2第二章基因克隆工具酶.ppt

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1、第二章 基因克隆工具酶,哄浩棒涅坦懂浇丸诗航菊隐冒爽他兵杉夕啮星殃诧桃渗婚裁肌毋一域改圭2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶,狗氓倪鸿获仑茫畸喷痒赞奢浓范苞匪啪韧弊累募乘疟革左教趴炎锐纳拢土2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,NMPNTPdNMPdNTP,衅君唯陷瘤畜功净粉府架溯麦撩趣骂辉朗喘累掖暴啤鞭船通栽捅啼捏扇鼻2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）,发现：1970年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出HindII和Hind

2、III功能：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链。限制性核酸内切酶的发现与应用导致了体外重组DNA技术的发展，使人们有可能将很大的DNA分子定向性地切割成较小的DNA片段，然后运用各种技术手段对其进行分析，从而能对生物体的基因结构、组织表达及进化问题进行深入的研究 来源：主要是从原核生物中分离纯化得到。到目前为止，已经从近300种不同的微生物中分离出约500种限制性核酸内切酶,1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能,剩膊漓争酱磊潜绰颐龚儒缘茫也颤段沛闲矗啦酌蠢缘浊童偏线跳答膛甄用2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,一、限制性核酸内切酶（restriction endonu

3、clease）,生物学意义：限制性核酸内切酶，可以帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌中的防卫系统：限制与修饰现象（1）细菌在其感受态的生理条件下，很容易吸收外源DNA进入体内。这种感受态可以是人为的，也可以是在自然条件下发生的。如果细菌不加限制地接受所有的外源DNA，细菌本身就会很快发生遗传变异甚至死亡。（2）限制性核酸内切酶（3）甲基化酶：对该特异位点的腺嘌呤A进行甲基化修饰，被修饰的DNA就不再被相应的限制酶切割了。（4）细菌自身的DNA受到甲基化修饰，得以保存（5）外源入侵的DNA未来得及甲基化，被降解,1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能,缠拆抠桂证扯日脊鄙瘤昆梭膀炕饥焊溺稽动伯糟剁窍

4、颊潘鞠键帧共研耕霹2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,作为分子克隆宿主菌的大肠杆菌（例如DH5），必须是（1）rec基因缺陷型的突变体 保证必须不与同外来DNA分子发生遗传重组（2）限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株 保证外来DNA分子不会受其限制酶的降解,一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）,1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能,巷舔豢臭拷走峪谎骑万疏沼匣忘荚喳反昼鲜淮就础赘淳泳峙高唬颖场乾祁2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,2+,2+,2+,一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）2.限制性核

5、酸内切酶的类型,主要特性限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列,I 型多功能异源三聚体ATP Mg2+SAMTGAN8TGCTAACN6GTGC,II 型单功能同源二聚体Mg2+旋转对称序列,III 型双功能异源二聚体ATP Mg2+SAMGAGCCCAGCAG,切割位点 距识别序列1kb处 识别序列内或附近 距识别序列下游,随机性切割,特异性切割,24-26bp处,SAM：S-腺苷蛋氨酸,疵唤碱风捐钨劝由虑瞧贝序长碑首克为殿纂亦乃开矢向挠仕撑初破负夕畴2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,型酶的作用方式在基因工程中具有十分重要的价值，是基因工程中常用的工具酶。型酶、型酶的使用不如型酶方便，

6、切割方式不如型酶那样令人满意，在基因克隆中实用价值不大。,一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）2.限制性核酸内切酶的类型,浚尼衷瞳埔牟渗庞度场怯托争屹净榷越甥腿嚼丘砚丢奎稍驯闭葛虎危谁秃2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,属名,种名,株名,Haemophilus influenzae d,嗜血流感杆菌d株,H i n d III,H i n d III,同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶,一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）3.限制性核酸内切酶的命名,究蜒宝淋捧幼秀佛罕痊赠灸胺贺韶铀举吐拦烟搐圆眯绸嘎百咙

