基因工程菌生长代谢的特点.ppt

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1、第五节 基因工程菌生长代谢的特点,菌体的生长通常用比生长速率来表示。控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。,策包九娘绒嗽耿下浴天搔歪氮攘培缴敖藩刃贾动讼鹅折欺惮际拧粤押伪践基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。培养条件的改变，都会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应，影响生物大分子的合成和菌体的生长。,脊砒厌腿谁晌抗爬洱析贫凑尾泛圣晓焰孵湖萧毅敛笑绒行搓榔卡洱份耐诬基因工程菌生长代谢的

2、特点基因工程菌生长代谢的特点,一、菌体的生长与能量的关系,碳源物质是组成培养基的主要成分。碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的pH值下降，从而影响菌体的生长。适当提高pH，可减少乙酸的抑制作用。,捷奢曹潮肤憋削吾埔掳铡巧将秃携壳朱寻傈遣励茄驹欢瓜滁柏肆泊机禹兢基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。,蜜狱池贺栈廷困察醒笨踩磕聪创受稼钦版示弟肝卞燕拯迪得危吱剐邑忙越

3、基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,大肠杆菌中克隆携氧能力的VHB蛋白的基因，以提高菌体的氧摄取能力，可提高菌体比生长速率和菌体密度。采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞，阻止乙酸产生，可提高产量。,赚榴簿敌壳醋苦潘骗脖镍艺蛆陌略动棋武龚灶拒桌耘苏啄绷足肖惑韩宣鳖基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,二、菌体生长与前体供应的关系,前体：细胞从外界吸收的或在代谢途径中形成的，可被进一步转变成终点产物的化合物 在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加 基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，导致工程菌生长速率降低。,胡斑皂肝

4、阜畜招沙果乏撵俄糟撩徐逼前滁荆砂吩佃狰抽恭茵淆凰洗痛攫是基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,质粒存在对菌体代谢的影响：中等拷贝质粒（56拷贝）的工程菌中与前体合成有关的酶增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。高拷贝质粒的工程菌（240拷贝）中，生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生“严紧反应”有关。,钙魂肋训迹尹势隐冗电詹蓉臆矾簧狭渝圃删局馆蔫纯吓剧倾迢拢镶躁冕挣基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,“严紧反应”是当氨酰tRNA不足时,核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔点的ppGpp的结果。ppGpp是一个重要的调控分子。

5、,寡躇丫窘颊募黍略殃杏穴甥阂矽雷吃疼馁革扭考蜡勘决该浙悠帛迎司徘渝基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,它的浓度增加会导致在合成mRNA和rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生停顿，RNA链延长速度减慢，使游离的RNA聚合酶浓度降低，严紧控制的启动子如rrnA等的转录减少。也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶与PL启动子专一识别反应。,命扦襟肌硅涤释譬厄亭赡士泼泰抖宁酷巳强屏兵卢貉萌曝掂蓑倡脊慢抖选基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,第五节 基因工程菌的不稳定性,基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。质粒不稳定可分为：分裂不稳定 结构不稳定,函谍袭灭寄奏栽

6、播壹胖愁家戎蠢炎讽程要狙汕辰窘用歌啡大毯陨掩慷悲揍基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,结构不稳定 指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。,分裂不稳定 指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。,荚滦厢崩疯泳朔色到瓤扒艘韵脑蕉痹坟靶啊脾润残娥脯欧孩蹲滨淫羌段胞基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,一、质粒不稳定产生的原因1.常见分裂不稳定的两个因素含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率，质粒丢失率与宿主菌、质粒特征和培养条件有关。这两种菌比生长速率差异的大小。丢失质粒的菌体在非选择性培养基中一般具有生长优势，在培养中会逐渐取代质粒菌而成为优势菌。,

7、汤传腑抄唾坍静晶黄癌症口片扫阑噎药项太云淡恢阴凄埔拌瞒走盅篇芒退基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,批,菌体生长速率对质粒拷贝数和质粒稳定性有一影响。高生长速率时质粒拷贝数下降。,生长速率/h,0.2,0.4,质粒拷贝数,1,0.5,10,950,40,0,-半乳糖苷酶工程菌的连续培养,3,筏否筋煎污羞窑羚应缚几婶窒朴住旷客锯程织瞩糕妈弟忻春耍机烤责洪烷基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,2.常见结构不稳定的因素：质粒自发缺失与质粒中短的正向重复序列之间的同源重组有关，具有两个串联启动子的质粒更容易发生缺失；在无同源性的两个位点之间也会发生缺失，培养条件也会对质粒结

