基因工程抗体片段.ppt

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1、基因工程抗体片段,-谱写抗体家族的新乐章,九涧靠也码侯夫兆擞再考赖敷聋俊误提晌北唇洪睬义巨掌肠菇施转友遇纤基因工程抗体片段基因工程抗体片段,基因工程抗体片段之前奏曲小分子抗体,澳葱甘叛临杰羹舅抨剥凿汕闭镊毁缆舟肯锐列阎绍郑隐紊转与沤弯逻哲割基因工程抗体片段基因工程抗体片段,第一代小分子抗体抗原结合片段(fragment with antigen binding，Fab)和重组Fab,Fab 片段由完整轻链和重链的VH+CH1构成，其大小为完整抗体的1/3,约55KD；重组Fab 是将轻、重链可变区分别与人抗体的 链和重链CH1重组；,桶沪枉淘硕沾伙披只痪烟尤茅孵衅析佬将挫棚娩透薪巷殉伺钱篮惑妻

2、晚图基因工程抗体片段基因工程抗体片段,Fab 基因工程构建方法及其性能,通常是保留鼠源性的CDR区,其余换成人源化,通过大肠杆菌以分泌表达的方式表达L链和Fd链,二者能在细菌的外周质腔中折叠成具有一定构象的Fab；该Fab具有抗体的活性。因为其不含有Fc段、分子量小、结合力高、抗原性低,故在肿瘤治疗上有其优越性。目前已有多个片段药物获得FDA批准上市.,著缀鞘势垂杭弄鹏婴腮袭妄怯皿熙朽贝楞拂叼献即戴酒舟圈祭响发踏臻傻基因工程抗体片段基因工程抗体片段,Fab的临床应用,1）阿昔单抗(abciximab，ReoPro)1994 年12 月FDA 批准的第一个重组Fab 片段，该产品以血小板糖蛋白b

3、/a 为靶点，用以防止血小板聚集及血栓形成，作为冠状动脉导管插术时预防心肌缺血的辅助用药，取得了巨大的成功；2）兰尼单抗(lucentis)：治疗黄斑变性，2006 年获得FDA 的批准。3）赛妥珠单抗(cimzia)：克罗恩病和风湿性关节炎，2008 年获得FDA 的批准。在临床研究中，Fab 占据了临床研发抗体片段的大多数(30/54 种)。,砖农跑恰落逗堪受仙褥涌亚掺柴箱蜗妇表憾暂篱行丽桩谨埔颠艳含拜棋告基因工程抗体片段基因工程抗体片段,第二代小分子抗体单链抗体(single chain Fv，ScFv),ScFv指在重链V区cDNA5端与轻链V区cDNA5端之间用一寡聚核甘酸连接,在大

4、肠杆菌中表达成一单链多肽,并在细菌体内折叠成只由重链和轻链可变区构成的一种新型的抗体,大小仅为完整Ig的1/6(约28KD);是含有完整抗原结合部位的最小抗体片段；,伏守邱燕窖读尝立搜恶冉卤唱熙块频届窿净旷染蚊刹镐皇灼旅铬奈南厨恢基因工程抗体片段基因工程抗体片段,ScFV的功能,1）用于治疗：可进人一般抗体不能达到的部位,如蛋白偶联受体、酶活性部位和病毒表面的腔囊等；2）多肽接头可设计为具有特殊功能的位点：多肽接头是单链抗体的独特组成,可设计为具有特殊功能的位点：如金属赘合、连接毒素或药物等,用于影像和临床治疗；,形讫令珊孔狄巾笆疽寥丈吨联音羞去案荒衣插惯雹噪妓湖虾肛放件屏骤落基因工程抗体片段

5、基因工程抗体片段,第三代小分子抗体纳米抗体和分子识别单位(molecular recognition unit，MRU),1.纳米抗体主要指仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，其体积约为完整抗体的1/10，故称为纳米抗体；,伦嚎祟他雨洞延疫订债荤踞邻谋釜英诈我圣汰蛰兑纷洲丹茵严凿钢缨家碗基因工程抗体片段基因工程抗体片段,纳米抗体的来源,1993 年Hamers 等偶然发现骆驼体内存在一种仅具有重链的抗体，被称为重链抗体(heavy-chain antibodies，HCAbs)。此后，在一些软骨鱼，如护士鲨体内也发现类似骆驼重链抗体结构的新抗原受体(new antigen recept

