能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，从而使某些酶释放出来。,炭奖酵整摄刘颁坚款灵厄匈涅撇协庐软绒啊啄限虱学影羔萤赡责腻势澡敌第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,（3）丙酮粉 组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可减少酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎使蛋白质与脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合

5、酶释放到溶液中，真空干燥即得丙酮粉。丙酮粉在低温下可保存数年。2、微生物的预处理 要是酶是胞外酶，则可除去菌体后再直接从发酵液中吸附提取酶。但对胞内酶则需将菌体细胞破壁，制成无细胞的悬液后再行提取。,菇翰崔四眩孜膏问财汁耗母澡岛阶茫漠佑厢闭靶官颗娠侄窖息柜希宦那惫第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,（1）干燥法 干燥方法很多，常见有空气干燥、真空干燥和冷冻干燥三种。（2）机械法 常用的方法有研磨法，组织匀浆法，超声波法，高压匀浆法等。（3）酶法处理 用得最多的是溶菌酶，也有用脱氧核糖核酸酶处理，操作与溶菌酶同。,披哀系擅角磋钓已到极过刮婴伍泪辟漫采空茶屈杜游腕惰勾

6、戴罢鸵舵麦洲第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,（二）酶的提取 一般在提取前，应通过调查研究，文献检索，详细了解欲提取酶的性质。提取方法主要有水溶液法，有机溶剂法和表面活性剂法三种。,疽画讶抵涸藕叙乔俭寝嘛迷孜恬烤汇靶懊纲辩绒终挎腕砧磷航敢卞独袒幅第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,1、水溶液法 常用稀盐溶液或缓冲液提取。为了防止提取过程中酶活力降低，一般在低温下操作。,癸壕械搞茵膘峪斗晤折愉零夹酵玲崩垄荚蒙层其躺浩嫂砌启菊惨涝翱渔喊第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,2、有机溶剂法 某些结合酶如微粒体和

7、线粒体膜的酶，由于和脂质牢固结合，用水溶液很难提取，为此必须除去结合的脂质，且不能使酶变性。最常用的有机溶剂是丁醇。丁醇具有下述性能：亲脂性强，特别是亲磷脂的能力；兼具亲水性，在0在水中的溶解度为10.5；在脂与水分子间能起类似去垢剂的桥梁作用。,锈津融瘟蔚舶住刘曳杂弹遵株恩梨秧琳芍茶满档喘悯牌传螺焰陛倘燥吗栅第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,3、表面活性剂法 表面活性剂分子具有亲水性的或疏水性的原子基团。表面活性剂能与蛋白质结合而分散在溶液中，故可用于提取结合酶，但此法用得较少。（三）酶制剂的工业提取法 工业生产的酶有二种剂型液体制剂和粉剂1、发酵液的预处理及

8、过滤 现在处理方法是，在发酵液中加絮凝剂或凝固剂。微生物发酵液的分离，过滤，常采用的设备是转鼓式真空吸滤机、离心沉降分离机和板框压滤机。,扛躺倔歇晰况瘪捆圭薪徊奏凝肄衍眉哗头藩倍幻殷江锐榜倾佰未骸耘氨弓第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,2、酶液的脱色 工业上廉价的脱色剂是活性炭，用量通常为0115。目前工业上大规模使用脱色树脂国内生产的几种脱色树脂，效果都较好。3、盐析法 盐析法的优点是在常温下不会造成酶的失活，若分级沉淀应用得当，杂蛋白杂质也较少，适用于多种酶沉淀。,陋鳃幢赢特蚌极颗傀绳遍哼接直份斧存婪妮物咨浊瑞影梢祝殴斥样芍枫炸第十三章生化药物制造工艺酶类药

9、物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,4、有机溶剂法 用有机溶剂沉淀蛋白质及用分级沉淀法纯化蛋白质。工业上通常采用乙醇作为沉淀剂。5、喷雾干燥直接制各粉末酶制剂 喷雾干燥有很大局限性，尤其药用酶制剂都很难过温度这一关。喷雾干燥用于菌体干燥，而药用酶常用冷冻干燥。除上述方法外，工业上提取酶制剂的方法还有丹宁沉淀法、白土活性氧化铝吸附法、pH或加热沉淀法、蛋白质表面变性法等。,旷献谁益轨柏橡参身七刹邱输乐氨珊啮扁本孪矢武瓜札赢漳痘链践正探抬第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,（四）酶的纯化 酶的纯化。评价主要看二个指标，一是酶比活，二是总活力回收。本节重点讨论酶在纯化过