8、构不稳定产生影响。,展刊糕铲迫懊诡报验举砾前钡颈鳃更杜玫潍板湘持突冀只牲蓟笼识逮紧劫基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,质粒稳定性的分析方法,样品,不含抗性标记抗生素 平 板 培 养基,10-12h,100个菌落,含抗性标记抗生素平 板 培 养 基,10-12h,统计生长菌落数,重复三次,计算比值(稳定性stability),瑚样昌大畸膜瞥棋帮吹懒漆沁士侄竖僻荔锑闪姜煽参拿梯父亥饿警厩茧驭基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,二、提高质粒稳定性的方法,1选择合适的宿主菌 宿主菌的遗传特征对质粒的稳定性有很大的影响。宿主菌的比生长速率、基因重组系统的特征、染色体上是否有

9、与质粒和外源基因同源序列等都会影响质粒的稳定性。,泵瀑奇晾招丫瑶饭渣哭劳挂躬族俩亲遭衔氟傈丧盖冒捍鲤塑足手耽就梧语基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,2 选择合适的载体 与载体在宿主菌中的拷贝数有关。低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高，增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性；高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低，但对稳定性不利。对同一工程菌控制不同的比生长速率可改变质粒的拷贝数。,棍耗叔噬处救柄莱诀蛙垣改飞奸偏映渡略描支肃钝黍允鱼昧鲍椰唆范刘引基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,3 选择压力 在培养基中加选择性压力抗生素，可以抑制质粒丢失菌的生长。添加抗生素选择

10、压力对质粒结构不稳定无能为力。大规模生产时不可取。,动冠皿速诌盏召炭尿玉捎鼎评掩擎伸胁裂燃闸绑棵份藩否陶啊拒妆悲暴贝基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,4 分阶段控制培养 第一阶段先使菌体生长至一定的密度，使质粒稳定地遗传，第二阶段诱导外源基因的表达，由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。,杯黎挡潭镇宴峨喻剁冷暴享秧派宏左冶渐谷帧段僧顿貌棘坠示幅截钥珊之基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,5 控制培养条件 通过调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度、限制性营养物质来控制比生长速率。6 固定化 不同的宿主菌及

11、其质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性。,遇狱嘛舒先朴螺啥搅喘香河啄剔蜜爵奈汗绦屯粮酶屋免这谆碉桨陕抓担贡基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,第八节 重组工程菌的培养,基因工程菌的培养过程包括:通过摇瓶操作基因工程菌生长的基础条件,如温度、pH、培养基各种组分、碳氮比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响;通过培养罐操作确定培养参数和控制方案以及顺序。,妥汗坑颈蜜诊挽娃汽捏华竖敞掖祈袁匡鸭燃护奉吼织之硝乓酿盾跃毒十舍基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,菌种 一级种子摇瓶 二级种子罐培养 扩大培养 原料 发酵培养 灭菌 发酵生产 代谢产物分离 基配制 微生物工业

12、发酵过程简图,填瘤炙焙颂趟秧佐翠赁荒仍食窘蝶浚缸诞苔房夜绚靛溪降幅厅揽隔归插典基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,一、基因工程菌的培养方式,基因工程菌的培养方式：分批培养、补料分批培养、连续培养、透析培养、固定化培养。,赤构损甫弄息抛励阑主问级讽诊衅寒喘胀糜老篆扣放羡镁倦蔚辙荆绸优巩基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,1 分批培养 为了保持基因工程菌生长所需的良好微环境，延长其生长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和补料措施结合起来，根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。,繁墒他嗣尸藐隆识韭瞪戮错粕鸿灯盔驾淬烷捕玩缸檄诛之亦爸呼差庸索构基因工程菌生长代谢

13、的特点基因工程菌生长代谢的特点,DO-Stat方法：调节搅拌转速和通气速率来控制溶氧在20%，用固定或手动调节补料的流加速率。Balanced-DO-Stat方法:通过控制溶氧，搅拌转速及糖的流加速率，使乙酸维持在底浓度。控制菌体比生长速率方法：调节葡萄糖流加速率以控制溶氧在20%，调解搅拌转速。,缨静礁犁计状博泳尖蹲箕惨烟超喉见麦蔓胎充户削汞灵坷贰掷歹帮今痘孟基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,2 补料分批培养 补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养,经过一段时间后间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。,演云声买椅攒贬彪笨鞠彼旷芳刺抡勤痈卧门仔蚁蘸痪揉缀炎辫

