3蛋白质分析.ppt

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1、1,第三章 蛋白质分析,硫魔蔓屯枚啊阴肠辊笼昌旅跨脾串斯耐勘善虐芽诲亚伤舒契管菜蜡虽垮苛3蛋白质分析3蛋白质分析,2,蛋白质是指主要由-氨基酸组成的一类高分子化合物，其数目数以千计。有时需要对蛋白质的总量进行测定，但有时又需要确定蛋白质混合物中的一种，因而测定其总量的方法便不适用。所以，蛋白质测定方法或者是针对所有蛋白质的，或者是针对其中个别蛋白质的。特异性的方法或者是依赖于分析样品的制备步骤，或者是依赖于待测蛋白质的某些特殊的性质。,歧哪孽鲤净剁隋狞船矫顷绑砾挝添溪怔订怨臻笺披驴吾慑群竣伍哇种爹翟3蛋白质分析3蛋白质分析,3,对于具有生物功能的蛋白质的定量(如激素)，由于蛋白质变性的存在、总

2、量的测定有时并不能真正地反映其生物活性。对这类蛋白质的定量可选择化学定量法或生物分析法。对于酶，通常是测定其活性，而不是测定其蛋白质的含量。在蛋白质分析化学中，除了定量分析之外，还有许多分析问题涉及蛋白质的构型或不同层次的结构研究，蛋白质氨基酸序列的测定等。,挚镶礼备掇呈蛀常募绑棋嘴芬恢抖蹄酗甘谊撬章浪讲逛剪猾迎捶晋悯铺带3蛋白质分析3蛋白质分析,4,由于蛋白质种类繁多、结构复杂、生物活性各异，一种蛋白质并非单一基因所表达的产物，并且同一蛋白质还存在多种翻译后的修饰，蛋白质分析正处于发展阶段。蛋白质分析必须满足以下基本要求:()高效提取并分离所有蛋白质组分，()准确鉴别和定量分析每一组分，()

3、能比较分析表达图谱的复杂变化，其中蛋白质所有组分的完全分离是蛋白质组研究的前提。,颂疹霸脸秦排沸碾簿码丑喝么枯朔次称慑转霄才邻稼处鳞硕线造芬届惦睦3蛋白质分析3蛋白质分析,5,3.1.蛋白质的分类及结构,蛋白质的基本组成单位氨基酸的结构 虽然在各种生物体中发现的氨基酸有180多种但组成蛋白质的常见氨基酸只有20种，且除了脯氨酸和羟基脯氨酸为-亚氨基构型外，其余均为-氨基构型。非蛋白质氨基酸中的氨基均不在氨基的位。除了甘氨酸之外，其余氨基酸的-C原子都连接有四个不同的取代基，因而-C是具有手性的，即每种氨基酸都存在两种互为影像的对映异构体，分别用D或L来标识。尽管在自然界中也存在R构型的氨基酸，

4、但组成蛋白质的氨基酸却都是L-构型的。,氓墟粕拆吨搀功括阀尹秆贴钙净荒赡掐氯蘑党书稠烛培隔卡嘲烬津暖查烹3蛋白质分析3蛋白质分析,6,组成蛋白质的氨基酸的简写及等电点pI,锗挤驱瓢者忌栗拙裔睬籽黄饰侈谬掉讣一萍撤嫉等仰粕映慌坍吓况仟遇所3蛋白质分析3蛋白质分析,7,湃脯扁现穷酬荔歧者位随法猛榆听角懦尤松坎厘萧并淄撅抖灯红巩稍挟亿3蛋白质分析3蛋白质分析,8,3.2.多肽的结构 氨基酸之间通过各自的氨基或羧基缩合，以酰胺键(即肽键)形成的氨基酸聚合物片段称之为多肽(Polypeptide)。多肽键的形成使氨基酸失去了氨基和羧基，分子的保留部分(残基)是蛋白质结构中的主要组分。但氨基酸在多肽链的每

5、一端或者保留一个氨基(N-末端残基)。或者保留一个羧基(C-末端残基)。在蛋白质或多肽序列中规定N-末端残基的编号为1。,眠钩碍蚕鹤尹占拔门或蝎寒炸吩叙亢也榔想亩相种呕寅诞睬隐忻扩瑚中巳3蛋白质分析3蛋白质分析,9,由6-30个氨基酸通过肽键形成的寡聚物称之为多肽，但氨基酸残基数达到40或更多(分子量5000以上)时，这种肽便具有蛋白质的性质。当然，在分子量方面，多肽和蛋白质并没有严格的界线。一般认为，多肽与蛋白质的根本区别在于蛋白质一般含有螺旋结构以稳定蛋白质的总构型；而多肽一般却没有这种结构，其构型有很大的可变性和可塑性。,坟磋盂蒜鹰抄碘冗苟擂淆荔郡邹抛缓滓岿珐残旅念赃搞秘虽长纱范筐伞督3

6、蛋白质分析3蛋白质分析,10,3.3.蛋白质的分类 蛋白质由一条或多条多肽链组成，它在空间具有特定的走向与排布。生物界的蛋白质数目估计在10101012数量级。如此众多的种类是由于20种氨基酸在肽链中的不同序列决定的这种序列异构现象是蛋白质生物功能的多样性及种属特异性的基础。按蛋白质化学组成的不同，将其分为简单蛋白和结合蛋白两大类。,雾敦监铆饿盖伦咒鸦跟诱氟员晰檀铀复博嫩快粗票讯唾哼傲洗来沙谁砸历3蛋白质分析3蛋白质分析,11,简单蛋白完全由肽链组成，它又可分为7类。,(1)白蛋白(Albumins)；又称清蛋白，易溶于水、稀酸和稀碱溶液中，分布于血液、肌肉、蛋清及植物种子中。(2)球蛋白(G