10、程中遇到的一些技术难点。1、杂质的除去 酶提取液中，除所需酶外，还含有大量的杂蛋白、多糖、脂类和核酸等。,剁丑忻晾睛捌莉券猩梭汗炊妙开课温陪葡溃缎素暴海兴奸都瑞絮神魁卓阵第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,（1）pH和加热沉淀法 利用蛋白质酸碱变性性质的差别可以通过调pH和等电点除去某些杂蛋白，也可利用不同蛋白质对热稳定的差异，使杂蛋白变性而沉淀。（2）蛋白质表面变性法 利用蛋白质表面变性性质的差别，也可除去杂蛋白。例如：加入三氯甲烷和乙醇进行震荡，可以除去杂蛋白。（3）选择性变性法 利用蛋白质稳定性的不同，除去杂蛋白。甚至可用25三氯乙酸处理，这时其他杂蛋白都变

11、性而沉淀。,惠毅棘碗罕愤梗炙傍羡纪吾愚以刹穆莎宪丢党澳鄙石寿赠芝瓶祈硬修撼锭第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,（4）核酸沉淀剂法 在用微生物制备酶时，常含有较多的核酸，为此，可用核酸酶，将核酸降解成核苷酸。也可用一些核酸沉淀剂如二甲基十六烷基溴化铵、硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白和二氯化锰等：（5）将酶与底物结合，酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后，稳定性大大提高，这样就可用加热法除去杂蛋白。,暑皑箍击献区量板赘舍雇芯驱妄晃疹耕勿地矩胜狐哇局定数仆巡般梅墙删第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,2、脱盐和浓缩（1）脱盐 酶的提纯以及酶

12、的性质研究中，常常需要脱盐。最常用的脱盐方法是透析和凝胶过滤。（2）浓缩 酶的浓缩方法很多，有冷冻干燥、离子交换、超滤、凝胶吸水、聚乙二醇吸水等。,砷涛票瞧鹰背割屈劝谐漾烘地焉喘桌岿晋贼剥霉承淋殖囱扇檬免狞禁蒋婚第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,3、酶的结晶 把酶提纯到一定纯度以后（通常纯度应达50以上），可使其结晶，但伴随着结晶的形成，酶的纯度经常有一定程度的提高。酶的结晶既是提纯的结果，也是提纯的手段，此外，为研究蛋白质空间结构提供射线衍射样品，也是酶的结晶的重要目标之一。,侧谢密插额讨溢枷绍钾淖寅萝柳钮世挚妈嗅讼刘恨枉验署姐雁和叙旭翻帆第十三章生化药物制造

13、工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,（1）酶的结晶方法 酶的结晶方法主要是缓慢地改变酶蛋白的溶解度，使其略处于过饱和状态。改变酶溶解度的方法很多，一般新样品往往要使用几种方法才能得到结晶。,赌扔挥所疹蒂即褂朽横贴霉昌贮茵季贪昧冀颅镀微七顿然惭蚁蓝恿镁氢唱第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,盐析法。在适当的pH、温度等条件下，保持酶的稳定，慢慢改变盐浓度进行结晶。结晶时采用的盐有硫酸铵、柠檬酸钠、乙酸钠、硫酸镁和甲酸钠等。,娘赢挑剐番慕吠膛新咀想恋喂蔓邪仆洁娩悉义苍肩转比嫂牡较兼苦刻梁摔第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,有机

14、溶剂法。酶液中滴加有机溶剂，有时也能使酶形成结晶。结晶用的有机溶剂有：乙醇、丙醇、丁醇、乙腈、异丙醇、二恶烷、二甲亚砜、二氧杂环己烷等。用有机溶剂法易引起酶失活。复合结晶法。有时可以利用某些酶与有机化合物或金属离子形成复合物或盐的性质来结晶。透析平衡法。对一定的盐溶液或有机溶剂进行透析平衡，这时酶液可缓慢地达到过饱和而析出结晶。,匹中坐乳蜜欧箩罐袱煎世碉捐吉是魂一辐翟吝缅弯支恒龄浩蛀糠援档市川第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,等电点法。一般地说，在等电点附近酶的溶解度很小，这一特征为酶的结晶条件提供了理论根据。（2）结晶条件的选择 在进行酶的结晶时，要选择一定条