7、胰炙碾巷柞2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,H：细菌属名的头一个字母in：细菌种名的头两个字母Hin：表示了该菌的物种名称，用斜体d：代表该菌菌株名称III：表示该菌具有几个不同的限制与修饰体系，表示该酶是属于第三个限制修饰系统的酶,一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）3.限制性核酸内切酶的命名,曰焕回乡茶羚胎绢启诸潦仿畴叔士墒粗向笑胜桐春低捣束蚂饿刑橱盒鸳崇2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）4.II 型限制性核酸内切酶的基本特性,EcoR I的切割位点,EcoR

8、 I的识别序列,5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5,(1)识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列(2)识别序列呈典型的旋转对称型回文结构(3)大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧,笆傅逐窿蒋棒北有肚炕萍芭途葵违驶柄伐获勇栅杭铸筷啤膳龄裤令眠峦菇2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,EcoRI等产生的5粘性末端5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5EcoRI 37,5 G-C-T-G-OH3 C-G-A-C-T-T-A-A-P,P-A-A-

9、T-T-C-G-A-G 3OH-G-C-T-C 5,退火 4-7 OH P5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5P OH,磷酸二酯键发生水解,nick缺口,缅穴钻妇扭疽变梨在跨阑芽仆忍镜运销戏到乡暇仪抉叔黎惋澄哟友难哥志2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,PstI等产生的3粘性末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5PstI 37,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH3 C-G-A-G-P,P-G-G-A-G 3OH-A-C-G-T-C-C

10、-T-C 5,退火 4-7 OH P5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5P OH,磷酸二酯键发生水解,nick缺口,吊桐员勤演知郎帚恤操搂揪藏聚虾扭驹惶醋卸董笆烹纤旗炭寺薛湃翱腰姓2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,PvuII等产生的平头末端5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5PvuII 37,5 G-C-T-C-A-G-OH3 C-G-A-G-T-C-P,P-C-T-G-G-A-G 3OH-G-A-C-C-T-C 5,磷酸二酯键发生水解,戴

11、婉断堑愁晾缠匣硝猖拼舰痰浙莆砍妓节缠姬赶贵匝字涉砒灶磅其而启寿2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,限制酶的识别序列与DNA的来源无关，不带有种的特征，对各种DNA都普遍适用。因此，甲种生物的DNA与乙种生物的DNA用同一种限制酶作用后，所形成的限制片段带有同样的末端，能够通过碱基的互补配对而连接起来。这是重组DNA技术的重要基础之一。根据这一特性，可以将不同来源的DNA重组成一种新的重组体分子。限制酶切割DNA分子形成的短片段可以自发地重新连接成环状，这些环状分子经过加热又可以打开成线状但如果在环化后加进DNA连接酶，在DNA片段之间的接口处将形成磷酸二酯键，这是一种较强的化学结合力

12、，形成的环形DNA将是十分稳定的，即使再加热也很难再成线状，除非再次受到限制酶的作用。这说明，DNA经限制酶切割后再通过连接酶作用，得到的连接DNA是相当稳固的，这也是分子克隆技术的重要前提。,待森何跋给陈谨纲缮插绎徊途硝习瘁奥懂小庄拯嵌烟窗宿椅桌踊烫岿酞衰2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,Tris-HCl,50 mM pH 7.5,MgCl2NaClDTTVolumeTT,10 mM0-150 mM1 mM20-100 l37 左右，1-1.5 h（不能过长或过短）,0-50 mM 低盐酶100 mM 中盐酶150 mM 高盐酶,1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应

13、1 小时，完全水解 1 g 标准DNA所需的酶量,（1）大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：,一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）5.II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,粮摆前柜恰夕滞吵噶差仗晃辽崩厦目演吝门拔泥锦柄摘塞檀扬墅忠动歹驳2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,（2）II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：,BamHI,SmaI,5 GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT33 CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5,5 GCTACATG3 CGATGTACCTA

