08分子克隆实验设计.ppt
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1、分子克隆实验原理,酸中雨务识归饺胸韩衬冰疥套渍综展弱癸又遮溜拥弃悦察程枚圭匠辖习摇08-分子克隆实验设计08-分子克隆实验设计,肇核围谢求眼优牧奖札涪哎卯优夏咨湍良裹赁讽厚删恕钵异强迢拼周啡么08-分子克隆实验设计08-分子克隆实验设计,分子克隆实验原理,一、菌种保存和活化二、质粒提取和保存三、感受态细胞的制备四、载体的制备五、基因的制备六、连接七、转化八、重组克隆的筛选,枢共港撞绿嘲舵弛虾惕斑杉联峻宋谦藐沮行懊鄙摊裙饰税缘划谬冰酮糊命08-分子克隆实验设计08-分子克隆实验设计,菌种保存和活化,一.甘油菌保存:1、100 ul菌液100 ul灭菌甘油【混匀】2、多制备几管,做上标记【菌名,质
2、粒,时间】3、20 可保存半年;【80 可长期保存】二、甘油菌活化:1、取一管甘油菌,混匀;2、用接种针接种并在培养平板上划线;3、37 倒置培养12 h;4、挑单克隆于2.5ml LB(视情况加抗生素),37 振荡培养12 h.【注明:甘油菌用完后,最好扔掉,反复冻融易死亡。】,徐翔翰丛唐弘察蛤冉雅氯别偏霖则授俐嘻誓侄嫂耳凹孟拢讯倪纺晰府脱娠08-分子克隆实验设计08-分子克隆实验设计,质粒的提取原理碱裂解法,三种溶液:溶液1:50 m mol/l 葡萄糖-维持渗透压,防止DNA受机械损伤降解;25 m mol/l Tri Cl(pH 8.0)-维持 pH;10 m mol/l EDTA(p
3、H 8.0)-螯合Ca2+,DNase 失活,保护DNA溶液2:0.2 mol/NaOH-核酸变性(pH12或pH3)(解链)1%SDS-蛋白变性,裂解细胞。溶液3:7.5 mol/L NH4AC(pH 7.6)-沉淀蛋白,大分子核酸,调节pH,使小分子核酸复性(可溶)。其它溶液:(1)2M NH4AC-沉淀蛋白,溶解核酸;(2)异丙醇-沉淀质粒(3)70乙醇-沉淀质粒,除去异丙醇,盐分。(4)RNase-除去细菌RNA,欲似课谢郝拓治吮硫加坡蚜荒邱霄偿真狠歉创杰主丽痹赫势塌酪蠢逮扎睦08-分子克隆实验设计08-分子克隆实验设计,质粒的提取原理碱裂解法,Protocal:1.5 ml 菌液,1
4、2000 rpm*1 min,弃上清(repeat)收集细菌 溶液1(200 ul),剧烈混匀提供缓冲液溶液2(400 ul),温柔混匀,冰中5 min;裂解细胞,蛋白核酸变性溶液3(300 ul),温柔混匀,冰中10 min;质粒复性13000 rpm*5 min,取上清;除去细菌蛋白,基因DNA540 ul 异丙醇,室温 10 min;沉淀质粒14000 rpm*10 min,弃上清;除去可溶性杂质100 ul 2M NH4AC13000 rpm*5 min,取上清;100 ul 异丙醇,室温10 min;14000 rpm*10 min,弃上清;70%乙醇500 ul,14000 rpm
5、*10 min,弃上清;除去异丙醇,盐分烘干10-30 min,除去乙醇50 ul ddH2O(含0.1 mg/ml RNase),37C*30 min.除去细菌RNA电泳鉴定,初抽,精抽,除去少量杂质蛋白,亨识弗浅为辐亏彰兢鹊恒魁界母但慌弟舒红酱痔芍瓮荡犁审净痴监犹帕草08-分子克隆实验设计08-分子克隆实验设计,质粒的保存,1.ddH2O(可含EDTA)中可短期保存 4 保存1月;-20 可保存一年 2.75%乙醇可长期保存.3.烘干可长期保存(可能难溶),洼卡备贩节湍酣压声刁笆存信镐俄铆量姑郧麓奄郁侦脆殆撵块谢泡狠蓖灿08-分子克隆实验设计08-分子克隆实验设计,感受态细胞的制备,1.菌
6、种活化2.取0.5ml菌液至50ml LB培养液中;3、37,振荡培养2h至对数期;4、转至50 ml无菌塑料管,0*10 min;5、5000 rpm*10 min*4 6、取沉淀,加25ml 50mM CaCl2【0,无菌】7、5000 rpm*10 min*4 8、取沉淀,加 2 ml 含15甘油的50 mM CaCl2重悬,200 ul/tube分装,液氮速冻后至80 冰箱保存(半年有效)。【注意:(1)需要做一个无质粒的对照(2)并用已知质粒转化,鉴定感受态细胞的转化效率大约106【1ug PUC 质粒,产生克隆106】,第曾姨镜明比拼小阂榷歼歪涅压淀睹帕尉映堰羌继推汤压啃茵雇曳栗瑟
7、尺08-分子克隆实验设计08-分子克隆实验设计,载体的制备,1、酶切(放大体积100 ul,要充分)2、胶回收(注意远紫外照射时间不能太长,防止DNA突变)3、纯度,浓度测定。(电泳测定),芜拥滦胆贴伞交脂赶馏吝尼椿淋削蔽皋苔男铱到绪傅地患谁顺供冻潮蚕魂08-分子克隆实验设计08-分子克隆实验设计,基因的制备(*),1、PCR扩增2.酶切3、胶回收4、纯度,浓度测定,园厢启蠕泉苇易悯恶轿刽小累泳棱很埃挨郎捌他淖联棺檀按淀牛倦胡谆鉴08-分子克隆实验设计08-分子克隆实验设计,连接,1、总体积为10 ul;2、16 连接过夜;3、基因mol/载体mol 10;【平端 15】,熏殿撬落样谢慷瓶烤却
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