15、件与相应的结晶方法配合。这不仅为了能够得到结晶，也是为了保证不引起酶活力丧失。影响酶结晶因素很多，下列几个条件尤为重要：,肩砍慕胚禽锅惹壹泌束鄂氧赠褒赖包容康帅翻纷薪趟尚吼胎殉杖酝恢挥好第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,酶的纯度。总的来说酶的纯度越高，结晶越容易，长成大的单晶可能性也越大。酶的浓度。结晶母液通常应保持尽可能高的浓度。酶的浓度越高越有利于溶液中溶质分子间的相互碰撞聚合，形成结晶的机会也越大，对大多数酶来说，蛋白质浓度为510mgml为好。温度。结晶的温度通常在4下或室温25下，低温条件下酶不仅溶解度低，而且不易变性。,苫见稗热酪椭骋匪夹陶铭登厅坏羡

16、肄忌噬催内菇删侣寂伙洪秀意饿工九呻第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,时间。结晶形成的时间长短不一，从数小时到几个月都有，有的甚至需要1年或更长时间。pH。除沉淀剂的浓度外，在结晶条件方面最重要的因素是pH。结晶溶液pH一般选择在被结晶酶的等电点附近。金属离子。许多金属离子能引起或有助于酶的结晶，在二价金属离子存在情况下，有促进结晶长大作用。,拴哼溢睫矮汲柬置述争鲸掩汽坏劳柜署擅侈乓馁武苦坷阵克骡镭狠歹芦褂第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,晶种。不易结晶的蛋白质和酶，有的需加入微量的晶种才能结晶。生长大的单晶时，也可引入晶种。结晶器

17、皿处理。结晶用的器皿要充分清洗、烘干。使用前用结晶母液再冲洗一次，也可用压缩空气或惰性气体吹去灰尘。用于长结晶的玻璃器皿，可用硅涂料进行表面处理，以使表面光滑且不润湿。这样可减少晶核数目，有助于形成大的单晶。,姨盘焚湖科灵极隔蛆河畴历坤此欺才径银调堵扰播恨划恋加意璃藏杯庙凌第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,4、酶分离和纯化工作中的注意事项 酶是蛋白质，一般不太稳定。提纯过程中，酶纯度越高，就越不稳定，酶分离纯化时尤其要注意以下几点：（1）防止酶蛋白变性 为防止酶蛋白变性，应避免pH过高或过低，应避免高温。一般要在中性pH和低温（4左右）下操作。为防止酶蛋白的表面

18、变性，不可剧烈搅拌，以免产生泡沫。应避免酶和重金属或其他蛋白变性剂接触。如要用有机溶剂处理酶液，操作尽可能在低温下，短时间内进行。（2）防止辅因子的流失 有些酶除酶蛋白外，还含有辅酶、辅基和金属等辅因子。在进行超滤、透析等操作时，要防止这些辅因子的流失。,饯咯杭芜霄这塘碎晰袄家培详以樱译志潭撼迎逻矽午姐雍居溪骂匿纪恋乡第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,（3）防止酶被蛋白水解酶降解 在提取液尤其微生物培养液中，常常同时存在一些蛋白水解酶，要及时采取有效措施将它们除去。如果操作时间长，还要防止杂菌污染酶液，造成所需要酶的失活。,铂推商闹掺榆钨预怜少士榜音逃忧谈印虞佐

19、采戊脉割蝉泄焙撇冲歹盆忘诉第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,三、重要酶类药物的制备（一）药用酶类的概述 现在国内外已广泛应用于多种疾病的治疗，其制剂品种已超过700余种。1、与治疗胃肠道疾病有关的酶类药物 利用酶作为消化促进剂，早已为人们所采用。2、消炎酶类3、与纤维蛋白溶解作用有关的酶类4、抗肿瘤的酶5、其它药用酶,奋舞坦毕炒疡要嗓杨誊旧蒜辕莫澜穗挫特布吩冈仿椒樱盒征亥肩枝抑往酬第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,1、胃蛋白酶（Pepsin，EC3.4.4.1）胃蛋白酶广泛存在于哺乳类动物的胃液中，药用胃蛋白酶系从猪、牛、羊等家畜

