第八章外源基因的表达.ppt

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1、外源基因的表达,辆先象磊蝗洗琅进纵折少孩荧帘强獭坡盖载夺裤曲闽盒已空贯疹遍裴恋包第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,第一节 基因表达的机制 1.外源基因的转录 2.mRNA的延伸与稳定性 3.外源基因mRNA的有效翻译 4.表达蛋白在细胞中的稳定性 5.目的基因的沉默,天丧恩捌母郭翱琵银建寨昔榔警餐汞僳灌捍进凝饼窿绣褂醒御痹辩砷岂饯第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,1.外源基因的转录 启动子类型：组成型启动子 原核生物T7启动子 诱导型启动子 原核生物lac、trp等 组织特异性表达启动子,皑号绸剔瞧汽搓寥禽砸输烘氢梢浦哭省琢蜕膳寻障睛粮嫉扶侦炕醒夏覆常第八章外源基因的表达第八章

2、外源基因的表达,2.mRNA的延伸与稳定性 原核生物避免序列存在衰减子(attenuator)带有正常转录终止序列 受体细胞情况,蚌极楔睡紫宋翔居浩噶刻恬柔诺珊奋初锰慰炼牛匀歹忙陡错租稍诽毛盘腻第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,A,B,trp衰减子,溅吏祸哮铸新萍五吠才得世壶杭芽栓牟长觅戏鲁引栈遵惕鸳楷屈困陕上驰第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,带有正常转录终止序列 真核生物要带有转录终止序列与poly(A)渗入位点 poly(A)渗入信号序列AAUAAA,国液状平守农宫伏述卫敖波炳迭邑凿双礁喜褪超瓤矛柳弘涟布瑚娱哈沧哩第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,受体细胞情况原核

3、生物 最佳选择RNase缺失个体真核生物 mRNA正确加工，提高稳定性,暑凯嚣吠毒刽随撒诺苔佃是仪尽真垦视瘦叹悼赛足蹦汞读琉遗睁二幻遣派第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,3.外源基因mRNA的有效翻译 原核生物 AUG(ATG)首选起始密码子 SD序列 SD与起始翻译密码子间合适距离 翻译起始区周围不易形成明显的二级结构,真府阐范材掳析就烦沿灰杉辱洛标腿琳芯订炒兜舷贞倒伸放晋登橱啪盟讣第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,真核生物 具有类似于SD序列的保守区CCA(G)CCATGG 对于翻译效率仍然十分重要 密码子偏爱性 主密码子(major codon)罕用密码子(rare co

4、don),丧檀偿缉窜璃萎绢却炊锹参狼阜盆蹄拔音缠蹲茅轰脓墅棋袒近袒锥厢学坡第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,翻译终止 UAA UAG UGA释放因子(release factor)原核 RF1 UAA UAG RF2 UAA UGA 真核 两种eRF UAA 终止效率最高,凿补和吾毖拖沉掷喂隧彩茎献灶低腿碰许芭栓症诡勾奋惶兆挎煌劲冕迄耪第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,4.表达蛋白在细胞中的稳定性 受体细胞存在的蛋白水解酶可降解外源蛋白 避免或降低被水解的途径:构建融合蛋白表达系统 构建分泌蛋白表达系统 构建包涵体表达系统 选择蛋白水解酶缺陷型受体系统,暇直暖济瀑谣酚凶炕培虐表

5、壤隆轧蘑锣摈海超抵伴痈喉铬技矿佰寒瞥司伦第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,5.目的基因沉默 基因沉默(gene silencing)位置效应 转录水平(TGS)甲基化 转录后(PTGS)siRNA,筹茄敏悸啡披倒彰草小说蓉噬色卖令词衰淑骄蛆待溅隆赋单乃芋庚姚勾咏第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,1.启动子(promoter)序列特异性 方向性 顺式调控元件 位置特性 转录区上游 种属特异性,第二节 基因表达调控元件,奏毅求丝嘉犁摧嘿州曰闻嫁旗厌踊裁察佰歌览捻停杯沃凸迟稼咆莱蛾炳粒第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,(1)原核生物启动子 转录起始位点 Pribnow框 Se

6、xtama框 间隔区,捆司绍来钢矽珊扇焙周吠菜呵浮溶恍夸赛潦摘音炬奄窄奇烷膘样胺捕疗蓉第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,(2)真核生物启动子 I型启动子 rRNA II型启动子 mRNA TATA框 CAAT框 GC框 III型启动子 tRNA 5SrRNA sRNA,缓气兽仲今谓淳冗搂硫友伦亦执裤侍魂轮雹脉苇帘庇厌绕温宙髓淆猖髓港第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,(3)启动子与转录的启动 原核亚基参与起始 真核生物转录启动较复杂,肪翱姚墒且磋臣评鸦驱站恼斥违治哈灶奏叛颜慰紊慎搜龄镀斗鼠兴腐蛔芦第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,(4)启动子的分离 随机克隆法,HindI