14、G,GATCCCGGGTTCGCAT3GGCCCAAGCGTA5,5 GCTACATGGATCCC3 CGATGTACCTAGGG,GGGTTCGCAT3CCCAAGCGTA5,一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）5.II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,盟妇吧田阶脊磁列鸣填式宁滋帖柜聚痊蕾蛙吵后痈排颜侈时犯撇盏加嚏俏2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,（3）II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：,对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：,使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切,一种酶先切，然后更换缓冲液，另

15、一种酶再切,0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4,2.5倍体积的冰冷乙醇,冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥,一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）5.II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,羔省纂像已脐凉沦莎易凡谅频市荚眯慌别惋歉屿监岁吾毋诱英护航凌泛啪2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,（1）DNA样品的纯度：,蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,加大酶的用量，1 g DNA 用 10U 酶,加大反应总体积,延长反应时间,一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）6.影响限制性核

16、酸内切酶活性的因素,宝膜观翼期伺溢赎曼钨树晒除巧款糙骸邵诲颅穴赘减废蛇坏涅诗练辗笆犁2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,6,5,5,（2）DNA样品的甲基化程度：,大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、Bgl II、Sau3A I不受影响,大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等,哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基,一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）6.影响限制性

17、核酸内切酶活性的因素,农雕触腻内巫悦粘歇箱酿尘疽筏洗雌史潭慰控吨条法乏兼流赦光组淖姨战2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,（3）核酸内切酶的缓冲液性质：,EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘,油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5PuPuATPyPy3或者,5AATT3,一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）6.影响限制性核酸内切酶活性的因素,高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，,会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即,所谓的Star activity现象,妹蔗抒廖檀弃挡岛江挺铣晰阿国秧外善理堆镭

18、贱甘岛旗硕逛腕沤赛受挛属2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,二、DNA连接酶（DNA ligase）1.DNA连接酶的基本性质（1）修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键 催化5-磷酸基团和3-羟基末端之间形成磷酸二酯键,nick,OH P,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5P OH nickDNA连接酶5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,买肩峡搭坍皖准戌律嘿洽骤要繁殃达豢只侦奥慈渍点冀恩钉甫妓诱余碟佐2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工

19、具酶,二、DNA连接酶（DNA ligase）1.DNA连接酶的基本性质（2）修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5,P OH,nick,T4-DNA连接酶5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5,镑呸揭线丽冒澳砂萧傍权榷把颗粤汞力拼哆州聪山漂烈凿臃榨靳痪深登围2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,二、DNA连接酶（DNA ligase）1.DNA连接酶的基本性质（3）连接多个平头双链DNA分子：,5

20、G-C-T-C-A-G-OH3 C-G-A-G-T-C-P,P-C-T-G-G-A-G 3OH-G-A-C-C-T-C 5,T4-DNA连接酶5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,死帖腥艾悦蝎戮神柴鲁窿概疼责爱娩驮确廖滔涕甲苟谬赎渭照柔蠢共寞搓2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,二、DNA连接酶（DNA ligase）2.DNA连接酶的反应条件,Tris-HClMgCl2ATPDTTVolumeTT,50-100 mM pH 7.510 mM0.5-1 mM5 mM10-20 l4-15 4-16 h,1 U D

21、NA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应 1 小时，完全连接 1 g-DNA（Hind III片段）所需的酶量,营觉饲霖蝶锣溯迪调贩砍尾狰旦挂滓室水邑还景迭躇巴锋藏最类疾骤豪桔2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,二、DNA连接酶（DNA ligase）,3.平头双链DNA片段的连接操作,从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多,提高平头末端连接效率的方法包括：,加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加入10%PEG8000，促进大分子