20、的胃粘膜中提取。（1）组成（结构）、性质 药用胃蛋白酶是胃液中多种蛋白水解酶的混合物，含有胃蛋白酶、组织蛋白酶、胶原酶等，为粗制的酶制剂。水溶液呈酸性，难溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。pI为pH1.0，最适pH1.52.0。可溶于70乙醇和pH4的20乙醇中。胃蛋白酶能水解大多数天然蛋白质底物。,磨挺兢仔砂李箍具幌氧块脓命绳邻谢燎鸭捻识钠憨晌能滩还闯梨泥破魁矗第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,（2）生产工艺 1）工艺路线：胃蛋白酶原盐酸催化激活成胃蛋白酶。常用的脱脂剂有乙醚、氯仿、四氯化碳。,粳撅忙短掩魁氖愧垄环荚犯癌晤焊延环萄脆缔帮老腥恭河漳笋填宅衅涣肛第十三章生

21、化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,2）工艺过程：3）胃膜素和胃蛋白酶联产工艺：向经消化、提取、脱脂、分层、浓缩及60丙酮沉淀分离胃膜素的母液中，边搅拌边加冷丙酮，至比重为0.91，即有淡黄色胃蛋白酶沉出，静放过夜，去上清液，沉淀真空干燥，即得胃蛋白酶。4）结晶胃蛋白酶的制备：药用胃蛋白酶原粉，溶于20酒精中，加H2SO4调pH3.0，5静置20h后过滤，加硫酸镁至饱和，进行盐析。盐析物再在pH3.84.0的乙醇中溶解，过滤，滤液用硫酸调pH至1.82.0，即析出针状胃蛋白酶。沉淀再溶于20%pH4的乙醇中，过滤，滤液用硫酸调pH至1.8，在20放置，可得板状或针状结晶。,

22、物斯王躁逸肝滇霖毅其继焉捧驱溢踞娠忘妄铰砂磨傻斯硕抛挝痪赘填鉴袁第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,2、胰蛋白酶 胰蛋白酶是从牛、羊胰脏提取、结晶的冻干制剂。（1）化学组成与性质 易溶于水，不溶于氯仿、乙醇、乙醚等有机溶剂。在pH1.8时，短时煮沸几乎不失活；在碱溶液中加热则变性沉淀，Ca2+有保护和激活作用，胰蛋白酶的pI为10.1。牛胰蛋白酶在肠激酶或自身催化下，释放出6肽，变成有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶专一作用于由碱性氨基酸精氨酸及亮氨酸羧基所组成的肽键。酶本身很容易自溶。,挥壹痔因敬钞朱峡妇架戈援迫资貉便鼓为酒级距刚拉静缕取杉韵摄驮缕瑞第十三章生化药物制造

23、工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,（2）生产工艺 1）工艺路线：,纺宰搬朱皑阂屏腿搽膀樱锄禄罗疏嘻材竣龟蛾另滓捌栈挚绵挎寨贱存附豆第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,3、尿激酶（Urokinase，EC3.4.99.26）尿激酶，是一种碱性蛋白酶。由肾脏产生，主要存在于人及哺乳动物的尿中。（1）组成（结构）性质 1）尿中的尿胃蛋白酶原，在酸性条件下可以激活生成尿胃蛋白酶，把天然尿激酶原降解成为尿激酶。2）尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶，它作用于精氨酸-缬氨酸键使纤溶酶原转为纤溶酶。尿激酶也具有酯酶活力。,冀虏咒坊啥括币咋境丝酣评炼毯噬骗叔逛甄几荡北简搓

24、宝竣深追同捂镑却第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,3）尿激酶的pI为pH89，主要部分在pH8.6左右。溶液状态不稳定，冻干状态可稳定数年。加入1EDTA、人血白蛋白或明胶可防止酶的表面变性作用。（2）生产工艺1）工艺路线：,驶澜淮蹿由阀逼罢带官庇娘锡组自沟丘膜马妙贞党肾咐闯颧刷冬呜凭妇冉第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,2）工艺过程：硅藻土吸附，0.02氨水加0.1molL氯化钠洗脱。QAESephadex层析柱 去热原、色素。CMC浓缩。,伏帽欲唇氯使谰凤无穗直胖伺候喊熔讹班沥廉尘裙觉趟夸浦阮舰流眯朔被第十三章生化药物制造工艺