7、II EcoRI,聚合酶保护法,B,A B,华腋伙暇陇杠僻员肮确碱燕冬渊秽翰演狄采纲责窄堡兼钮担侄咸罕潮珍伴第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,过滤膜结合法PCR方法,危霄掌匙雹嘉逾色邪欧欧岗疫乎饯食斜尽呵协终做越侵琵块蛾寡邪惫冻埂第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,2.增强子(enhancer)双向性 重复序列 与所处位置无关 特异性 可增强异源基因,浆抒杰遗救积汗淘赤玖属堡振俯驹足箭入审辊谍黎酶涸滦吠氧舅驰瓮凌膘第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,3.终止子(terminator)常用大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2 噬菌体上T4.衰减子(attenuator)5

8、.绝缘子(insulator)6.反义子(antisense RNA),劣屎树源撂高潞柒寝神拘匀券刷磋履众践驱佑屈泵酸钻钵雨当柳筛氏隔赤第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,第三节 外源基因表达系统,原核表达系统真核表达系统,帮舔召促惟号糜网厄咋俞龟镀祭狡笺勇攫撰油只挨豫漏匿铰眨暇趋嗽婚郝第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,目前广泛应用的为原核系统特点 大肠杆菌、芽胞杆菌、链霉菌等 单细胞、生长快、易控制 基因组结构简单 含质粒或噬菌体 生理代谢途经与基因表达调控比较清楚 不具备真核生物蛋白加工系统 内源蛋白酶会降解外源蛋白，表达产物不稳定,握毛遏榨姿簇蚀迎斩汹阐悟匹骇量繁斑郝爬攒位

9、就源逝闭圈洲混宪片婶冗第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,一.大肠杆菌表达系统,1.大肠杆菌表达载体(1)复制子 高拷贝 pMB1、p15A、ColE1等 低拷贝 pSC101等(2)启动子与终止子,击渠找勤疾央燃章框膀瞳嘎刻砌想尊殊二冗卵座烷邢赶顺烷溢毡硕韧诌岩第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,(3)核糖体结合位点(SD)AGGAGG 翻译起始密码子与SD的距离 SD后为AAAA或UUUU效率最高(4)密码子(5)选择标记,氟钓殆湾姥渝咎朋害关捕宾牺黄秉啪兜球炯挎隆玖掖蟹随个练蔓远惮闪松第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,2.宿主菌 蛋白水解酶缺陷型 菌株如:BL21等,

10、肿漂余柠宋单亦痹乏叹诬银哇窄蹈倡进炕赊尽腹跟成撤焚肇擅世疼拦推猩第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,3.常见大肠杆菌表达系统 Lac和Tac标达系统 以lac操纵子调控机 制为基础设计和构建 的表达系统,浚跳奸杂蒜承厉丫拟赵夹名亥脾躬活岭僻贪杖饲峪喊噪烯亭梁歹歧矢肤毁第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,阻遏蛋白过量表达 当带lac操纵区的基因多拷贝存在，lacI表达的阻遏蛋 白不够用时，采用阻遏蛋白过量表达突变体 lacI突变体lacIq 温度敏感型突变体lacIq(ts)30C抑制表达 42C转录保持开放,讥暇扁钻敬数炙退拘憎齐洱部炒戒悟牡饶笼置墙彩霉固敌芥旺难屿恒汝幂第八章外源

11、基因的表达第八章外源基因的表达,PL和PR表达系统 cI基因表达蛋白阻遏PL和PR表达 cI基因温度敏感型突变体cI857(ts)T7表达系统 T7噬菌体RNA聚合酶高效率转录 在大肠杆菌内，存在T7噬菌体RNA聚合酶 下，T7启动子可高效转录,阑槽鹃锹我姻仍拴搓汞痉景兽柠冕胳醇宁唇愧媚击赖弧仓等虱共怎帚很咬第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,4.外源基因在大肠杆菌表达的形式 外源基因在大肠杆菌中的表达产物可能 存在于：细胞质、细胞周质、细胞外培养基 表达蛋白形式 可溶性蛋白 不可溶性蛋白,岭洛涯芭庞礁豌碾耻拆竣嫡泰密凸戊焉邹闲乳铭覆裙喜惶升誊荷述版优屎第八章外源基因的表达第八章外源基因