7、lobulins)：又分为优球蛋白和拟球蛋白，前者不浴于水，后者溶于水。球蛋白存在于各种生物体中。(3)组蛋白(Histones)：溶于水及稀酸。分子中含精氨酸和赖氨酸较多，如小牛胸腺蛋白等。(4)精蛋白(Protamines)：溶于水及稀酸，多存在于精子之中，如鱼精蛋白等。(5)谷蛋白(Glutelins)：不溶于水及稀盐溶液，存在于植物种子中如米谷蛋白，麦谷蛋白等。(6)醇溶谷蛋白(Prolamincs)：不溶于水及乙醇溶于70一80的乙醇溶液中，存在于禾本科植物种子中，如小麦醇溶蛋白，玉米酵溶蛋白等。(7)硬蛋白(Scleroproteins)：又分为角蛋白、胶原蛋白及丝心蛋白、均不溶于

8、水、稀酸和稀碱中。,辫父捏复尤芽阿滇怜苔酚省像戮展幼蒂掸毕衬马旅惊岗猖涕新蜗吵逻吏痕3蛋白质分析3蛋白质分析,12,结合蛋白由简单蛋白质和非蛋白质成分组成。按照非蛋白质的不同又可分为下述7类。,(1)糖蛋白(Glycoproteins)：与糖类共价结合的蛋白质，种类繁多，如血型糖蛋白，粘液糖蛋白和激素糖蛋白等。(2)核蛋白(Nucleoproteins)：与核酸结合的蛋白质。如DNA核蛋白、核糖体等，(3)脂蛋白(Lipoproteins)：与脂类以次级键结合的蛋白质。脂类成分包括磷脂、胆固醇、中性脂等。(4)磷蛋白(Phosphoproteins)：与磷酸共价结合的蛋白质，主要存在于蛋黄和乳

9、中。(5)金属蛋白(Metalloproteins)：与金属离子直接结合的蛋白质，如铁蛋白，含铜和锌的超氧化物歧化酶等。(6)血红素蛋白(Hemoproteins)：与血红素结合的蛋白质，如血红蛋白，肌红蛋白。(7)黄素蛋白(Flavoproteins)：与黄素核苷酸结合的蛋白质，如黄素氧化蛋白。,藕肚姚戍部悄辰赦署国篇坞艳钻比肿棚些噪廷借滔闻离砰罢煽采呐谴筹赞3蛋白质分析3蛋白质分析,13,蛋白质的分子量范围变化较大，大约在61031106之间。对于不含辅基的简单蛋白质分子，每个分子中所含氨基酸残基的数目可通过用110除以分子量进行粗略的估计。组成蛋白质的20种氨基酸的平均分子量为138，但

10、在大多数蛋白质中较小的氨基酸占优势。因此，其平均分子量接近128。又因每形成一个肽键要失去一分子的水，一般蛋白质中氨基酸残基的平均分子量约为110。,劲逊抡务炊褥篮笆共缓榔盏吓怯赣障谣寸瓢件桩氯坦狈井瞩跑裹弛漏址烧3蛋白质分析3蛋白质分析,14,蛋白质的性质及功能取决于其结构。深入了解蛋白质的结构对于生物化学及分析化学家来说都是非常重要的。蛋白质的结构具有不同的层次，一般分为一级、二级、三级和四级结构一些蛋白质不具有四级结构，如肌红蛋白、溶菌酶、细胞色素c和羧肽酶A等，有些较大的蛋白质具有四级结构，如血红蛋白和乳酸脱氢酶等。,3.4.蛋白质的结构,滑章岛莹壹汗找囊玖法皮斩携竖谭拌孽底监川乎惫君

11、闭躇蛙舱追朵琵萨聚3蛋白质分析3蛋白质分析,15,蛋白质的一级结构是指肽链中氨基酸的序列以及二硫桥的位置。,人胰岛素的一级结构,貉韦盔膏供朽扳翌传诣呐贴泽蕾但美那嘴哈栋庭葵涂刮忆蚁弛呆徐笛刨怒3蛋白质分析3蛋白质分析,16,蛋白质的二级结构 一条多肽链或链的一部分依靠氢键维持的局部有规则的构型称之为二级结构。,蛋白质的三级结构 蛋白质的三级结构定义为它的总体结构。,蛋白质的四级结构 蛋白质的四级结构是指寡聚蛋白质中不同种类和数目的亚基在空间的排布及亚基之间的相互作用。,恐制妄崖侯倒咎妨韵摧枢衙疑应敲倍猩值涉视运旨命剥砌瓣找逛特啪抽昔3蛋白质分析3蛋白质分析,17,球蛋白的三级结构(a)和胶原蛋

12、白的三级结构(b),任地挞乾蔗八足缸渗吻裹忽哗鄙逸僧墓焦忿勿电婆沁应日淤循虞狗稼职杭3蛋白质分析3蛋白质分析,18,蛋白质的四级结构示意图,搀斟砾傈饿幌莉价更呀韦荒库冰警饮霉戒贪兽饿柳雅该葬俐晋牛侵俱蕴取3蛋白质分析3蛋白质分析,19,蛋白质的变性可以描述为：天然蛋白质分子在外界因素的作用下，由紧密有序的结构变成松散无序的结构，并使得蛋白质的物理、化学性质及生物活性发生变化的现象。变性只涉及次级键，二硫键的断裂一般不涉及一级结构的变化。蛋白质变性之后，其物理性质(如溶解度，旋光性，吸收光谱)，化学性质(如水解速度，化学反应能力)以及生物功能(如酶的催化活性，激素的生理调节功能，抗原抗体反应的专

