实验动物胚胎工程(硕).ppt

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1、实验动物胚胎工程,某教师请学生喝茶，有许多漂亮的茶杯和几个 普通的陶瓷杯，发现大家都拿漂亮的茶杯喝茶，因此痛苦的源泉就是来源于-我们只注重外面的东西，而忽视了最重要的内在的东西 有分别心，有选择。,发怒，是用别人的错误惩罚自己。烦恼，是用自己的过失折磨自己。后悔，是用无奈的往事摧残自己。忧虑，是用虚拟的风险惊吓自己。孤独，是用自制的牢房禁锢自己。自卑，是用别人的长处诋毁自己。摒弃这些，你活着就不会很累。,学会感恩,感激伤害你的人，因为他磨练了你的心态；感激绊倒你的人，因为他强化了你的双腿；感激欺骗你的人，因为他增进了你的智慧；感激蔑视你的人，因为他觉醒了你的自尊；感激遗弃你的人，因为他教会了你

2、该独立。凡事感激，学会感激，感激一切使你成长的人！”,李嘉诚儿子被绑架的故事,绑匪张子强找到李嘉诚，让他给20亿元，如果你是李嘉诚你会怎么办？李嘉诚平静地说，我现金有10亿元，另外的我去银行取给你。张问他：你为何这么冷静?李回答道：因为这次是我错了，我们在香港知名度这么高，但是一点防备都没有，比如我去打球，早上五点多自己开车去新界，在路上，几部车就可以把我围下来，而我竟然一点防备都没有，我要仔细检讨一下。都怪我，我自己有钱但却没有安保措施，被你们几辆车就把我拦下来了。李嘉诚告诉南方周末记者，当时他劝告张子强：你拿了这么多钱，下辈子也够花了，趁现在远走高飞，洗心革面，做个好人;如果再弄错的时候，

3、就没有人可以再帮到你了。,后来张子强又打来电话，李说，你搞什么鬼，怎么还有电话?张子强在电话中说，李生，我自己好赌，钱输光了，你教教我，还有什么是可以保险投资的?李嘉诚答道：我只能教你做好人，但你要我做什么，我不会了。你只有一条大路，远走高飞，不然，你的下场将是很可悲的。,李嘉诚最喜欢的句子,春有百花秋有月，夏有凉风冬有雪;若无闲事挂心头，便是人间好时节。发上等愿，结中等缘，享下等福;择高处立，就平处坐，向宽处行-左宗棠最喜欢青菜白饭，很少吃肉，创办汕头大学,何谓礼？,礼者，示人以曲也。己弯腰则人高，对他人即为有礼。因此敬人即为礼。子曰：非礼勿视，非礼勿听，非礼勿言，非礼勿动。躬自厚而薄责于人

4、，则远怨矣。父母在，不远游，游必有方。以直报怨，以德报德。人无远虑，必有近忧。,何谓智？,智者，知道日常的东西也。把平时生活中的东西琢磨透了，就叫智。观一叶而知秋，道不远人即为此。默而识之，学而不厌，诲人不倦。不患人之不己知，患不知人也。君子欲讷于言，而敏于行。可与言而不与之言，失人；不可与言而与之言，失言。知者不失人，亦不失言。巧言乱德，小不忍则乱大谋。子曰：学而时习之，不亦说乎？有朋自远方来，不亦乐乎？人不知而不愠，不亦 君子乎？,知之为知之，不知为不知，是知也。知之者不如好之者，好之者不如乐之者。子在川上曰：“逝者如斯夫（像流水一样），不舍昼夜。”三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。曾子言曰：