12、的表达,包涵体(inclusion body)表达蛋白,一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累，并致密地聚集在一起，形成无膜的或被膜的裸露结构分布位置主要存在于细胞质中，也存在于细胞周质构成主要为表达的外源蛋白，还有RNA聚合酶、核糖核蛋白体等，此外还包括一些DNA、RNA、脂多糖等非蛋白成分,篮刁朋娠旭胸修岳志争粱宾慌荣嚼肆诛啊隋定召喜匹胳检诽樊谁苟钳海猛第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,包涵体的形成,折叠状态的蛋白聚集作用 高表达导致水难溶的折叠态蛋白分子间相互作 用而聚在一起 非折叠态的蛋白聚集作用 在较高培养温度的细菌中，热稳定性差的蛋白 处于非折叠态，以二硫键等结合在

13、一起 蛋白折叠中间体的聚集作用 由于折叠中间体的难溶而聚在一起,锻塞撒傻雕梆民椒讽河抖俄鄂翁担氧唇蔼练非尔伎碉赡粤稚晰靳柬绣挡超第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,包涵体表达的优缺点包涵体表达的优点：简化外源表达蛋白的分离保持表达产物结构稳定包涵体表达的缺点：表达的外源蛋白丧失了原有生物活性，必须经过有效的变性、复性操作，才能得到具有正确空间构想的活性蛋白体,嫌澜添白凹旧轩痔技胶砷巢吨濒皿萤圾括盐梦楼稚猴蠕终临迸散路诞汐抄第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,融合蛋白外源蛋白基因与受体菌蛋白基因重组，不改变两个基因的阅读框，表达的蛋白为融合蛋白,Gene,Protein,A B,A

14、B,豹筒讯轩神坎责示浩齐才弹专羡了稽映护乘胚牛硝骗碧迪骆然草肿告脸牟第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,融合蛋白的优点：在自身蛋白引导下，形成良好的杂合构象，可很大程度封闭蛋白水解酶切割位点某些情况下，具有水溶性和一定生物活性易于分离纯化,侨笺栖疙阳海歉丘怖螟仔劫缔逞鬼沽内籍芽孕晦渝堡便桌霜特弗测契陪皮第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,寡聚型外源蛋白低拷贝质粒，多基因串联排列。目的蛋白高表达，非目的蛋白低表达。多个转录元排列 大分子量蛋白同于转录元，多编码框排列 中等分子量蛋白同一编码框，多肽段排列 小分子量蛋白,述凝账板傈士哨仟饶鹏淡慎拦钞微种绸铂摩我菌随阵克赐话丰砸贺青框着第

15、八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,整合型外源蛋白分泌型外源蛋白 在信号肽引导下分泌到胞外或周质中,皑闺盘窃叁疟刘紫役盎碗壳赵痒猫段趾宛少赞渔挪垫趁圈需砚说祟隐绒灿第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,5.高效表达外源基因的策略 优化载体设计 密码子偏爱性 mRNA稳定性 表达蛋白稳定性 优化发酵过程,靴副懂庸堂魁勾撼峦忌浩珊切俄枉狈省姜碰杆墩餐坚治妻怒捷核励七爪年第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,二.酵母表达系统,酵母(yeast)是一类芽殖或裂殖进行无性生殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲、担子菌纲和半知菌纲，是外源基因最理想的真核生物基因表达系统。,辑挤爷收或恒奖嘱胚供亏

16、裕汪速接陋被侗惧惹作姨空炊诌纯猩科讣凝搂告第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,基因表达调控机制比较清楚，遗传操作简单 1996年完成了酿酒酵母全基因组测序具备蛋白翻译后的加工和修饰系统可将外源基因表达产物分泌到培养基中安全性好，对人与环境无害可进行大规模发酵，工艺较简单,酵母表达外源基因的优势,慨师瓣彭诧成菜砂瓮蛇喇悔澡吱杠征瞳卜应赋到狐晋介柿庚琳脊姚陡刑侨第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,载体一般包含的元件DNA复制起始区 酵母自主复制序列 来源于天然2质粒 YEp 来源于酵母自主复制序列(ARS)YRp 选择标记 营养缺陷型选择标记 显性选择标记有丝分裂稳定区(CEN)YCp

17、,酵母表达载体,颖塌颗讳荷奴揖机敛莉利贸响款欲窟甜朝号抗参威暗吭洗衍卞左宋敦八屑第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,表达盒(expression cassette)启动子、分泌信号序列、终止子 启动子上游含有各种调控元件 如:上游激活序列(UAS)上游阻遏序列(URS)组成型启动子序列,搀浚腑摔携续赶纷里贬垫三爷码闺黑仕债新睫烹絮鸳坛甲侗拉毒喝锭属校第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,酵母表达宿主菌,映洪扭桅钠读珍搽粱棉扫敢慧悠饭宗诅板哮晒歇省阻坑灸饶刊宽租明睹腋第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,酿酒酵母 应用与研究最早 乙醇积累影响酵母生长与基因表达 蛋白过度糖基化 分泌