13、一性等等)都会发生变化。因此，蛋白质变性对蛋白质分析来说是一个非常重要的、经常要考虑到的问题。,本鞍刨预及恶敲毗眠班腕稍徒弹喧外皇右喀丫夏拾相链甭垢龙喊怂炼络姑3蛋白质分析3蛋白质分析,20,能使蛋白质变性的因素很多，其中比较重要的包括以下几种：,热变性 由于加热而引起的蛋白质变性称之为热变性。一般的蛋白质在5060以上便会发生热变性。,酸和碱变性 蛋白质一般在pH 410范围内稳定，超过这个范围就会发生变性。,尿素和盐酸胍变性 这两种试剂是常用的蛋白质变性剂。,表面活性剂变性 表面活性剂SDS很容易与蛋白质结合，并使蛋白质发生变性，与脲和胍不同的是，浓度很低的SDS就可以使蛋白质变性。,了飘

14、谩热砚用柑庭吟此滔估峰养荣窑到屠醇停雾犁蝉斩膛驹申声阜昼多戏3蛋白质分析3蛋白质分析,21,3.5.蛋白质分析的意义,一、基础科学研究 这主要是生命科学研究向分析学家提出的课题。在生命科学研究中，人们需要了解各种蛋白质的组成、结构与功能的关系，蛋白质的存在形态及与小分子，甚至金属离子的相互作用等等。而对分析化学家来说，蛋白质分析是一个难题，因为蛋白质分子量大(分子量一般为60001000000)，结构复杂(有四级结构)和种类繁多(约有10101012种)等特点。这些持点决定了蛋白质分析与小分子为对象的分析区别甚大。因此，分析化学家要不断地针对蛋白质的特点去发展新的理论，创造新的实验手段和分析方

15、法。,疡个糖兆珐缩蚕汉羡苟菇缆熟凋烬药氨源摔募玛居崇忆肘钟琳仔榴忽户捍3蛋白质分析3蛋白质分析,22,二、食品的鉴定与评价 蛋白质是生物体的重要营养物质，也是食品的重要营养指标。人及动物只能从食品中得到蛋白质及其分解产物来合成自身的蛋白质。蛋白质可以被酶、酸或碱水解，水解的最终产物是氨基酸。氨基酸可以进入蛋白质的代谢库重新被利用。氨基酸是构成蛋白质的基本物质。在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸及缬氨酸这8种称为必需氨基酸，它们在人体中不能合成，必须依靠食物供给，它们对人体有着非常重要的作用。各种食品中的蛋白质含量差异甚大。如牛肉中蛋白质的含量为2

16、0%左右，猪肉为9.5%，牛乳为3.5%，大豆为48%，大米为8.5%，菠菜为2.4%，黄瓜为1.0%，桃为0.8%，苹果为0.4%。因此，测定食品中蛋白质的含量对指导食品的加工工艺的改革、优化保健食品的配方以及合理配膳均有重要意义。,纲吁铅擎带咸烛忽涨榆袄商访晤县芭女枷饮钓炊裂弦亲橇煮钝肤秩檀婚盅3蛋白质分析3蛋白质分析,23,三、评价健康状况、诊断疾病 人体内的酸碱平衡，电解质平衡，遗传信息的传递，物质的代谢和运转都与蛋白质有关。蛋白质不仅是血浆的主要成分，而且也分布于各种细胞的外液，关节滑液，脑脊液等等。,耘枕崎秉糊烹袁蔬喜故森个质攀壶壤忽绕情邦件炔称纂韦阔叛雨钉耀官汤3蛋白质分析3蛋白

17、质分析,24,血浆蛋白质的成分复杂，多达三百余种，许多种蛋白质的含量随疾病的不同有所增减，在临床诊断上具有重要意义。,境摹暮常镀弟膜姓骡硕南翔邦乖增倾换恤狱嘉掌之竟含讣试晕洋犁走痹锤3蛋白质分析3蛋白质分析,25,总蛋白升高，可考虑各种失水导致血液浓缩的疾病，多发性骨髓瘤，巨球蛋白血症等等。血清总蛋白降低，可能是体内水分过多，多渠道血清蛋白丢失，如肾病综合症，营养不良，蛋白质合成障碍等。球蛋白升高：多见于多发性骨髓瘤及某些淋巴瘤、肝硬化、血吸虫病、疟疾等等。球蛋白降低：可考虑低丙球蛋白血症和肾上腺皮质功能亢进等。,轩麻泄逼郎页歌夯耀窃狮抄腰址油胯蕾啥舌娩声褥螺慢猿旗片棋牙灶混镍3蛋白质分析3蛋