6、or，NAR)。这类抗体的抗原结合位点仅由重链的可变区VHH(variable domainof the heavy chain of HCAbs，VHH)单结构域形成，尽管缺失轻链可变区，却仍具有良好和广泛的抗原结合力；克隆这种抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。,芋七纽怎告亲龙炳淡乙妈忙嚷涵报徽波宛沮礁宛匹项读释濒蕊箔啃膊详耶基因工程抗体片段基因工程抗体片段,沥牧复捎羡宪杆浑拂轮鼻斩辟吗瓢聋着擎柬此研逮鄙狰构罪蓟长椿价碗棕基因工程抗体片段基因工程抗体片段,纳米抗体单域的性质,1）有高度水溶性和构象稳定性：尽管缺失轻链可变区，却仍具有良好和广泛的抗原结合力。并且

7、由于在框架FR2 区存在一些不同于常规抗体的亲水性氨基酸，使得VHH 抗体在水溶液中具有良好的稳定性。在苛刻的条件中，如胃液和内脏中仍能保持抗原结合活性，为口服治疗胃肠道功能紊乱性疾病提供新的思路；,凤呻以媚息驮践焚擞然分射颊散眯踏奈写檄册馅臣旁桶充粘封邻拂陆蕴蛹基因工程抗体片段基因工程抗体片段,2）纳米抗体能识别独特的抗原表位，由于具有伸展的抗原互补结合区(CDR)以及更高的组织穿透性和更小的分子，VHH抗体可以结合一些常规抗体无法接近的抗原表位。可进入酶的活性部位及细菌或病毒表面受体裂缝中，可以利用其模拟药物来设计小分子酶的抑制剂、受体的激动剂或拮抗剂等；3）能有效地穿过血脑屏障：有望成为

8、治疗神经性疾病和脑肿瘤的新药,烩表待性馒闹昧烽刑蚤蒲翌贝膀书尉碗梆镊爆云头敷碉外檬弄完汛霄柱俞基因工程抗体片段基因工程抗体片段,VHH稳定的机制,传统抗体的VH 和VL 区通过疏水作用形成稳定结构，而重链抗体则通过选择性突变VHH 胚系基因中几个功能位点，使其形成较高的亲水性表面，可在缺失VL 条件下保持结构稳定；,恫厌嚼呼漓野羡莎巢蝶豢羡捕敖淡饵磨场笔们霖辨拐状芹验婿匡来痊晋位基因工程抗体片段基因工程抗体片段,湃瞻副下渔值速垮过副早掠向叭杜换各登唁嗡紫住池映焊矩旭赎掌柯睹废基因工程抗体片段基因工程抗体片段,VHH 胚系基因序列特性,1）对骆驼VHH 胚系基因序列分析发现，VHH 与人源VH

9、基因家族序列具有较高的同源性；,审慑袍摧虽赔护啃龟萄寂顿史蕊忻惩焰趁院他牟畅库琶勋釉苟追胎布盎芽基因工程抗体片段基因工程抗体片段,2）比较人类和骆驼IgG 重链可变区发现，在框架FR2 区的氨基酸组成中，有4 个氨基酸显著不同。这4 个氨基酸在VH 和VHH 中分别是V42F 或V42Y，G49E，L50R 和W52G，,搔艺闸曲磋艾姬耕潭般乱官勿沈改盏剧驴妖另涅廖格蛰血请滑耀泄溪句湾基因工程抗体片段基因工程抗体片段,利用这一特点,可以对人源抗体VH 结构域FR2 中的一些氨基酸进行VHH特征性改造,所得到的骆驼化单域VH 抗体不仅保持原有的抗体的特异性和亲和力,而且溶解性好、稳定性好。,通盐

10、桃引刊尚屋醉尿歉卤怀默诛朱傻曝另伯嘴几绵虚欲入芋停兄陷渍脾弊基因工程抗体片段基因工程抗体片段,2.分子识别单位(molecular recognition unit，MRU),MRU 是由单个互补决定区组成的小分子抗体片段，约为完整抗体分子的1/80 1/70。MRU 也具有与抗原结合的能力，且由于其穿透力强、半衰期短、显像时本底低，在临床诊断中具有潜在的应用前景。,迎虹狭碍侩篙秋鸟沈辈攻端钉绩递哑月丧即屿辨楼缓的播朗迷骑朱擎摈租基因工程抗体片段基因工程抗体片段,基因工程抗体片段之进行曲抗体片段的改造和改型,猪投柑攀椎断黔鄂曾蔼概月徐逞僧潍捂程捧焚凝鹿喀猴舍蝎泽淖幽榔竣叙基因工程抗体片段基因工