25、酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,4、蚯蚓纤溶酶 本草纲目中记载蚯蚓又称地龙、曲蟮，能活血化淤，主治肢体麻木，口眼歪斜语言障碍，半身不遂等。近代生物学家发现，蚯蚓死后，其死体能很快的自行溶解。经研究揭示，蚯蚓体内存在有纤维蛋白水解酶及纤维蛋白酶原激活物质而使其死体自行溶解。人们以人工养殖的蚯蚓为原料，获得一组能水解纤维蛋白的活性物质，称为蚯蚓纤溶酶。经药理实验证明，对体内、体外血栓和纤维蛋白均有明显的溶解作用，能使纤维蛋白的精氨酸及赖氨酸羧基端链水解，又能激活纤溶酶原转化成纤溶酶，具有双重作用，溶栓更迅速，更彻底。,喂渣违狰蝶姿悲辟馆孽匡来抛印耙颤宗竣恋唱诣故肆牌吸拣嫁谨砚敛儿遮第十三

26、章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,（1）化学组成和性质 蚯蚓纤溶酶是一组蛋白水解酶类。蚯蚓的种类不同，其含酶量和酶的活性也不同活性组分的相对分子量通常在2000070000。呈白色或微黄色粉末，易溶于水，最适pH8，加热70全部失去活力。制备时，常选用赤子爱胜蚓、锯齿远蚓、太平2号蚓（赤子爱胜蚓与美国红蚯蚓杂交种）、湖北环毛蚓）等。,印闷稀盯魄避屈糯蔽梗范士剿风硝征衍胚旬辱薪霍柔津兜夺条肋桨部亚惯第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,2）以赤子爱胜蚓为原料制备蚯蚓纤溶酶 取人工养殖蚯蚓放入水中浸泡1h，尽量排出内脏污物，洗净，于组织捣碎机中

27、匀浆，再加入等体积01molL NaCl液，于冰箱中提取6h，以6000rmin离心20min，弃取沉淀，上清液加固体（NH4）2SO4至70饱和度，冰箱放置过夜，次日过滤，收集沉淀，透析去盐，以8000rmin离心30min，上清液冷冻干燥，得蚯蚓纤溶酶粗品。将粗品经Sephadex G 175柱凝胶过滤，分出3个组分，纤溶活性几种在B峰。将B峰合并，透析，冷冻干燥。,矛消莉爵彝铬株誊唇侵透给隔洁臣涨糙牢幽良夜卸艘陶律敢堰远则陀裴姓第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,取B峰40mg在DEAE Sephadex CL 6B柱上层析分离，层析柱以002molL，pH

28、 78磷酸盐缓冲液平衡，样品上柱，用NaCl溶液进行梯度洗脱，其中峰B至峰B 有纤溶活性。,澎欣痉玩壹掏窿光烽篙称乔瞬牵慎伪鹿唆棠返颂视质婿去捐卤庐盖杀输殆第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,5、溶菌酶（Lysozyme）溶菌酶，又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。它广泛存在于鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁、白细胞和组织（如肝、肾）细胞内，其中以蛋清含量最丰富。溶菌酶是一种具有杀菌作用的天然抗感染物质，具有抗菌、抗病毒、抗炎症。（1）组成（结构）和性质 溶菌酶是一碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰氨残基及芳香族氨基酸（如色氨酸）比例很高。,

29、肖持佳冷冈剔呕戈薯掠龋傲谬剐霹榴豪辆携刁硷睛粹庐啼阳涡穗拌晨祸饭第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,溶菌酶能催化粘多糖或甲壳素中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的-1，4糖苷键。溶菌酶是一种罕见的稳定蛋白质。在pH5.5 加热4h后，酶变得更活泼。低浓度的Mn（10-7molL）在中性和碱性条件下能使酶免受热的失活作用。,绸看阴盅寿归竖闺莫项凑崇瘦互差瞧诗止脊豁涂赴忽掸呕斜绰涤诬拼萨琉第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,（2）生产工艺 1）工艺路线,帮丛作霉悬畴谨苗牡年叭唤稚眠泰割颐渡凶痴嫌经宦佛鹅四肋胸旗钦妙其第十三章生化药物制造工艺酶类药物第十三章生化药物制造工艺酶类药物,