5、“鸟之将死，其鸣也哀；人之将死，其言也善。”子贡曰：“君子之过也，如日月之食焉。过也，人皆见之；更也，人皆仰之。”,何谓信？,信者，人言也。远古时没有纸，经验技能均靠言传身教。那时的人纯真朴素，没有那么多花花肠子，故而真实可靠。言必信，行必果。君子和而不同，小人同而不和。毋欲速，毋见小利。欲速则不达，见小利则大事不成。子曰：“吾十有五而志于学，三十而立，四十而不惑，五十而知天命，六十而耳顺，七十而从心所欲，不 逾矩。”,一棵开花的树,如何让你遇见我 在我最美丽的时刻 为这 我已在佛前求了五百年 求佛让我们结一段尘缘 佛於是把我化做一棵树 长在你必经的路旁 阳光下 慎重地开满了花,朵朵都是我前世

6、的盼望 当你走近 请你细听 那颤抖的叶 是我等待的热情 而当你终於无视地走过 在你身后落了一地的 朋友啊 那不是花瓣 那是我凋零的心,第一节 实验动物胚胎工程概述,现代实验动物胚胎工程涵盖了所有对配子和胚胎进行操作的技术方法，它的研究重点在雌、雄生殖细胞到囊胚的各个发育阶段上实施体外操作技术。,我国50年代首先对四大家鱼进行人工排卵和授精；有些专家利用外刺激的方法使未受精的蛙卵出现卵裂。,实验动物胚胎工程主要包括以下几个方面：一、超数排卵（Superovulation）二、同期发情（estrus synchronization）三、胚胎移植（Embryo transfer）四、胚胎培养（Emb

7、ryo culture）五、胚胎保存（Embryo preservation）六、胚胎分割（Embryo split）七、体外受精（In Vitro fertilization）,八、显微受精（Microfertilization）九、胚胎干细胞（Embryonic stem cell）十、细胞核移植与克隆技术（Nuclear transplation and clone）十一、卵的激活与孤雌发育（Ocyte activation and parthenogenetic development）,第二节 超数排卵（Superovulation）,一、概述在哺乳动物胚胎发育形成卵巢的过程中，就确

8、定了雌体一生可以产生的卵子数量。如果是多胎动物，例如兔每次排出成熟的卵子平均为9枚；KM小鼠平均每次排卵8枚左右。而单胎哺乳动物每次只成熟卵1枚，一次两枚以上者很少见。,超数排卵：经外源激素处理的雌性动物，改变性周期，促进超常数的排卵，甚至可以超常数十几倍。最高排卵数：KM小鼠：83枚/只 兔：88枚/只 金黄地鼠：72枚/只,二、超数排卵的意义充分利用雌性动物的繁殖潜能在科研上可以在短时间内取得大量的卵和胚胎在生产中，可以提高优秀动物的繁殖数量，提高产量，增加经济效益。,三、超排方法 通常采用激素进行超数排卵，常用的激素：促卵泡激素（FSH）促黄体激素（LH）孕马血清促性腺激素（PMSG）人

9、绒毛膜促性腺激素（HCG）多采用PMSG与HCG或FSH与LH配合使用。,人：指在前一周期的黄体期开始应用GnRH激动剂，短方案是指在月经周期的第2天开始应用GnRH（促性腺激素释放激素）激动剂，当卵泡成熟后，给予hCG注射，以促进卵子最后成熟。通常在注射hCG后36-38小时取卵。取卵医生在B超引导下应用特殊的取卵针经阴道穿刺成熟的卵泡，吸出卵子。,妊娠的确定在胚胎移植后14天测定血清HCG，确定是否妊娠。在胚胎移植后21天再次测定血清HCG，以了解胚胎发育的情况。在胚胎移植后30天经阴道超声检查，确定是否宫内妊娠，有无胎心搏动。,副作用,卵巢过度刺激综合征(OHSS)由于多个卵泡生长，导致