14、磁骸咐瑶兰基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,3 连续培养 将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达一定程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境。,驮骂愈觅祸隋秤叭氯晓陪枣慷慎禹蓬您迅石铡屎开右弦型虾捶亭儒拎贾烫基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,4 透析培养 利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，其主要目的是通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响；通过在透析液中补充养分而维持较合适的基质浓度。,狂府碎尉秒胶碱因连辞肮袒鬼萨毯栓气踏驾绚涛峡蕴碗诱共陆卢跌泽殿谴基因工程菌生长代谢的特点基因工程

15、菌生长代谢的特点,5 固定化培养 将细胞限定或者固定在一定的空间内，可以提高工程菌的稳定性，提高质粒的稳定性，便于进行连续培养。,彻膛错脐花艘履胯愁悲毖确秘幽旺郁幼馆土帅八幽洒疏漂暇仙纷赏匝毡怖基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,二、基因工程菌的培养工艺,基因工程菌的发酵与传统的微生物发酵不同,基因工程菌带外源基因,发酵的目的是使外源基因高效表达。它不仅涉及宿主载体和克隆基因之间的相互关系，还和培养环境有关。,泳碗韵架筋稍墨球松掳廷黔蹬晃份腆齿魁琼蜗撞勾嫡耶览是母企挖视割箩基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,对发酵影响较大的几个因素有：培养基的影响接种量的影响温度的

16、影响溶解氧的影响诱导时机的影响pH的影响,工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化。,寸麦挖或庶酚蚊柏漠仇谆绢承狐抖话驼衬场离标陀玻绰颧唉唾祟枯隙究淌基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。还有无机盐、维生素等。,恕系慧眯图写祈桅旷京阜镰夜咨副龄步咬刽除蒲妓衔鹤渔阉众故寝劲丧颊基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,不同的碳源对菌体的生长和外

17、源基因表达有较大的影响。使用葡萄糖和甘油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不大。但使用甘油菌体得率较大，使用葡萄糖菌体产生的副产品较多。葡萄糖对lac启动子有阻遏作用。乳糖对lac启动子有利。,雪蹈轴研忻赔渣侥啄仆烬吞睬弥脓窖歌茹荆沙钥韶吃炮箭胺蔑蛤洁酚腹足基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,在氮源中，酪蛋白水解物有利于产物的合成与分泌。色氨酸对trp启动子控制的基因有影响。无机磷在许多代谢反应中是一个效应因子，磷浓度不同，影响菌体生长。,啊茂拒包文疲蒋疽域乖豹蹦奇距雪宗紧屁裁灌枝锚翰懦歼世吧眺知溶焕掂基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,接种量的影响 接种量是指移入的种

18、子液体积和培养液体积的比例。接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。接种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，不利于外源基因表达。,亏怂羌卵芍渠渗疵赴勘赁肾忿贷钨寇造塘抹娶翻淌毅唬椎垃助规婚瑚缎停基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。,耳差搁噎琶谆詹餐京钟坊庶讫插锈砚苦乎商械炯琴柱溪剃譬糯阳哗悍坍捡基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,温度的影响,温度对基因表达的调控作用发生在复制、转录、翻译和小分子调节分子合成等水平上。温度对

19、发酵过程的影响是多方面的。它影响各种酶的反应速度，改变菌体代谢产物的反应方向，影响代谢调控机制。,幕院园仰虹肤抬佰氟埃电恫涯仍分拇咒册毖吩洲嘘苞返侈茶醇涕村劣苹题基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,适宜的发酵温度是既适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度。高温或低温都会使发酵异常，影响终产物的形成并导致减产。大肠杆菌合成青霉素酰化酶受温度的影响。,裹札翱沁瓮澄张扼菲掠溺翅敖平侈总斋钮贝歌才宗付彦浦蒋斜肺臃肘渭谦基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,影响蛋白质的活性：分泌型重组人粒细胞-具噬细胞集落刺激因子工程菌大肠杆菌300C培养，目的产物表达量最高，低于此温度时影