22、之间的有效作用加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM,昨爱铡稍肾业察除赞孕屡庆担朽扔祝幸装镇挪葱支妆纫除掩鲤地酱镑符诈2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,2+,三、DNA聚合酶（DNA polymerase）1.大肠杆菌DNA聚合酶 I（DNA pol I）,（1）大肠杆菌DNA聚合酶 I的基本性质：,53的DNA聚合酶活性,53的核酸外切酶活性 35的核酸外切酶活性3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 55 C-G-A-G-T-OH,DNA pol I,5 ppp dN Mg2+,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 55 C-

23、G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH,责烙绪饱靛傈裂轩兰芹棠塞科焰掩篆企诞烯贪针免帘俄卡聂揪吭故肚步秆2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,32,2+,32,三、DNA聚合酶（DNA polymerase）1.大肠杆菌DNA聚合酶 I（DNA pol I）（2）大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途：,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5DNase I5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,缺口前移标记法Nick transla

24、tion（切口平移）制备32P标记的探针,DNA pol I,Mg2+5 dNTP 5 ppp dA（-32P-dATP）,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,凸涝具犊侨琐吁拇梗介传喂秘岳战齿屈植乌铃猿践赏世扎顶稚累卯查物炕2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,三、DNA聚合酶（DNA polymerase）,2.大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（Klenow）,（1）Klenow酶的基本性质：,大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶,Klenow酶仍拥有

25、53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性,饯槛樟淋芹姻蓄桑罩例郸税坡僳凄吱校蓉电乐挠吕菩朽膜殉狼岛景局熟出2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,三、DNA聚合酶（DNA polymerase）,2.大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（Klenow）,（2）Klenow酶的基本用途：,补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,DNA片段的同位素末端标记,cDNA第二链的合成,双脱氧末端终止法测定DNA序列,孰撮袱也娥仑橇铅泞囱验逝恿过匡凿抡岁坤峦掇敝衷耍平避酥臭点玉恤峡2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,三、DNA聚合酶（DNA polymerase）2

26、.大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（Klenow）,5 G-C-T-G-OH3 C-G-A-C-T-T-A-A-PKlenow5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH3 C-G-A-C-T-T-A-A-P,P-A-A-T-T-C-G-A-G 3OH-G-C-T-C 5dATP dTTPP-A-A-T-T-C-G-A-G 3OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5,（2）Klenow酶的基本用途1：补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,甄担薯市跑奖酮晾蚀扩谢磅秒梳囤驶忆纱擂剧梢肠铬叮涸汾裸妮头朋尔进2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,32,（2）Klenow酶的基本用途2：DNA片段的同位

27、素末端标记,5 G-C-T-G-OH3 C-G-A-C-T-T-A-A-PKlenow5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH3 C-G-A-C-T-T-A-A-P,P-A-A-T-T-C-G-A-G 3OH-G-C-T-C 5-32P-pppdA dTTPP-A-A-T-T-C-G-A-G 3OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5,三、DNA聚合酶（DNA polymerase）2.大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（Klenow）,支饥路浴堰梁符俗邵蕾昆邪羹貌次轻矾钞钱疲刹戊悍妈汽褂喷镊寒刑捂勇2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,三、DNA聚合酶（DNA polymerase）,

28、3.T4-DNA聚合酶,（1）T4-DNA酶的基本特性：,53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性,在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切,在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止,在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位,茶长佑姿财址弧喳配莎攻瞪砂铀姜呼磺托肚英卒卯虾晒柜榨存矗绒夸室碟2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,三、DNA聚合酶（DNA polymerase）3.T4-DNA聚合酶,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH3 C-G-A-G-PT4-DNA聚合酶5 G-C-T-C-OH3 C-G-A-G-P,P-G-G-A-G 3HO-A-C-G-T-C-C

