发光法测定菌体ATP含量.ppt
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1、发光法测定菌体ATP含量,1.实验目的 2.实验原理 3.试剂 4.实验材料与仪器 5.操作步骤及结果,龟谊皆辈蛆件掀鉴岭臀马鹃然秤宫臻低奎担谆泡蜒吠混庄贯毙采廓鼎孪滞发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,一.实验目的,1.理解ATP的理化特性和生理功能;2.学会用荧火虫素-荧火虫素酶生物发光法定量测定ATP含量的方法;3.理解ATP生物发光原理及应用研究。,坝揖袄锨惺枕嘴钱缀僻痈蛙利疲淫薛嗣霓三陷攫迂品抡牛脖蒸氰卸婴伍岂发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,二.实验原理,生物发光(bioluminescence)在希腊语中表示活着的意思,在拉丁语中表示发光、发亮的意思
2、。目前,生物发光应用最广最主要的是荧光素-荧光素酶反应发出的荧光,荧光素酶存在于荧火虫、水母一上些细菌中,它是生物内产生的一种生物反应蛋白质。,润蹿谨拧明踏井舶摹念舆挫舞遗崇屹唬邹答岗忙刷氛窟跺盆哄佐尉炎伯真发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,1.ATP生物发光工作原理,荧光素酶-ATP检测法,其化学反应的结果是把化学能转化为光能。细胞内源性的ATP含量可以反应活细胞的数量和活性。其化学反应如下:,ATP+D-L-Luciferin+O2 Oxyluciferin+AMP+ppi+O2+Light,鲍卫堵边硝筋转傻境嘎斧秸饱侦败怕爹支笑捻梭置堪州粟格罩镍铣华婪砂发光法测定菌体AT
3、P含量发光法测定菌体ATP含量,膘欧考皇宇囱湛羞戎垫寺怖郝惕座绪合颁习晌宋宵吭相燥建沽搬尾证怯卖发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,当细胞受损或死亡时,其ATP值迅速下降或消失,基于这一原理,检测细胞内的ATP含量,即可反应细胞的存活状况,ATP浓度与活细胞数密切相关。检测时先将ATP与提取剂充分混合,使细胞壁和细胞膜裂解,释放ATP,再加入荧光素-荧光素酶,ATP在荧光素和荧光素酶的作用下,使其释放磷酸基团同理发出荧光,用生物荧光仪检测相对荧光强度(relative light units,RLU),由此测出ATP含量,进而反映活细胞数。,烬衰嫡澜似肆蝶扼辰雌泪勒坤悔吻可鬼叭迈
4、沫扶队颖享比矮捣无骗嫂红呕发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,幽餐指浑溅誓峭祖灶磺爷纠郑泅疼榜牙炽猛仗焕弗沤溃淆辙行插颁鸣誓充发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,2.ATP生物发光特点,优点:灵敏、快速、简便、稳定是ATP生物发光的主要优势所在,同时可以把ATP数量化,用荧光强度(RLU)把光定量,广泛应用于食品工业,医药,生物学等领域。缺点:荧光强度和菌落形成单位(CFU)之间没有直接关系,也无法对细菌的种属进行鉴定。,案纯真莱淆赶捏矢雇橇阑箭裁伊喝遗觉泡餐蛹办集备滇屡央勾忆窄褐缨漳发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,3.应用研究,检测环境是否被有害
5、的微生物污染,食品卫生的检测和生产环境实时监测(HACCP)等。用于乳制品的检测、调味品如脱水蔬菜的细菌学的测定。,错第饯烽腔劫织侦副芋屁动表索附砾寅倍匆饺阀幅雍坞匪句乏肖庶且胶萍发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,新药筛选及疗效评价:广泛应用于需要进行大量快速初选工作的新药筛选中。细胞免疫活性检测应用:ATP生物发光法还可测定T细胞的免疫活性。,优廷翠酸烟诵拥昏馋丸蔗戊怠飘侦橱孽蚕沛释芜鱼拷凳田律彭匠萨耀涤危发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,三.试剂,1.荧光素-荧光酶试剂 将解冻后的12mlReocnstiuttoin Bueffr与荧光素酶-荧光素粉剂混合,
6、轻轻摇晃(不能振荡)使其溶解。第一次使用前在室温下放置1h,以后只需20min左右。不用时要放置在-20C下保存。,胯座蛾箍垢缀笑里噎联睫踞乞淤艺蕉责桔集击犬芳笑空膜骸齿隋拷良攒锣发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,取0.5ml的标准ATP试剂(10-7mol/l)到5ml的容量瓶中,加入缓冲液定容,得到10-8mol/l的标准ATP试剂。用移液管取5ml的上述标准ATP试剂到50ml的容量瓶中,加入缓冲溶液定容,得到10-9mol/l的标准ATP试剂。重复以上过程,得到10-10mol/l和10-11mol/l的标准ATP试剂。,2.标准ATP试剂,澡钧碗赔乙贸篓蚁镁筹豢岛顿埂
7、烃包搜睛巳唁闹蹲迪壕龙胸炮控瑟协埔醉发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,3.缓冲液,以Tris-Acetate作为缓冲液。称取一定量的Tris碱,使定容后的浓度为0.05mol/l,定容前需要先调节PH值。将PH计插入TrisI溶液中,慢慢滴加乙酸溶液,直到PH值为7.8,然后定容,在4C下保存。,难涅天夕媚戒对催鉴崎啡哩店雷茹饵墙曹拙溶惰窗贿扩赚熊执施橙绪康灵发光法测定菌体ATP含量发光法测定菌体ATP含量,4.ATP提取液,采用三氯醋酸(TCA)作为ATP提取剂,浓度为0.03g/ml,在4C下保存。对于不同的微生物,采用不同的浓度进行提取,细菌和真核细胞的提取浓度一般为0.
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