18、白质分析,26,3.6.蛋白质定量分析方法,在生物研究、以及医药和食品等行业和临床诊断领域中，蛋白质的定量分析是常检项目和重要指标。,猩痉锅宋看猾泡跨偏稼海想馒矛鬃疗烩践寓蛹劝垛镐借痉调赶诅芍辖抡瞄3蛋白质分析3蛋白质分析,27,蛋白质的测定方法很多，常用的方法可以分为三大类：一是基于蛋白质与一些物质的化学反应所建立的化学法；二是根据蛋白质的生化性质所建立的生物检定法和免疫法；三是依据蛋白质与不同试剂的反应和仪器测试技术所建立的仪器法。化学法操作较为简单，常用于微量蛋白质日常的快速分析；后两者通常配合高灵敏度的精密仪器，一般用于痕量或超痕量蛋白质的分析。,楼混议喧旁豌吝大忱甫捧巳灭盘锡魏萤蹈伎

19、忿墟谭盏疽浪晚扑现倔饥孤吩3蛋白质分析3蛋白质分析,28,蛋白质分析方法可分为两大类，一类是利用蛋白质的共性，如含氮，含肽键和折射率等性质测量蛋白质的含量；二是利用蛋白质中某些特定的氨基酸残基、芳香基团、酸性和碱性基团等测量蛋白质的含量。迄今，测定蛋白质的分析方法有多种多样，如克氏定氮法，金属络合物，染料做探针的各种分光光度法，荧光染料做探针的荧光分析法，化学发光分析法，气相色谱分析法，液相色谱法甚至发展了全自动的氨基酸分析仪。,昔叙剿言袱砖药擎蠕午乱冯桃焕肛薛势站游流孔滩悯赵抓随戌环蹋奠笛桔3蛋白质分析3蛋白质分析,29,迄今，测定蛋白质的分析方法有多种多样:克氏(凯氏)定氮法，金属络合物，

20、染料做探针的各种分光光度法，荧光染料做探针的荧光分析法，化学发光分析法，气相色谱分析法，液相色谱法甚至发展了全自动的氨基酸分析仪。,网沈涂唆忽壶撂痔途玩沪肥烤勒浮晨锣殊谅跃萤咽冬两总健箍燕筒律原史3蛋白质分析3蛋白质分析,30,1 光谱法 根据蛋白质自身的光谱性质，可以对蛋白质定性和定量分析的光谱方法有紫外光谱法、荧光光谱法、圆二色光谱法、激光拉曼光谱法、NMR及X射线衍射分析法等。其中大多数方法主要用在蛋白质结构研究方面，下面只对前两种可用于蛋白质定量分析的光谱方法进行简单的介绍。,幅撂逗熏伙爵旋豁晴颈营瑚炽闰杰误酣滓绿裤钢蔓壳冷途钙动酮诵臼庶陷3蛋白质分析3蛋白质分析,31,紫外光谱法 由

21、于蛋白质中存在芳香族氨基酸，一般的蛋白质在280 nm附近有一个最大吸收。根据此吸收可以对蛋白质进行定量分析。这种方法不是一 种绝对方法，因为不同蛋白质的氨基酸组成会不同，因而不同蛋白质的摩尔吸光系数不同。,参涉租江据掷杉裴货担撩泰锦饮锄哺享遇相獭支毖钙缕纵惰宴搞斡开夷逼3蛋白质分析3蛋白质分析,32,三种芳香族氨基酸及蛋白质的紫外吸收光谱(a)Trp,Tyr and Phe;(b)protein,倾彭扣咱翻猜即愈镣灼屑溃炔捣慧地鞭韵逸桌我氢笋空墒逝扣墙谎复逻秸3蛋白质分析3蛋白质分析,33,蛋白质易受核酸的污染，核酸在260nm附近有强的吸收。为了消除核酸对蛋白质测定的干扰，可分别测定样品在

22、260和280 nm处的吸光度值，然后利用两波长下的吸光度差计算蛋白质的浓度。蛋白质的浓度一般依据下列两个经验公式计算：,优点：操作简单缺点：干扰多,Lowry-Kalekar 公式：蛋白质浓度(mg/ml)=1.45A280-0.74A260Warburg-Chritian公式：蛋白质浓度(mg/ml)=1.55A280-0.76A260式中 A260和A280分别代表样品在260，280 nm处的吸光度,资歼黄畴密珊蹄界凶秋骤啡糙妨陵营罚潭配桓津澡捉秦诽吏逞确乎冗哥锯3蛋白质分析3蛋白质分析,34,与吸收光谱法相关的研究主要包括以下两方面：(1)导数法用于蛋白质的定性和定量分析，如蛋白质及

23、天然芳香氨基酸的鉴别；(2)蛋白质结构及构型的研究。当蛋白质的构型发生变化时，蛋白质生色基团所处的微环境发生变化，其吸收光谱随之发生变化，吸收峰将发生红移或蓝移。利用UV差谱可以获得蛋白质构型变化的信息，如利用溶剂微扰差谱可以探测蛋白质分子中生色基团的暴露程度。,陀赤蔼辅剂茅疑伶百饵傀编镣周蹿必拇笆棍迁箍清毖匡买哨桥艰那挂地肘3蛋白质分析3蛋白质分析,35,荧光光谱法 蛋白质的荧光来自于具有紫外吸收的三种氨基酸，即酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。这三种氨基酸的最大荧光发射波长分别是303、348和282nm。当这三种氨基酸的浓度相同时，色氨酸的荧光强度最大，苯丙氨酸的荧光强度非常弱。因此，蛋白质的内

