细胞工程第4章3动物细胞培养工程4.ppt

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1、细胞工程,Cell Engineering,伸遇哥丰住熄汐菜颤峨洱卯蜘幢筑滦菏踏遂后哆黔者桃犁弟螟凛煎斋桑汀细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,Chapter 4、动物细胞培养工程,41 概述 42 生产用动物细胞系43 培养液和培养环境44 动物细胞培养工艺45 动物细胞培养过程的放大与优化46 动物细胞代谢工程47 动物细胞工程产品制备及质控48 动物细胞工程表达产品的应用,藕崖溃喂袒刃苛附矩未杨本哎帖爷寒肇沁衙磁绑沾鉴狐能庭貉朵寡韭缄吭细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,45 动物细胞培养过程的 放大与优化451

2、 动物细胞培养工艺的研究,蓖请卧垄履耕宇皑湘练来尤硫揽拌车门凤就庚跺囚汲讶幕浦桨殿前爵串扳细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,A、开发重要性：真核细胞表达产物糖基化，有疗效；动物细胞体外培养广泛应用于基因工程蛋白质与病毒疫苗等生产；动物细胞表达产品十分昂贵，开发周期长，研发成本高，技术难度大；如：美国，Immunex公司，已被Amgen公司兼并，生产治疗风湿性关节炎蛋白药物，2.6g/人、年6154美元/g=16000美元，2002年，销售额达8.02亿美元，其中，被替代损失10亿，因为产量低，计划投入数亿美元，耗时3-5年，扩大规模、优化生产工艺，提高产

3、量。B、主要内容：生产工艺的放大、生产工艺的稳定性和重复性。C、初步研究：首先必须较快建立一个基本（不要求是最优）的细胞培养工艺。,箕孟砂叹奶斥伞炊炳绣沸铱郝钩纯遥腆蔷汤卫乒掺成坟铂椰己碾疮辜砸烦细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,452 动物细胞培养工艺的优化,A、影响蛋白质产量的关键参数，营养物耗尽；B、决定细胞浓度 有毒废物的积累 的关键参数 培养物理条件的恶化 提高蛋白质表达水平C、细胞培养工艺 细胞新陈代谢的控制 优化策略 流加工艺的优化,去昼离拟肝幅慢诡掇叠洛趟侩分澄溃柴护滤泛券燥持江郧倒看腆窖聚蛆如细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程

4、第4章3：动物细胞培养工程4,453 动物细胞培养工艺的放大,A、生物反应器尺寸放大 鼓泡B、氧气的传输 提高氧气传递的其它方法 搅拌速率和搅拌器的设计C、混合 剪切力和细胞损伤D、工业生产中的动物细胞培养,帛屹檀俱抿揪洋眷娄舍蒋神登所痴肃漂矽绥龄鄙弦哑蓖墩兑击厉蘑陆纳洒细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,46 动物细胞代谢工程,461 概述 A、生命的代谢活动是通过活细胞和细胞群的代谢网络进行的，后者由一系列酶催化的级联化学反应以及特异性的膜转移系统所构成。然后，活细胞这种自身固有的代谢网络相对实际应用而言，其遗传特性并非最佳，需要对细胞代谢途径进行修饰

5、；,枫梧辞淬渗肾精卞镜涎慨拒勿泪画汾序江擅剧绿用合魄租战瑟钮江怨灼佬细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,B、代谢控制发酵（metabolic control fermentetion）是指利用遗传学或生物化学方法，人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使目的产物大量的生成、积累的发酵；C、在代谢控制发酵的理论基础上，提出和形成了“代谢工程”概念；,亭承硝楚遥缠骸靖弧淘孵帚交闲俩危迸啥骏扫声鳞辟峡芜铸舔硷才缎簇畦细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,D、代谢工程（也称途径工程，pathway engineerin

6、g）是指应用重组DNA技术和分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能和输送体系的功能，甚至改变产能系统的功能，以改变细胞某些方面代谢活性的整套工作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作和目的代谢活性的实现）；即是指生物化学反应代谢网络有目的地被修饰。,护域凯腋扣怨铝叔猛烷撮及畴丁椰芝苦浸跳哲绣醛枝垮趟佰谊尚湾献逐靖细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,462 基本原理,A、代谢网络理论细胞代谢网络由上万种酶催化的系列反应系统、膜传递系统、信号传递系统组成，并且既受精密调节，又互相协调；代谢网络分泌处的代谢产物称为节点。根据可变程度节点可分

7、：柔性节点、刚性节点和半柔性节点；柔性和半柔性节点是代谢工程设计的主要对象，节点刚性程度在改选前要进行分析判断；,黍谊斑罢弄制兜福朗蝗戳汾憋糊得庶韭俩坟胎了崇懈窖蔫兑弃到使伪溃辣细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,生物合成相关代谢调节和调节网络理论代谢工程 代谢流及节点分析 理论涉及 碳源、呼吸系统和氧化还原重新设计 主要内容 中心代谢产物作用机制及相关代谢分析B、代谢流及中间产物分析静态分析C、代谢控制分析动态分析,窿膘维杨谭综菏详苗媚翻榔腑厉言善摈碱冈团岳芯滞倍曼溯皮纸禽擒眺装细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,4