10、体内一些因子发生改变，使得血管内液体漏到腹腔，甚至胸腔内，引起胸腹水。发生率约为10%。多数人症状较轻，表现为腹胀、腹部不适、轻度恶心，可以不予处理；但少数人会出现严重腹胀、少尿、腹痛、纳差，甚至出现胸闷、气短等症状，此时需要给予静脉补液，甚至收入院治疗。不足1%的人可能发生血栓或肾功能衰竭。,不同的动物采用的激素及剂量：家兔：FSH或LH总剂量为3060 IU 金黄地鼠：PMSG和HCG各30 IU 小鼠：PMSG和HCG各5 10 IU,第二节 同期发情,同期发情是胚胎移植的基础，也是胚胎移植成败的重要因素。受体的生殖生理原则上必须与供体的胚胎期完全同步，这样的受体生殖道的内环境才具备同期

11、胚胎发育的适合度。实践中受体动物的发情期可稍早于胚胎期,大动物如山羊绵羊等动物主要采用前列腺素类的激素如用15-甲基PGF2或氯前列烯醇等激素使黄体溶解来达到同期发情的目的。小型啮齿类动物如小鼠可通过挑选发情母鼠与结扎公鼠交配，来达到同期发情的目的，称为假孕母鼠,第三节 胚胎移植,胚胎移植是胚胎工程的一项重要技术，它是胚胎工程的重要基础，转基因动物、基因敲除动物、胚胎切割、体外受精、显微受精、细胞核移植、嵌合体胚胎等都要通过胚胎移植获得目的动物。,小鼠胚胎移植主要由以下一些步骤组成：1.结扎公鼠 2.超数排卵 3.同期发情 4.胚胎收集和预处理 5.胚胎移植,以小鼠为例：,1.结扎公鼠的制备

12、为了获得同步发情的假孕母鼠，要准备结扎公鼠，通常选用5周龄公鼠做输精管结扎手术，分笼饲养，每笼一只。术后23周即完全康复，可用其生产假孕母鼠。,以小鼠为例：2.超数排卵 腹腔注射PMSG 10U，一般选择在中午注射，间隔48小时后注射HCG，光照周期保持1214h。,将注射HCG后的母鼠与正常公鼠合笼，并于第二天早上检查阴道栓，如果见栓说明已经配上种了，计做怀孕0.5天。,3.受体同期发情 选择68周龄健康母鼠或经产母鼠为受体母鼠，在给供体母鼠注射HCG并与公鼠合笼的同时，将受体母鼠与结扎公鼠合笼，第二天早上检查阴道栓，有栓的母鼠可用于胚胎移植。,4.胚胎收集和预处理（1）受精卵的收集和处理见

13、栓当日的胚胎处于1细胞期。以脱颈椎法杀死母鼠，暴露子宫、输卵管；剪下子宫、部分输卵管，并置于M2培养液；在体视显微镜下撕开壶腹部，释放受精卵。,用透明质酸酶处理受精卵细胞团,随后在新鲜的、不含透明质酸酶的M2中洗涤4-6次,（2）28细胞胚胎的收集 可取1细胞受精卵在体外发育而成，也可交配后2060小时，输卵管中存在有28细胞期胚胎。此时卵丘细胞已经脱掉，可用1ml的注射器自输卵管伞口冲得胚胎。其基本步骤如下：取输卵管 找到输卵管伞部 将冲卵针插入喇叭口 推压注射器 输卵管另一端收集胚胎 洗涤胚胎 转入培养过程。,（3）桑葚胚与囊胚的收集 交配后6072小时，一些致密的8细胞胚胎已进入子宫。而

14、桑椹胚和囊胚的收集则一定要从子宫中获得。采集方法：剪下子宫，在宫管结合部插入冲卵针，推入冲卵液，在子宫 的另一端收集胚胎。,以小鼠为例（4）胚胎移植,输卵管移植 用5戊巴比妥纳（0.40.6mL/只）麻醉受体母鼠，剪去背侧毛 胚胎：2-8 cell;受体：刚交配的假孕母鼠,用手术剪切开小鼠的皮肤、肌肉、打开腹腔，暴露卵巢、卵巢脂肪垫，并用镊子夹住脂肪组织，把卵巢、输卵管和一部分子宫角慢慢拉出。,将小鼠及其暴露的输卵管放在解剖显微镜下，找到输卵管膨大的壶腹部,用移卵管吸取胚胎，次序为石蜡油、空气泡1、培养液、空气泡2、胚胎(尽可能少带入培养液)。空气泡3、培养液。,子宫移植 胚胎：桑葚胚或囊胚；