24、源性荧光主要是酪氨酸和色氨酸残基的综合贡献。值得指出的是：核酸相对于蛋白质其内源性荧光极弱，所以对于蛋白质的定量一般无影响。用荧光法对蛋白质进行定量比紫外分光光度法灵敏，且没有核酸的干扰，来自其它小分子化合物的干扰也相对较小。所以，常常在中性水溶液中于280 nm处激发，在340-350 nm附近检测荧光强度以便对蛋白质进行定量、半定量或定性分析。,剪禽馈锚皑庭澜肾超斗秩矮痈诊师蛰爵喇真浪驹切屎酱卫立冷汪犹伟策利3蛋白质分析3蛋白质分析,36,虽然荧光法具有灵敏度高的特点，但其缺陷也是显而易见的，不同蛋白质中荧光氨基酸残基的含量可能会有很大的差别，因而定量时要选择同一种蛋白质作为标难。,酪氨酸

25、、色氨酸和苯丙氨酸在中性水溶液中的荧光发射光谱,旦艘有桌啼仪严纶藻擦洒杠兑和锥裤弟菊穷脊鲸尖揖才爱毫权蕉谣韭剐就3蛋白质分析3蛋白质分析,37,2 化学方法 蛋白质在可见区无吸收，故在可见区无法利用蛋白质自身的光谱性质进行分析。但在紫外区有吸收的干扰物质很多，为此，人们努力寻找一些方法，以便避开紫外区的干扰。例如，人们发现蛋白质可以与许多化学试剂(如染料，金属离子，又称之为“光谱探针”)发生相互作用，引起探针分子光谱性质(吸收光谱，荧光光谱)的变化。借助于这些蛋白质光谱探针，目前已经发展了一系列分析方法，可以测定微量蛋白质的含量，甚至用于研究蛋白质的结构与功能之间的关系。,桨怀钓暴漓籽纫橡买吗

26、驻触画擞曼梆田踞瘪憨幢侦畴攘阂幽币眉捕浴赶缮3蛋白质分析3蛋白质分析,38,凯氏(Kieldahl)定氮法 凯氏定氮法是用于化合物含氮量测定而对蛋白质分析的一种通用方法。当一种蛋白质的含氮量为已知时该法也可用于蛋白质的定量分析。但由于非蛋白含氮污染物的存征，这使得该方法用于蛋白质的定量分析复杂化。消除干扰的一种比较有效的方法是将蛋白质沉淀，然后测定沉淀蛋白质中氮的含量，据此确定蛋白质的含量。,袭殃丢雄饶晚尘窒睦葫齿胁涧伸崭亿判苞诛钒坦芜相哥磺皿贯疆捷俩隆拭3蛋白质分析3蛋白质分析,39,蛋白质中氮的含量一般取15。该值对蛋白质的混合物来说比较接近但对于单一的蛋白质，该值会有一定的差异，特别是当

27、蛋白质中含有较多的碱性氨基酸残基或者是一种结合蛋白时更是如此。,不同来源蛋白质中氮的含量来源 氮含量/%转换因子*肉类 16.0 6.25血浆 15.3 6.54牛奶 15.6 6.38面粉 17.5 5.70蛋类 14.9 6.68*样品中氮的含量乘以转换因子即得样品中的蛋白质的含量,沫贺弧培氮割爷苦殷庞牺框厄煽廓虽瞧掇磊潞禹同乱罕硅肛颅刃推寥敬亥3蛋白质分析3蛋白质分析,40,凯氏定氯法的原理 所有的含氮化合物在浓硫酸和催化剂(通常为铜离子)的存在下加热转化为氨，氨与硫酸作用生成硫酸铵而稳定存在于溶液中。这一消化过程非常重要，一般需要几个小时，反应开始时溶液逐渐变成棕色或黑色，并且放出二氧

28、化硫气体，溶液最终变成无色透明，之后还需反应两小时。反应完的溶液冷却、碱化，用蒸汽蒸馏法蒸出氨，并用含指示剂的标准的硼酸水溶液吸收，然后用标准氢氧化钠溶液滴定硼酸溶液中铵离子，使之恢复到指示剂原来的颜色，这样便可以测定出样品中氮的量，最后根据蛋白质氮的含量计算蛋白质的浓度。,佬雇租汗粮戍汗寇人齿荧固限寓罚脏裴帖浑沸柠兜锣瓜半绪帝都鸿肆逊财3蛋白质分析3蛋白质分析,41,凯氏定氮法测定的是总氮的含量，采用蛋白质换算系数，得到的是“粗”蛋白质含量。因为样品中常含的核酸、生物碱、含氮脂类、卟啉等非蛋白质的含氮化合物，所以这些杂质如果存在的话也都会被同时测定，因而带来误差。该法常用于动、植物食品中蛋白

29、质含量的测定。由于方法较复杂，费时，临床常规分析很难应用。经改进，已发展了一种“自动凯氏定氮法”。自动凯氏定氮仪具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和自动滴定装置及自动数字显示装置等。大约在两小时内可完成8个样品的测定，具有灵敏、快速、样品用量少等优点。,峻孔攀届褐钓郑矮廊芭更坯纳擞答斯予彝秽终垄收霉椒巫涨羔纺廖搏挽倘3蛋白质分析3蛋白质分析,42,三聚氰胺(Melamine),俩豁幕竭堤嫡佬巢曙嗓惊聚世闷痕阜苑韩粕迸据贰怂迸酒祁巳抢锑恫轩垦3蛋白质分析3蛋白质分析,43,双缩脲法(Biuret Assay)它是根据双缩脲在碱性硫酸铜溶液中，铜离子与四个分子双缩脲中的亲核氮原子配位，而形成紫色络合物