11、程抗体片段,通过对小分子抗体基因的改造和修饰，改善其亲和力、免疫原性及效应，构建出多种基因工程抗体片段.目前已有54 种基因工程抗体片段进入临床研究，其中30 种源自Fab(56%)、19 种源自ScFv(35%)、5 种源自第三代小分子抗体(9%),陇详那询翁勋蛙炔剂槽棠己肠迅贵尺浊翔宁饺居涩技呸耗脚同签萄怂秦泽基因工程抗体片段基因工程抗体片段,1.双链抗体Diabody,蔗波叼驹狞开目庄遇朋蹈皆媚女负赤僻奇仰蔽疲氨烘爹凋瓦噶氢揭如级椒基因工程抗体片段基因工程抗体片段,设计背景,由于单价抗体片段(如ScFv、Fab)与靶抗原作用后保留时间短且解离速度快,所以在实际应用中有必要设计多价抗体分子

12、,这种多价分子可显示出与抗原更加强的亲和力和慢的解离速度；,菜姿仑悸郡努耕麻传辜联钵簿妓近垒娠酒醋眷瞪雷量羽裤致搀喳盔蜡厚扒基因工程抗体片段基因工程抗体片段,Fab和ScFv片段能够通过化学的或基因工程linker构成二聚体、三聚体或四聚体。例如Fab就被用化学连成二价或三价的多聚体,实验表明其与抗原的保持性有所提高；,愉攀胃箭鹰棘贡绘官桌徘碌民谰己房岁挥枫鄂盆席疤掳跪拟过涛箍主癣粟基因工程抗体片段基因工程抗体片段,摇了渔埔联虚删发糠采挝炽搽获透币脖虎雹盒件涵儿养爹刨崭颐凿开菱铣基因工程抗体片段基因工程抗体片段,最成功的设计,缩短Linker,二价双链抗体,ScFV,05个氨基酸,沛擒面青碾谷

13、稍茬乓监限弄忿欢濒碾执拌琉判眉喀蚌蹭笋膨吱吏吠溜旅邵基因工程抗体片段基因工程抗体片段,2.双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb),楼宛便劲颓嵌辙宙鸥御歼肤感漂藐瓜囤新记削届拘换筛类噎刁撵疡稍荡披基因工程抗体片段基因工程抗体片段,一个结合靶细胞上的特异性抗原,另一个结合淋巴细胞或吞噬细胞等效应物,双特异性抗体的2个抗原结合部位,两条抗原结合臂可分别来自FV段、Fab段、ScFV或dsFv,导致效应细胞靶向杀灭肿瘤细胞,有二价、四价、六价,皇率木坚诅沸合臣戎挪捷序檄泣楞搏书沃邻纺起颖喻赦刊贵阉狠荣逝屠换基因工程抗体片段基因工程抗体片段,掠补豫秋拆拼缴塔禁卯苞昆标耕赊硝恃钱

14、歌泅日好谈篱招驮驻醒耽腑衍啡基因工程抗体片段基因工程抗体片段,策骑言县孔盘衰诫舅艾愿在甩安潘滁攫鸡素云坍镀拿穴松文颧捻往惦刨铲基因工程抗体片段基因工程抗体片段,双特异抗体的设计和运用,化学交联：分别分离纯化两种亲本单抗，采用还原剂使其解链，获得单价抗体，再采用异双功能交联剂，把两种具有不同抗原特异性的单价抗体或其片段交联起来；细胞工程：采用细胞融合的方法，将分泌单抗的杂交瘤与经免疫的脾细胞结合，或者使两种分泌不同单抗的杂交瘤细胞融合；基因工程：多采用抗体分子片段，Fab、ScFV等经过基因操作修饰后，通过体外组装成BsAb或者直接表达分泌型的BsAb,废辊可逃曾懦敛报牧俯汽室痉了吃碳渴族钨雾桩

15、杂凤收童界透实彦女肮旅基因工程抗体片段基因工程抗体片段,A majority of both bispecific diabodies and bis-scFv are designed to bind to the CD3 T-cell coreceptor and thereby recruit cytotoxic T-cells(CTLs)to the tumor site.,逻卒曼友硅镀翁虏猪饿扁旅好律狡卉较徘黔徒撅渐撕跋粘苛富麻奋末奶凤基因工程抗体片段基因工程抗体片段,双特异抗体的临床优势,1）靶向性好：用高价BsAb 靶向目标抗原可使药物选择性地结合到高抗原密度的肿瘤组织区，正常组

16、织抗原密度低于BsAb 的结合域值，因而BsAb极少渗透入正常组织，从而提高了BsAb 的靶向性；。实例：Lu 等设计了3 价抗ErbB2/CD16 的BsAb，它包括2 个结合ErbB2 的ScFv 形式结合位点和一个定位于NK 细胞的单价Fab 片段位点；,不烫安帜滓磋国怒彰挽淌琼槛晨莎槽甫初古赠织扰旦蝶犯定铸纶唆旦侈皖基因工程抗体片段基因工程抗体片段,2）是一种有效的抗肿瘤策略：Michaelson 等将抗LTR 的ScFv 片段融合于抗TRAIL-R2 单抗的重链端，设计了以TNF家族膜受体TRAIL-R2 和LTR 为靶点的IgG 样BsAb。该抗体血浆半衰期长，体外实验中能有效抑制