15、受体：交配后3天的假孕母鼠 麻醉、剪毛、消毒；背部近中线处，最后肋骨水平上，纵向切开皮肤、腹壁，在白色脂肪体上方开一小口剪开腹膜，用钝镊子夹住脂肪体，从切口拉出，继之卵巢、输卵管、子宫相继被拉出，并小心地移入体视显微镜下。,用钝镊子轻轻夹往子宫上端，并用针头在其下的子宫壁上扎1小孔。注意不要触及血管。并保证针扎入子宫内腔。轻轻拔出针头，沿该孔将移植管插入约0.5cm，轻轻吹吸管，使培养液后面的气泡达到吸管末端。这时，所有的胚胎就已移入子宫内。子宫、卵巢、输卵管推回腹腔，复位、缝合。,第四节 胚胎培养,胚胎培养就是在体外仿造类似于体内条件的环境，使胚胎在体外得到与在体内一样的正常发育，这是胚胎工

16、程研究与应用中非常重要的步骤。,胚胎培养的应用,(1)末成熟卵通过体外培养，使卵子成熟后，进行体外受精。(2)受精卵经培养成为卵裂球以后，可以提供胚胎移植或冷冻保存。（3）冷冻胚胎解冻后，经过培养，然后再提供胚胎移植（4）为胚胎的体外操作提供了时间,（4）通过胚胎培养的实践，不断完善胚胎培养条件，逐步地揭示胚胎细胞的新陈代谢、发育生长等生命活动中更深刻的奥秘。（5）导人外源基因的受精卵培养到卵裂球后再实施移植可提高成功率。,自从开展体外培养胚胎技术研究以来，最为成功的有大鼠、小鼠和家兔的胚胎培养：大鼠胚胎可以培养到体节期 小鼠胚胎体外培养可以维持10d，相当于小鼠妊娠期的一半。这时从囊胚期一直

17、培养到建立了卵黄囊循环，脑部表面划分，已见肺、肝和背胰原基。,embryo on Day 3 of culture,embryo on Day 5 of culture,第五节 胚胎冻,Whittingham1971年首次报告冷冻小鼠胚胎获得存活，继而研究冻存免胚胎也获得成功。,胚胎冻存的意义：低成本的物种保存 方便胚胎移植 为改良品种和培育新品种及品系提供支撑。,工具：冷冻管,方法：避免形成冰晶，破坏胚胎细胞内结构1.慢速降温法2.快速降温法（1）二步法（2）一步法,保护剂：甘油，1,2-丙二醇，DMSO仪器（慢速冷冻）：大型冻存仪,第六节 胚胎分割,由于发育初期胚胎细胞具有全能性，采用合适

18、的方法把胚胎分成两个或多个部分，每一部分都具有发育成完整个体的能力，为胚胎中单个卵裂球的全能性，培育遗传型相同的动物做了初步探索。,应用：1.与核移植相结合，在实验动物方面可以培育出超纯系动物2.对小鼠、家兔、山羊等实验动物胚胎分割后，可以获得同卵孪生后代3.对濒临灭绝的珍惜动物也可以采用这项新技术进行抢救,问题探讨,用什么来分割?分割什么时期的胚胎?分割的具体操作?,.讨论,.时期,方法：1.用玻璃管拉成细丝，再制成切割刀，在显微操作仪的机械手上施行分割或分散胚胎。2.如条件较差，可徒手制成玻璃细丝，成为切割刀，在解剖镜下徒手切割。,对囊胚阶段的胚胎进行分割时，为什么要将内细胞团均等分割?,