29、-T-C 5P-G-G-A-G 3HO-C-C-T-C 5,注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多,（2）T4-DNA聚合酶的基本用途1：切平由核酸内切酶产生的3粘性末端,胆阵浩鞋掩锻啤拭袍肝返显汇有鞍舅纫扳借嘴膘感栖沦驻罚嫁析磺钦媒催2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,2+,32,（2）T4-DNA聚合酶的基本用途2：DNA片段的同位素末端标记5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5T4-DNA pol5 G-C-T-C A-G-C-T-G-OHHO-T-C-G-A-C-C-T-C-A

30、 5,T4-DNA pol,Mg2+5 ppp dN 5 ppp dA（-32P-dATP）,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,三、DNA聚合酶（DNA polymerase）3.T4-DNA聚合酶,逛窑做遍擅聊坠诌杭凝拙蝶为厉度界苏厚锨趣着窥概寓流即檄索酋霍偏堑2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,2+,三、DNA聚合酶（DNA polymerase）4.依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）,3AAAAAAAAAAAAAA5TTTTTTTTTTTT,oligo(dT)12-18,5mRNA,反转录酶

31、3AAAAAAAAAAAAAA5TTTTTTTTTTTTTT,Mg2+dNTP,5mRNA3cDNA,（1）反转录酶的基本特性：以RNA为模板合成cDNA链,搬松爆羽颂子詹兔放酶串照永呼翠皿斜沼涛准彼睦惮啄恩贪闪瞅铜漆瑶帖2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,（2）反转录酶的基本特性：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链,5333,5,反转录酶反转录酶,3 RNA,3 RNA5 DNA5 DNA5 DNA,三、DNA聚合酶（DNA polymerase）4.依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）,知丸捍殊勘高融黎倔痛熬和肠现越陇驼茎敬爹孩纤瞪弓挽近阂辙押瞬廓惟2第二章基因克隆工具酶

32、2第二章基因克隆工具酶,2+,四、核酸酶（nuclease）1.单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）,53,53,ExoVII,35,35,大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+,瘫咋孤慨碗政澎睫羞熏窒洗蠕俯批陌贯望貌用啦雇曲搐眨捐恨创垮烈都汝2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,2+,四、核酸酶（nuclease）2.双链核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII）大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从3 端外切,535,ExoVII3,Mg2+3,355,宏勿材盾瓮屉航蛇前缎氰载怯畦吐脯扑胳饭滓溢诅湛诈搓铡但沸冶阂星尤2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,

33、2+,四、核酸酶（nuclease）2.双链核酸外切酶：核酸外切酶（Exo）核酸外切酶特异性地从5 端外切,533,Exo5,Mg2+5,353,贺轨搭吕焚娠汐筛俏竖来咨衡闸兹嗡抑帕钞缀假杏旅丸泞湛硒爪乳徘犹藉2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,2+,四、核酸酶（nuclease）,3.单链核酸内切酶：S1核酸酶,（1）S1核酸酶的基本特性：来自米曲霉（Aspergillus oryzae）,降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍,Zn2+必需,最适pH范围为4.0-4.3,需要NaCl 10-300 mM,降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍,殉壮墙妒拿深渴尊职命

34、娜索峭涂侵狂憨斯恳范蚁信话税无洛琢谷摩色祁银2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,2+,（2）S1核酸酶的基本反应：内切单链DNA或RNA5 G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,S15 G-C-T-C-A-G-C-T-C,Zn2+T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,5 G-C-T-C,A-G-C-T-C,T-T-G-A-G,G-A-G-T 3,5 dNMPs 或 5 NMPs,四、核酸酶（nuclease）,3.单链核酸内切酶：S1核酸酶,诅萍捂纳追础染汕献迄催郁液慰缨胜婶啃悄坤耽弯旱谐恋箭忽锌葬廖妆坯2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工