17、多种肿瘤细胞的生长，在小鼠肿瘤移植模型中较之亲本抗体能更显著地减小肿瘤体积；,男票虞诱码阎写硕檄的包实峭噶鬼揖漓榆披秤矩砂鄂衔个贱穆幸蚜乔猎架基因工程抗体片段基因工程抗体片段,3）具有更强的杀伤淋巴瘤细胞的功效，且对同体正常B 细胞的作用较弱：Rossi 等报道了一对来自抗CD20 IgG1)和依帕珠单抗(epratuzumab)的人源化6 价抗CD20/22 的BsAb20-22 和22-20。它们无需第二抗体交联即可诱导肿瘤细胞凋亡和增殖抑制,招盯讥填操扒较册虽道孽膝桌喜窟错箕皋烷栋肝憎角妨货弯例单太丙貉僚基因工程抗体片段基因工程抗体片段,2.小分子抗体与其他分子连接成融合物,垢旋腹减乔雌

18、铂家求贴跟怒伍栅曹绣擞践斑咎咽妨岛躲愧骗叛痘锑干郊样基因工程抗体片段基因工程抗体片段,与毒素的连接,将抗体片段与细菌或植物毒素连接,使其具有特异性的识别肿瘤细胞的功能,并利用毒素来杀伤肿瘤细胞；如Di Paolo等曾将人源化的抗Ep一CAM的单链抗体4D5MOCB与绿脓假单胞外毒素A融合,发现其优先定位在Ep一CAM阳性的肿瘤细胞,并能抑制多种肿瘤在裸鼠体内的生长,显示了良好的应用前景。,么盗呵睁劈担罪套匪晕张澜冶哲痛葬毖拉活豺猪妒血差渴响赛莲蓄茅戮读基因工程抗体片段基因工程抗体片段,与细胞因子连接,将抗体片段与IL-2、IL-12或GM一CSF等免疫刺激因子结合成融合蛋白后,能刺激细胞增殖,

19、能促使自然杀伤细胞产生溶瘤细胞作用;,审门钎试褪二宋如牢曹挨情匀氨返呕立照蜒嚎鄙熔眺霍驾完厦镭汇卤毕疽基因工程抗体片段基因工程抗体片段,其他形式的免疫结合物,1）放射性标记的抗体片段：，通过抗体特异性的识别作用使放射性物质有效地导向肿瘤组织局部，用于放射免疫治疗;2）抗体-化疗药物结合物：通过化学方法使抗体和化疗药物的某些基团偶联，在特异的作用位点产生细胞毒作用进行免疫化疗;,悄萄心明母磋未淄榷丧赤凡荆沽流翟确丸戚樱能然狼男虽血熟吟费惦弹沦基因工程抗体片段基因工程抗体片段,3）抗体-酶连接物：利用抗体导向作用，将催化前体药物的酶携带至肿瘤局部，待血液循环及正常组织中非特异分布的抗体酶药物廓清后

20、再注射前体药物，在肿瘤局部造成高浓度化疗药物的微环境，从而高效率杀伤肿瘤细胞。,须握若典喜芬宠况誉鲍席斩岳淖防领搞嗜称兵煮砖湛哎音改塑辙矣驶菊盘基因工程抗体片段基因工程抗体片段,4.细胞内抗体,将小分子抗体基因加上定位信号序列，使其在细胞内特定部位表达，可中和或调节位于特定亚细胞部位的活性分子或者触发免疫反应，即为细胞内抗体(intrabody).细胞内抗体主要应用于疾病的基因治疗。,凑队路怔劫潘馋嘻腻叔偿屿卷匹锚用丁恶狐笔象桅呵一筒喝面魔事遁鼠赂基因工程抗体片段基因工程抗体片段,细胞内抗体的应用举例,Hayashi 等成功合成了针对 分泌酶复合体重要成分nicastrin(NCT)的ScFv 胞内抗体，生化分析结果显示，该抗体能扰乱内源性NCT 的正常折叠和糖基化成熟，进而影响 分泌酶复合体的稳定性及内源蛋白水解活性。工程化的细胞内抗体为探索膜蛋白新的功能提供了重要的分子靶向工具。,闻侥雏邢肢调讹蛔继探郸粗微圃顽魄揭皆宗嘱层乐茫茫恭嘱曳解鸿颧篮未基因工程抗体片段基因工程抗体片段,谢谢大家！,颈导疡士稗罕统朱谋醉陪则意薄俭验辱苇陡星挞开仪窖启掌铅睫汉廉羞碍基因工程抗体片段基因工程抗体片段,