19、影响分割后胚胎的恢复和进一步发育（若分割时不能将内细胞团均等分割，会出现含内细胞团多的部分正常发育的能力强，少的部分发育受阻或发育不良，甚至不能发育等问题。）,思考题,能否无限分割？如8,16,32等胚胎？目前2细胞和囊胚比较成熟,第七节 体外受精,在实验动物中进行体外受精，一般都着眼与基础理论研究性质，如为受精生物学、发育生物学和繁殖学的基础研究提供实验模型。体外受精获得的动物，人们通常称试管动物。,精子与卵子的获取,精子来源：大、中型实验动物，一般通过人工按摩采精或假阴道采精 小型实验动物都是通过手术，从驻精囊和输精管内取得成熟的精子卵子来源：在小动物中（如小鼠、大鼠和地鼠等），经过超排后

20、可通过手术，从卵巢或输卵管中取得 大中型动物可通过腹腔镜吸取卵泡中的成熟卵子；通过屠宰场获得卵巢，从中取得成熟卵和未成熟卵，未成熟的卵可以在体外培养成熟。,卵子成熟 在成熟培养液（M199或NCSU-23）中，将收集的未成熟卵培养至成熟期（第2次成熟分裂的中期，出现第一极体）,精子获能 让精子在体外获的受精的能力：采集精子，用培养液（如SP-TALP）洗涤精子，除去精清，然后在获能液中（20 g/ml Heparin的mDM液）获能。标志：顶体反应,受精 将成熟的卵子与获能的精子共培养，实现精卵结合。标志：第二极体的排除。,一个卵子是否有多个精子进入？,某些超级精子会进入，多精入卵时，一般也只

21、有一个精核和卵核相结合，其他的以后就退化消失。多精入卵的有鸟类、爬行类及昆虫等少数生物。多精入卵在哺乳动物是不能发育的，鸟类可以发生多精入卵，但只有一个精子能和卵结合，最后还是一精一卵的结果，其余的精子最终都消失了。,第八节 显微受精,显微受精：又称单精注射，是指用显微操作仪将单个完整精子或精核注人卵周隙或卵胞质中，激活卵母细胞并完成受精作用。特点：显微受精过程不受精子的数量、活力及形态等因素的影响而单精迅速完成受精过程。,这是一项冲破观念的研究。用这一方法，在实验小鼠首先取得成功，移植这种受精卵获得小鼠后代。甚至用不活动的兔子精子注入胞质中，也能获得仔兔。用这种方法，使一对不育的夫妇得到异性

22、双胞胎。还有人用两次冻融后的死精于注入胞质中，获两头牛犊。1993年，我国首次获得显微受精仔免。,第九节 卵的激活与孤雌发育,昆虫，常发生生理性孤雌生殖 家蚕：偶发性的孤雌生殖 蜜蜂：经常性的孤雌生殖，受精卵发育成雌蜂，非受精卵发育成雄蜂 蚜虫：周期性的孤雌生殖；冬季将要来临的时候才产生雄蚜，进行雌雄交配，产受精卵越冬；而从春季到秋季连续十余代都以孤雌生殖繁殖后代。,使用物理(电)与化学(乙醇)刺激(人工激活)，象精子一样可引起卵子激话，出现细胞内Ca2+的动态变化，启动第2次成熟分裂排出第2极体，原核形成和卵裂等一系列变化。锤头鲨出现过孤雌生殖的现象。植物中黄瓜不经过传粉受精就能结果。而在英