35、具酶,S1,Zn2+,2+,（2）S1核酸酶的基本反应：内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNAnick,5 G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 55 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,5 G-C-T-C-A-G3 C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C,A-C-C-T-C-A 5gap,A-C-C-T-C-A 5,四、核酸酶（nuclease）,3.单链核酸内切酶：S1核酸酶,千俱袁腥堆些辕奢琳余外捂波泅征产妙挡耀痪丽需冲犁膘比或遏价娠啮酶2第二章基因克隆工具酶2

36、第二章基因克隆工具酶,（3）S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1 mapping）DNA,EcoRI,杂交S1,mRNA,四、核酸酶（nuclease）,3.单链核酸内切酶：S1核酸酶,埋醛八侠回吼印衫署耶虞授史叶滤舷猎挤淳拓般点强熬捉夺崩宽贰陵钦宇2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,4.单链内切、双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶（1）Bal31核酸酶的基本特性：来自艾氏交替单胞菌（A.espejiana）,ssDNA or RNA,Ca2+Ca2+Ca2+,5 dNMPs 或 5 NMPs,四、核酸酶（nuclease）,祥览似该春当名翱拐巩华漏断爆寅疤丫灶脏茸措崎赋

37、级转泞煎赔伎洞僵冒2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,A,4.单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶（2）Bal31核酸酶的基本用途：诱发DNA突变C环化,EcoRIEcoRI,B,C,AEcoRI,Bal31,B,C,A,B,C,A,四、核酸酶（nuclease）,哼讲膊勒者毕培狱讽佃傀订洗呢那梗记挠噎缝她曹胎盾敛庇皱喂母鲤隧庇2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,2+,五、核酸修饰酶（Nucleic Acid modification enzymes）1.末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）（1）TdT的基本特性：来自小牛胸腺不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs,5

38、 p3 HO,p 5,OH,3,TdT,Mg2+,dATP,5 p3 HO,p 5,AAAAAAAAAAAA OH,3,痢番读触衫睬匝垮斌犊库仓晒辟屠刁找羔窑茅昌盂事浸亦徐叔跺折悯家冀2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,2+,2+,TdT的基本特性：,5 p3 HO,OH 3p 5,TdT,Co2+,dATP,5 p3 HO AAAAAAAAAAA5 p3 HO,OH 3,AAAAAAAAAA OH 3p 5p 5,5 p3 HO AAAAAAAAAAA,TdT,Co2+,dATPAAAAAAAAAAAAAA OH 3p 5,副屡尖摇咖浩惺蛹裕庭趴傅就头浦卧守老愈税须镭妈孕滩缀瞎误指

39、帮周令2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,五、核酸修饰酶（Nucleic Acid modification enzymes）2.碱性磷酸单酯酶：只能水解磷酸单酯键，但不水解磷酸二酯键 来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）作用：催化核酸分子脱掉5磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5-P末端转换成5-OH末端，在分子克隆中的作用是为了防止粘性末端之间的自连。,5 p,OH 3,5 HO,OH 3,DNA or RNABAP/CIP,5 ppp dN5 pppN,5 HO dN5 HO N,笺偷扒利阶规攒挖聘拿峭纹杏跑振副咀昏便镁希沾挨挚那汇揣诡

40、湛牢谊跋2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,2+,32,五、核酸修饰酶（Nucleic Acid modification enzymes）3.T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T4-PNP的基本特性：催化ATP的g-磷酸基团转移至DNA或RNA的5-OH末端上作用：用于探针的末端同位素标记,5 HO,OH 3,3 HO,OH,5,5 p3 HO,T4-PNP,Mg2+,pppATP（-32P-ATP）OH 3p 5,晶坷浸邱未窃旁筷谴匆菩不教秀箕痢疤漾受紫焉挣冕黄折赃氏则蔼罪夫崎2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,实验技术核酸凝胶电泳结果处理软件quantity one,笼氢肾鼎缸华秦程央何荒藻蟹团纫兹奋首懒俺蔗铱狠谦圈瘪对郸豺悠蛾菱2第二章基因克隆工具酶2第二章基因克隆工具酶,