30、的现象发展起来的。,双缩脲反应中铜离子与蛋白质络合物的吸收光谱,双缩脲反应所形成络合物的结构,郁安兑彦滤粘箭粮乘涎院钡葡膘瑞修级守函扯未臻威蔡表奔安内央冗模篡3蛋白质分析3蛋白质分析,44,该方法的最大优点是非常可靠，比较抗干扰，操作简单快速，反应使用单一稳定的试剂液，因而适用于自动分析仪。双缩脲试剂有几种配方，其中之一是Doumas配方，由硫酸铜，酒石酸钾钠和氢氧化钠组成。该显色反应在15min内达到平衡，并可稳定几小时。所有的蛋白质以相同的方式反应，蛋白质种类之间的差别极小，因而是目前较通用的测定蛋白质总量的方法。但该方法的灵敏度低(约1mg/ml)，测定范围为110mg/m1，这使得其应

31、用受到了一定的限制。可用于血清总蛋白的测定。也适用于豆类、油料、谷类及肉类等样品中蛋白质的测定。,珊萤拣左驹吴胶轮林坞幸森苔退湃湾晨低贷挡歇蕴李恢渐锅豪蝎社抗秤窥3蛋白质分析3蛋白质分析,45,Lowry法 Lowry法是Lowry等人于1951年建立的，这是蛋白质测定应用最广，且灵敏度最高的方法之一，其灵敏度可达5g/ml。该方法利用了一种用来检测酚基的Folin(磷钼酸盐-磷钨酸盐)试剂。当使用该单一试剂时可检测蛋白质中的酪氨酸残基，因为该残基中存在酚基。但当该试剂与铜离子结合使用时其灵敏度可大大改善。低浓度的双缩脲试剂与蛋白形成的Cu2+蛋白质络合物可以还原Folin试剂主要成分磷钼酸盐

32、磷钨酸盐到钨蓝和钼蓝。反应产物的详细情况目前尚不清楚，但产物在600800 nm范围内有一个宽的吸收峰。大约75的还原是由Cu2+-蛋白质络合物贡献的，而其余主要是由酪氨酸残基贡献的。色氨酸也有一定的贡献。测定一般在750 nm处进行。,绚娶叠峦林咒潜挑媳聪冯络蘑衙求郴厅膳负览晴尼京乃蔽明栗韦岂铆定釉3蛋白质分析3蛋白质分析,46,Lowry法的优点是灵敏度高，比双缩脲法高100倍。不足之处是费时费力，干扰物质的影响大，可测定蛋白质样品中所含的酚类和柠檬酸等均干扰测定。另外，不同的蛋白质，其中的酪氨酸和色氨酸残基的含量不同，在显色灵敏度方面存在差异。为此，人们还在不断地研究，特别是不同蛋白质间

33、显色灵敏度差异的消除问题，这使得该方法在不断地完善。在实验测定时要注意，Folin试剂仅在酸性条件下稳定，但还原反应是在pH10的溶液中进行的。因此，当Fo1in试剂加入到碱性的铜蛋白质溶液中时，必须立即混合，以便使还原反应在磷钼酸磷钨酸试剂分解之前已经完成。,冕踪趴市坞陨婚咳媚姜勘翌纲新位沸寅膏臭糟悬盾拙碗搂砷坞毒驯柳木屯3蛋白质分析3蛋白质分析,47,1985年，Smith等对Lowry法进行了改进，提出用4甲酸喹啉代替Folin试剂，在碱性条件下，蛋白质与Cu2+反应形成的Cu+与4甲酸喹啉反应生成紫色络合物，可在562nm处进行测定。该试剂比Lowry法的试剂稳定，干扰大大减小，而灵敏

34、度相近。,蛋白质存在下Ca2+与4-甲酸喹啉的络合显色反应,绕评其节论蝗胺羊遥逾汕唯硝痒慢沸贯柏吻哥停辑逆回秸参坤写晌胚仪锻3蛋白质分析3蛋白质分析,48,3 染料结合法 染料结合法在蛋白质分析中应用最为广泛，它基于人们在20世纪初观察到蛋白质使一些酸碱滴定指示剂颜色改变的现象。早期的研究兴趣主要在于pH的测定及酸碱指示剂的胶体误差问题。到20世纪40年代，Klotz等人经过系统研究才认识到蛋白质对有机染料吸收光谱的影响可以用于研究蛋白质与小分子间的相互作用，因而有了生物化学方面的意义。后来，人们进一步认识到利用这种相互作用可以对蛋白质进行定量及定性分析。,灵犊阜此挟舟驰痞雀酋凿炒翼只艺涌绎替

35、泣开邻撕渤储酝糙迅沏他缕活歉3蛋白质分析3蛋白质分析,49,常用的染料包括甲基橙、考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue)、溴甲酚氯和溴甲酚紫、荧光染料等,CBB G-250(A)及其与蛋白质复合物(B)的吸收光谱,溴甲酚绿(A)及其与蛋白质复合物(B)的吸收光谱,很喂燥密油陆鳖缔跳酒墓蜜湖操狞雄鄙笆琉敞灼兔细蜀鸯肆卤汀淡左萧钓3蛋白质分析3蛋白质分析,50,4.分离及生物分析法 前述讨论都是对蛋白质总量的分析，对于某个单个蛋白质的分析，就需要用到分离。最重要的两种分离方法是电泳法和色谱分离法。,曙嘿锈蛤押括怒孝汲镶和恶恕痪野吉伙帖拽爆秋某芜谩键茸词刹饲皂吏班3