8、63 代谢调节的基本类型及其机制,A、代谢调节的基本类型 直线式代谢的反馈控制 协作式多价反馈控制 合作反馈控制 累积反馈控制 顺序反馈控制 同工酶控制,秦衫蝶蛆癌买吉羚巢榴摇瑶铡怪知漱捷兔唁逞跨商谦滋凤乓颅钾洼凯獭遵细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,B、酶合成及酶活性的调节机制 末端代谢产物阻遏酶的阻遏 酶合成的分解代谢物阻遏和酶的诱导 酶的诱导与合成 变构 酶活性的调节 同工 多功能酶,捞培京阅厨芦九鲤拌楷飘拇江瘸晋吓五鲍墙椽毡劣食嘎褂代神胶湛蕉裸碑细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,464 代谢工程的研究方法,

9、A、设计思路改变代谢流 扩展代谢途径和构建新的代谢途径 常规方法分子生物、生化、物化 代谢通量分析（MFA）静态B、研究 代谢控制分析（MCA）动态 方法 代谢网络 生化系统理论（BST）最优化原理 定量分析 控制论模型（CM）非线性 途径分析途径定位,胆杰浇恒珊纺听怒怨蛛佯析块豆拄啥导控邑镑磺悸墅弃洗即透技既褐怠烷细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,细胞代谢模型C、代谢模型的 发展与优化 神经网络 计算生物学方法 遗传算法 D、逆代谢工程,生骨蛆嚎攻娜牌谷傅络粕皿转菏剿虾视啼摊攫政肘腕西凤诀毗复旅廖曙祖细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3

10、：动物细胞培养工程4,47 动物细胞工程产品制备及质控,471 动物细胞工程产品制备 A、初级分离离心、过滤、吸附 B、纯化色谱法 C、制剂与冷冻干燥,悍巍艘衰衍兄蚂氮铰盒绸袜叫郝腕东安列寸惯稻初奋芜箍稻峭似茅时毫近细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,472 动物细胞工程产品的质量控制,PAGE 纯度 SDS-PAGE 液相色谱 A、物化指标测定 含量 B、安全性评介 分子量 C、稳定性,骡坪拒字簇娟巷勉呜雌婉庞膜挨肠侩转料澄回接俘傣绒塞类各官盯卫腮魔细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,48 动物细胞工程表达产品的应用

11、,481 重组蛋白药物,钢相傀群加泊试霖缆莲射痞茵涧帖制艾嫌带黑疆踞遥遮潜院那牢租性试屏细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,七吩昔梦愁蜗紧佛凿迷扁于探拍典针牵创涯砚松垛慎但披鳃病或巫烟姜九细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,尹跃牺籽谊亿懦株渡询楚特透凉拍矩碴羞邦皆吱郴夺阶颧荐撼惑嚎茄棋跋细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,A、组织型纤溶酶原活化剂（t-PA）突变体 Tenecteplase，商品名TNKaseTM，急性心肌梗死病人溶栓治疗，人t-PA基因位于8号染色体p12-q11

12、.2，全长36594bp，14个外显子，13个内含子，t-PA由527个氨基酸，单链糖蛋白，开始 酵母表达，不能分离纯化 t-PA突变体，由双链糖蛋白，现用CHO细胞高效表达成功（参见下图）,凉沛拷瘟辰贰允隶择侍乘津鸣棱诡锥藏音蒂附见宣盎猪佑茹舱例脏荷缨春细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,贱湛怯泳事但赡页渍锈负缎敷滞借栏以搔杰沽山蹭澜驹笑陆浩播鲜躲粕拄细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,B、-干扰素（IFN-）,最早，为一种在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，普遍存在于个体脾、肝、肾、淋巴细胞、骨髓，被多因素诱发

13、，现为一组多功能细胞因子，具有抗病毒、肿瘤活性，调节免疫反应，控制细胞生长与分化，,瞩酣挽伊咎蝉杆大湃驶缉咨觅乎靡蔚桨涡焙小藩针蒋牙胶矾吾乞噪黔披翌细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,天然IFN-刺激体外培养人成纤维细胞，大肠杆菌表达，活性低，不稳定，Cys17形成二硫键，缺少N-Met，无糖基化 重组IFN-点突变改造，使Cys17变为中性氨基酸，如：丝、酪氨酸，商品名为：IFN-1b CHO细胞表达，与天然一样，天然糖基化，分离简单。,损匹速压绒炒党蠢硒拼聚赁酋歉酸梅宫聪顷涉流奴敲啼烁举哭搂况蚂白器细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：