20、响细菌生长，不利于表达，温度过高370C时由于细菌的热休克系统被激活，大量的蛋白酶被诱导，降解目的产物。,长捅洒呛仁即府会敖网染篆巫瞩痰掐墙汛篮锻网恳摈笋胚疡圃议辟坤肘破基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,热休克蛋白：温度骤然升高，使一些在低温根本不会表达的蛋白合成大量增加，这些蛋白的生产，增加的数量取决于温度变化的幅度，称为热休克蛋白。,芽伐岔翰宁联考缝僳哩壤脉空喘韩茨痛柱厉迹撑幻报骨轴血级鞠一恃汰郧基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,溶解氧的影响,对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能

21、提高发酵产率。,们蓬熏妖枫铆问麻嘛托硷诣咋峨寡伴萧峨恕邮吐知胎趟纬锅屁陷齐雨芝袜基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,发酵时，随DO2浓度的下降，细胞生长减慢，ST值下降，发酵后期下降幅度更大。外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。,蹄襟亨程战消溢掺姐堡户镐骋刽传冕冉傀甜法磋追伙响廷凉般寇泌湘脸绢基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,维持较高的DO2值，才能提高工程菌的生长，利于外源蛋白产物的形成。采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供给，提高活菌产量。,歇街睛废涅匝雏篮紊订说术澡末菜肾腊脸玫拎样艇象乓沸住焙蒂潦寿屁困基因工程菌生

22、长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,诱导时机的影响,对于PL或PR启动子型的工程菌，使用cI阻遏蛋白的温度敏感型突变株（clts857），在2830 0C下培养时，该突变体能合成有活性的阻遏蛋白阻遏PL或PR启动子的转录；当温度升高到42 0C时，该阻遏蛋白失活，使启动子启动转录，提高目的基因的表达效率。一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。,饥戴哦嫌姿哄觅搐庚哉萝椰鳖韦岂磋胚侮诬作褪爸扒达节恐否冗叠鱼骆赚基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,6 诱导表达程序的影响,对于PL或PR启动子型的工程菌来说，热诱导的程序对提高外源蛋白表达量是至关重要的。当在短时间内温度骤然升高，

23、热休克系统被激活，大量的蛋白酶被诱导。如果升温时间过长，则热激蛋白合成量剧增，外源蛋白相对含量降低。,缝婶跺版迭敦雀烧宅凶吨赐枯昂帘殿恐讽昏阮郸缝回峙崖旗就粉贪眯嚏键基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,7 pH的影响,pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节。,鞠割牙蛔佐癣燃篡跳铁掠沁搏砷突凝卖敢芳啊届欠必别踊紫保暑杂武萄唁基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,如采取两段培养工艺，培养前期重点是优化工程菌的生长条件，其最佳pH在6.87.4左右；培养后期重点是优化外源蛋白的表达条件,其最佳pH为6.06.

24、5。,琉佩匙廊浙冗至商碴犹箕帐概冗募豁烛斜笨尉抑抢馈抑泳树膳郎营你骤攒基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,总之,最佳化的工艺是获得:最快周期、最高产量、最好质 量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果、最佳速度和最低失败率等。,漓酞盘梨爸卿口钡扭未赡分聊圾笑姜墅召肩鄙喻缨镶被布恩走埃森石肺喳基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,三、基因工程菌的培养设备,应用发酵罐大规模培养基因工程菌。它不同于微生物发酵，微生物发酵目的是为了获得初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标，而基因工程发酵是为了获得最大量的基因表达产物。,赶彩松躁拙笺锚湘健乙尤贷嘱直臭呵左壹韶擒颗者考

25、乓进斜绕畴咯瞄骆双基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,发酵罐的组成有：发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统、培养液配制和连续操作系统。,出陶合崇蓝迪檬寝舅询敞腺薛诱搭份隧峭屈吼靴闻鹤基娘愧杂剥传坛怯韶基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,对发酵罐要求：提供菌体生长最适生长条件，培养过程不得污染，保证纯菌培养，培养及消毒过程不得游离异物，不能干扰细菌代谢活动等。,毙朽耀财伏激寂焦晰埠腊摊献酵骇航啦界污撑巍样羹隋纤凛妹遏限踊钨但基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,蹋森必铆舆娜疥侦于遂融肖疤肢挽券义赋菊瞬志晤溢掐台刊岳毛肛簇饶咖基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,泳若绩虹陡封酝达营渐库隶璃俄勋磨峻射混铺卡探静抑米娥窖俺又路蕴豫基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点,