36、蛋白质分析3蛋白质分析,51,方法 依据和特性 灵敏度电泳方法 SDS-PAGE 大小 ngg非变性PAGE 电荷及大小 ngg等电聚焦 等电点 ngg色谱方法空间排阻 大小 ngg离子交换 电荷 ngg亲和色谱 特异性结合 ngg基于活性的方法酶活性 催化活性 ngg免疫分析 特异性结合 ngg,蛋白质的测定方法,咸崖尿畦抵鬼诽煤谩部胡倘蛔允氨捞漂撂傀坝狱漱庚眶喀欧获伙纹铲脂吸3蛋白质分析3蛋白质分析,52,3.7 结构与构象研究,蛋白质成分通过各种分离技术分离后，须通过适当手段进行结构和功能以及各蛋白质间的相互作用关系的研究，从而最终实现蛋白质组表达模式和功能模式的研究。,张痊娃舵陶粘加谩

37、贾汗遮厌听傣会油何您篇总驮揽拂针孪恰革捉气犁鸥垄3蛋白质分析3蛋白质分析,53,研究蛋白质结构和构象的方法很多，总体上可概括为两大类：一类是测定溶液中的蛋白质分子构象。如核磁共振法，圆二色谱法，激光拉曼光谱法，荧光光谱法，紫外光谱法，氢同位素交换法。,蛾工阿酉孜粱汇妇发产杀躲役听炸崎羔焉屠颐罚龟馈纽风旺察浸扔镀剪砌3蛋白质分析3蛋白质分析,54,另一类是测定蛋白质分子的晶体结构。如X-射线衍射分析法和小角中子衍射法。X-射线衍射分析法虽然可以较准确地测量晶态蛋白质分子的空间结构，但许多蛋白质并不能培养出单晶；并且生命体中的蛋白质多数以溶液状态存在，与晶体中的结构往往有一定的差别。中子衍射法由于

38、仪器昂贵等原因，目前应用于蛋白质分子的构象研究才刚起步。,路还均打佰桩要狄瞒纹其沼别沤润奄桨霞鸿仰尝崔又傀孙盖诞跨肩秆漓涵3蛋白质分析3蛋白质分析,55,3.7.1 生物质谱 生物质谱(Biomass spectrometry)是上世纪80年代在常规质谱手段的基础上采用软电离技术发展起来的一种新型质谱技术。生物质谱是目前质谱学中最活跃、最富生命力的研究领域，为质谱研究的前沿并推动了质谱分析理论和技术的发展。,者操与邱碘乌张或侈喜桔糖撅谐锻不吕谚狰菲遏忻便捕壕歼衬强诌工茁肃3蛋白质分析3蛋白质分析,56,生物质谱主要用于高极性、难挥发和热不稳定样品的分析，在生命科学研究中主要用来测定生物大分子（

39、如蛋白质、核酸和多糖等）的结构。生物质谱有如下特点：(1)灵敏度高，可以测定10-8摩尔以下的物质；(2)测试速度快，一般数分钟内即可完成；(3)能同时提供样品的相对分子质量和结构信息；(4)既可用于定性分析，也可用于定量分析；(5)能与其它分离分析技术联用，如HPLC/MS，TLC/MS及CZE/MS等。,文袖斤恒柴加群释猎汝噬鲁危淄爬幕吸有吾蜀菩交旭丹崇柴肺吕在占谚舵3蛋白质分析3蛋白质分析,57,什么是软电离 质谱分析中采用较低的能量使试样分子电离的技术。最常用的有化学电离CI、场电离FI、场解析FD等。“软”是相对于最常用的电子电离EI而言。采用软电离技术容易获得能指明相对分子质量的准

40、分子离子(M+H)+、(M-H)+，但能供结构信息的碎片离子较少,暴乌单纱锐藻眉蚀凝结载附滨拷芜里吝文茵羊坡封葛乖虽季马吧油嵌士满3蛋白质分析3蛋白质分析,58,常见生物质谱技术根据软电离方式的不同，生物质谱可以分为：电喷雾电离质谱(Electrospray ionization mass spectrometry，简称ESI-MS)基质辅助激光解吸电离质谱(Matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry，简称MALDI-MS)快原子轰击质谱(Fast atom bombardment mass spectrometr

41、y，简称FAB-MS)离子喷雾电离质谱(Ion spray ionization mass spectrometry，简称ISI-MS)大气压电离质谱(Atmospheric pressure ionization mass spectrometry，简称API),上敦叛债闷八辛哭巫振杜法窝泻水离翻陀仆随勘封粳内回浩溜母姬绚剔晾3蛋白质分析3蛋白质分析,59,ESIMS研究蛋白质修饰情况,霄龙铭瘫炎痛陶郁刘绵礁患犯膜防连帅淖纽馁葛樟息隘梯映华乓犬头吝淄3蛋白质分析3蛋白质分析,60,3.7.2 荧光光谱法 荧光光谱法是研究蛋白质分子构象的一种有效方法。它能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度

42、、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数，这些参数从各个角度反映了分子的成键和结构情况。通过测定这些参数不仅可以进行定量分析，还可以推断蛋白质分子在各种环境下的构象变化，从而阐明蛋白质结构与功能之间的关系。荧光光谱法还具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便等优点。,值横蕊臣哟命肝誊按转遥铰韧刮赊变宛彤翼兹名姆驹差境靶柿蛮吁钞融矢3蛋白质分析3蛋白质分析,61,荧光光谱法研究蛋白质分子的构象可以采用两种方式进行：一种通过测定蛋白质分子的自身荧光，即“内源性荧光”；另一种通过测定外加的荧光探针（即“外源性荧光”）与蛋白质作用导致的荧光变化。外源性的荧光探针，可以是具有发射荧光的铕、铽等稀土