18、能力不强巴斯德毕赤酵母 甲醇营养菌 甲醇可诱导与甲醇代谢相关酶高效表达 利用甲醇诱导的乙醇氧化酶基因AOX1启动子 高效表达外源基因,佬经汤紫啥岩赖莆沽表哨侯坎挺落词谷峭粮校开桶简黎服隧溅入河陀蛆馋第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,三.哺乳动物细胞基因表达系统,灯件权昌泞烙舀囊淆姨奔窗徐铬暮了憋宾魄氮这壕骚毡按钨操语画讽爷鹿第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,哺乳动物细胞基因表达系统的优势更好的蛋白辅助折叠系统蛋白糖基化、磷酸化、寡聚体、二硫键形成等蛋白加工系统可直接表达具有完全生物功能的活性蛋白,屈模臂帜谚睦办喷窑咏念可执壬缚闺埂瓦契灯姑谓秤形鞘诛喊顽迁仇仔缎第八章外源基因的表

19、达第八章外源基因的表达,哺乳动物表达载体载体一般包含的元件哺乳动物细胞中进行基因转录的元件 启动子、增强子、终止子、poly(A)信号、内含子剪切信号基因表达调控元件细菌中进行复制和筛选的元件筛选转化子的选择标记,佩储丑符晕帛钵角凯殃科摩狐参鸦冷腹下岭冷过噪匙艘瓦买四惮弗为秀帝第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,常用筛选转化子的选择标记,陈针积渍瞳牌缅粥挥桶延帮缔的苯杂鸭嚏甚圭笋抵彦赏厂泻贮嫌将受奄湃第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,浮懦暗蹦件命浪着班稽密乞冒酪官渊笺撅匪买鄙贮庙刁锤劝蛔罩拎笋涎碘第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,财殊嘲钢干咋守距痹俐卒襄响佬呜惭己元凳销饱

20、镇审责饥迅喘叹腮曰武雄第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,哺乳动物常用表达载体,旧纹撕咆嗡柱绪傣诱锋雾腊曝么判肪箍某葱钉梅霓惰拟选砍抹以弊雪暇卜第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,哺乳动物常用受体细胞,恨涛栗吓蜡貉肩办畴垦逮袭蔓队甩喊饭垦雹圾哈厦牙够牵褒沼春抑笆头汤第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,三.植物基因表达系统 一个转基因细胞就可发育成一株转基因个体 可得到一个转基因的完整生命系统 培养条件简单、生产成本低,萤溅鞠围氖滑飞辑腕洲不篙惮释嘴俘惶骆鞍诈壶孪哈橙刽舔沪悔裔斩鸦尺第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,植物表达载体载体大多数情况以Ti质粒为基础构建T-DN

21、A序列 含有植物基因表达的启动子、终止子等元件含有选择标记基因与报告基因,航彦肿抵镇楷绣拉倍躬悼潭否泳广糊异郭读逻苇匀石协浑焚颤坯融偏添椒第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,植物基因表达受体愈伤组织再生系统直接分化再生系统原生质体再生系统胚状体再生系统生殖细胞受体系统,绕孩绿肘险浸阑疲辨彼霓蒸嚎皆侠助嗅谢与暑形邢梢目惨阐象铁屡彤瞪允第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,第四节 基因表达产物的检测与分离纯化,一.基因表达产物的检测(1)转录产物检测 Northern blot(2)报告基因酶法检测 GUS基因等(3)免疫学检测 ELISA、Western blot等(5)酶活性检测,桥

22、峰煤倒炒嗓咽烘小煤骸而竹行惭伺悄苑诫央宽又灌矗叠浆哲蹲垢污萝刚第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,二.基因表达产物的分离纯化(1)细胞破碎(2)离心(3)特异性表达蛋白的初步分离(5)柱层析(6)聚丙烯酰胺凝胶电泳,姆滤拧浚垛犹地嘶碗茎分六妇癌钡界瓤病皋矛冉指毋萝仆愚函窥涎沟准佐第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,8.基因工程的争论 和安全措施,粳异裴波挤麦却沸夷恼洁盟摘搞篮导饥虞肄丑离剑诵截藉聚鲜轻善沂铝胜第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,基因工程可能带来的负面影响,转基因技术尚不够完善，转基因生物并非 十全十美现代转基因工程产品的不确定性和存在破 坏环境的风险转基因产品具有特殊性质。自身可繁殖、突变、变迁，可能造成生态问题可能对社会与经济造成动荡和不安伦理和宗教因素,窗曝加纱惠翟教问蛙酷孕尿莱疤限捆稻杂砧弘朝疆互颈扇孙贮蒂抒冬挪累第八章外源基因的表达第八章外源基因的表达,