23、国的切斯特郡立动物园在2006年5月间，一只单独饲养的雌性科莫多龙flora居然发生了孤雌生殖的奇特现象,思考孤雌生殖个体基因组是单倍体还是2倍体？答案：都有可能（蛾、蝶 中均有发现)单倍体”（雄蚁，它是由蚁后的未受精卵发育成的）要产生工蚁和雌蚁怎么办？为何要有性生殖？无性生殖（包括哪些？）或者孤雌生殖有何不好？不用谈对象多好？,高级哺乳动物能否 孤雌生殖？2004获得 小鼠并成功怀孕,第十节 胚胎干细胞,当受精卵发育成囊胚时，内细胞团（Inner cell Mass），胚胎干细胞具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。,将ES细胞体外诱导分化，获取所需细胞 将ES细胞注囊胚可

24、参与内细胞团形成嵌合体，如果ES细胞参与形成嵌和体的生殖细胞，便可使导人的外源基因传给子代。这是制作转基因动物以及基因敲除动物的胚胎学基础。,囊胚显微注射,以ES细胞用于研究细胞分化、组织发生、基因表达与调控、目的基因的定位整合等，是十分理想的材料。1981年，小鼠胚胎干细胞系首次建成以后，仓鼠、猪和牛等的胚胎干细胞系，也相继建成，并且产生了嵌合体小鼠(出现毛色嵌合)。,第十一节 细胞核移植与克隆技术,核移植技术起源于用微细玻璃管对阿米巴原虫进行的核注射，核移植技术的发展史几乎就是克隆技术的发展史。最早建立的克隆技术史两栖类的克隆技术。1952年，Briggs和King将蛙胚胎细胞核注射到卵内

25、，构建重组胚，使之发育成蝌蚪和蛙，即克隆蛙。,哺乳动物的核移植始于1969年1981年，Illmenser和Hoe把小鼠胚胎内细胞团的细胞核移植到去和的受精卵中，成功的克隆出3只小鼠。1986年，Willadsen等用未分化的胚胎细胞克隆出一只核移植绵羊1994年，First用发育到晚期阶段的牛胚胎细胞进行克隆成功。,1997年，Wilmut等利用成年绵羊的乳腺上皮细胞作为核供体，克隆出1只活绵羊，命名为“多莉”（Dolly),引起了全世界的轰动，因为它是人类科学技术上的一大突破，从成年体细胞克隆哺乳动物在生殖医学、生物技术和治疗某些疾病方面开辟了重要的进取之路。,综上所述，动物克隆技术主要有

26、两种：,克隆猪的制备过程,核移植（Nuclear transfer）,世界10年克隆研究之路,从“多利”到“斯纳皮”,1996年 第一只成年体细胞克隆羊“多利”诞生1997年 一头用胎盘克隆而成的荷兰牛亮相。1998年 两头由母牛细胞克隆而成的小牛在东京出生。一个国际研究小组宣布克隆出了三代实验鼠 2000年 曾参与克隆“多利”羊的英国公司培育了第一 批克隆猪 2001年 一头稀有品种的克隆亚洲牛诞生，两天后死亡。2002年 法国研究人员克隆出兔子 2003年 美国科学家推出了一匹克隆骡 爱荷华州的研究人员称他们克隆出了一头濒临灭绝的爪哇 野牛 2004年 美国加利福尼亚的一家公司培育出了第一

27、只克隆猫。这只 猫后来成为第一只被卖出的克隆宠物。2005年 韩国科学家宣布他们培育出了首条克隆狗叫“斯纳皮”,效率较低：3%;发育障碍：如呼吸障碍（respiratory failure）、临产期生长失控(loss of neonatal growth controll)、胎盘过度增生（placetal overgrowth）、围产期死亡（neonatal mortality），以及克隆动物出生后所出现的不可预知的发育障碍等；克隆动物基因组表观遗传学状态（epigenetic state)，尤其是基因组印记（geneomic imprinting)异常,克隆动物存在的问题,思考题,1、超数排卵的方法？2、胚胎移植的方法？3、胚胎保存的方法？4、为何克隆动物寿命短，有的克隆动物皮毛颜色不一致？5、哪些动物能孤雌生殖？高等动物为何不能不行？5、能否克隆人？,