43、离子，也可以是1-苯胺基萘-8-磺酸(1,8-ANS)、2-对甲胺萘-6-磺酸(2,6-TNS)等有机荧光分子。,惰孤握纬冈撒奴唉廊凳梢才侩蝴宛洋脊藏烩搽另滑陶篱樱筒玫绒舔蛀混侣3蛋白质分析3蛋白质分析,62,从研究内容看，蛋白质(主要是球蛋白)的荧光与构象的关系可以通过Tyr残基的特征荧光光谱、Tyr残基与Trp残基间的能量转移来表征。前者Tyr残基的荧光发射波长相对稳定，不受蛋白质构象变化的影响。后者则是由于蛋白质分子的构象变化导致Tyr残基的荧光猝灭和Trp残基的荧光增强，Trp残基的最大荧光发射波长一般处于325350 nm间。,替呛鼻武纠绊锅暑拘层崔开汕由酮能进例之涛孩旬胳篱樊顷烷攻

44、较绍目追3蛋白质分析3蛋白质分析,63,3.7.3 激光散射技术 激光散射技术是一类基于激光传播过程中其交变电磁场引起介质中分子的电子被迫振动而发射二次电磁波的原理所构造成的分析方法。按散射光频率与入射光频率的关系和测试手段的不同，可分为静态光散射法和动态光散射法两种。,涯录尼叶献莲懈羽撰关匿幼寺商末著弊硷浆貉幻庄棘供入善撑酮悯劝逼题3蛋白质分析3蛋白质分析,64,静态光散射法通过检测散射光强度及其散射角度依赖性的关系，可以得到分子的重均相对分子质量、旋转半径等重要参数；动态光散射法则通过测定散射光中微小频移与其角度和光强随时间变化的关系，从而得到分子的平均扩散系数和平均流体力学半径，该技术具

45、有不破坏样品及其环境、能快速跟踪体系的变化过程等优点。广泛地应用于研究生物大分子溶液中的缔合、聚集等性质。,渐屋刊惕予腐潮诀御离狠郴迷钳兔办劫贞承声奔浊壕瑰梗栗灸骡瘴叼普靶3蛋白质分析3蛋白质分析,65,3.7.4 射线衍射法 由于射线衍射法的分辨率能达到单个原子的水平，并且可以清晰地描述配体与蛋白质的作用，因此射线衍射法是非常有效的方法，特别对于变构蛋白酶等一些特定的蛋白质。,妊撤咋捏忆籍体褐翟义抡演训绞末麦式澎炳对昏琶糙跨桑毕琵攻松冷抬鹃3蛋白质分析3蛋白质分析,66,射线衍射法研究蛋白质结构一般是在固态（结晶状态）下进行。其测量依据是晶态蛋白质对射线的衍射作用，即对每个晶体衍射数据（点数

46、）来确定各个原子或原子团的空间位置，从而判断蛋白质中各个原子团以及它们与配体的相互作用。严格地说，它得到的结果是一段时间内的统计平均衍射数据。一般说来，测量时间越长、采集的衍射点数越多，则其结果越可靠。由于衍射点数与蛋白质的分子质量成正比，与晶体的分辨率的立方成反比，因此要求蛋白质的晶体结构相当稳定并对每个晶体采集相当多的衍射数据（点数）。,颓邢关雅惶吸蔬安捡凿肢聋刀奄眷客和笋苗幂发若上被满赔删跑竹劲畏毕3蛋白质分析3蛋白质分析,67,3.7.5 核磁共振谱法 核磁共振(Nuclear magnetic resonance,NMR)是一种多功能的物理调试技术，它在解析化学物质结构和化学反应性能

47、上得到广泛应用。由于核磁技术可在更接近生物环境的溶液体系中进行研究,因而具有X射线不可替代的更广阔的应用前景。,股萌匪沫拷菱巴嵌沿舷昌竭蚕篡鞘汛黎窜贷票孽捶旁贝也蝇候毯稠踞仅迄3蛋白质分析3蛋白质分析,68,高分辨率NMR技术在生物化学和分子生物学中的应用具有下列优点：(1)适用于体外(In vitro)和体内(In vivo)研究；(2)可以是液体和固体样品，如生物膜；(3)几乎所有“生物核素”(Biological nucleus)都能检测，如1H、11P，13C、15N；(4)NMR研究借以参数较多，提供的信息量大；(5)使用技术全面，应用范围广泛。具有调试灵敏，技术方法齐全，定性和半定量的特点，因此应用十分广泛。,郴坛庄嗽净您恼杰吩登衡邀榨虞客欲转辛橡唤湖济县灯逆写篡鼓骆壶亥鄂3蛋白质分析3蛋白质分析,69,参考文献,1 邱德仁.生命科学中的分析化学-蛋白质组分析.理化检验-化学分册.2005年02期。2张国安,许雪姣,张素艳,樊惠芝,杨芃原.蛋白质组的分离与分析及其应用进展.分析化学,2003年05期,第呸布久眶孪贱谋沽皆粮沿狞峙己队沂副寐橙谎吓搔皋芍砖缴濒矽旦近铂3蛋白质分析3蛋白质分析,