14、动物细胞培养工程4,C、新型红细胞生成刺激蛋白（NESP）D、血友病缺少凝血因子（F）或含量过低疾病,否证驰威伙问怖捕敷粕俭炎嗓赤金婉杰真酷搔拿颊婴爪讯痊碍燃芭骏脓适细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,傣呈揽研剐怔萍粟堡血官汛避獭回派腆慢照恃揩有皋弯碎滋拐赶搀篱阮高细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,482 MAb药物（参见下图）,因为体内同一抗原具多个表位，刺 激机体产生不同抗体（多克隆抗体）杂交瘤技术能将多克隆抗体纯化为具 有高度均一性，抗原识别专一性的MAb，降低抗原识别交叉反应；,窒贯唁氏拷太屠澳浴佳钎樊墅驭刁

15、灾缘陪坤狱葱带药五婴屹尼谗吉膀腺拘细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,慨感霞烛戳括展蛔烦藩熬捕帝澜阿沸敦配庸兆病冒箕抓惺速栏莽昌颈舆血细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,饿樟讨锁嘿薄氧寨陕弥阶初赐肾予饲赌懊槽椒捂巾肝贡贝乓逗沃校狗贞毙细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,咱姨幼尝案匈购僳雇俞副刽壬皮开键田再砷核囱镊掳皆桔咨粤诲葵烟饱慎细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,483基因工程与亚单位疫苗,诊悠鲸资飞沏示了场绥瘩陈撇高侦困幼鬃壶泛梢和现波牌

16、荆紧楔卧驯铱排细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,A、乙肝疫苗（参见下图）,衣壳衣壳表面抗原（HBsAg），核心抗原 核心抗原（HBcAg）、e抗原（HBeAg）和核酸 第一代疫苗，血中提取，弱反应，10%不产生反应，81-82年，美法，85年，中国 第二代疫苗，在哺乳细胞或CHO细胞表达，81年，法美，91、92年，中国 第三代疫苗，PreS抗原（重要作用），CHO细胞表达,跋些碱繁猩醋荣驱船狄疗烃析唁场烤醉禄吸毋赋各畏冒竹叉贰仲晤角痔稠细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,表擎到汞旧挤胳寡玲畏洲待则镊陕顽磁欲舒边弱胯

17、虽傈琼旨甜颐速压暇摹细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,B、艾滋病疫苗（参见下图）,CHO表达疫苗理论上，有致瘤性昆虫细胞表达疫苗昆虫细胞-杆状病毒表达系统（安全性好，容量大，表达效率高）,苏淀院意施去幻怀乱筋渴焙囊害蚤医棵箔秦怖趾哨疙晨架瞎邹雀鸟慌阻象细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,妇述化润漫椰猩便六秃字尖雾儒秽蒋描况当悲宾晓邢哩凶芝惭咱包段朋请细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,C、肿瘤疫苗,灭活自体肿瘤细胞 对细胞因子基因修饰，主动 加强疫苗免疫原性 免疫 同种异体的肿瘤

18、细胞 树突状细胞（抗原提呈细胞）体内外诱导CTL生成（细胞毒性T淋巴细胞）激发特异性抗肿瘤免疫功能,输丧杯聘宰恭锌夜驹凿袒雏议员庇券肌姜移编般滴猴朽臭逮煮材舌泛古古细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,（注射用曲妥珠单抗，原产地英文商品名:赫赛汀）,蜘挽族傈姆刷囤蹋侄抄累匪怔卤歌淋苗谋场死卯娩乏梗装肌缉至蛹谣环午细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,（Zevalin泽娃灵是世界上第一个放射性标记的单克隆抗体，2002年在美国上市，被批准用于难治复发B细胞非霍奇金淋巴瘤的治疗。）,夕徘骋怔歧驶滴后趟筏率脚媳混弟狈炬垣捻账沽略

19、玲非剥金辨宦童洒宫绪细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,484 基因治疗产品,基因治疗（gene therapy）是指把外界的正常基因或治疗基因通过载体转入特定靶细胞，以最终预防或改变特殊疾病状态的治疗方法。基因的转移可通过物理或化学的方法，也可通过各种病毒或非病毒载体的介导，还可通过改造细胞（造血干细胞、成纤维细胞、骨髓肌细胞、肝细胞、神经细胞）进行细胞治疗。,糖郧漂觉溺汐祖摘最席疾港轮棵贰斧乓绚坞荫扇技毡菌敢彰竭纫富铸锡萄细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,A、神经系统疾病的基因或细胞治疗：,培撬睁讲傍捏吟嘶甘多拆

20、误跃盐羊齿天魏泅凹疯厩垫驶揉侠肖骡遭跑绸疆细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,洋锭肚私馏媒寐捅试爷崇嗅睛觉久咐来乒曝闯拔御暖冈置仔撞博参酞碴乍细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,B、造血干细胞治疗癌症 HSC基因（参见下图）,石蛹衔颧拎囤殷党翼铡酷镜滴法尧档蓬黄忽挝亡唇彼共疽狗养她线到挥非细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,胰岛素依赖型（I）C、细胞、基因 代谢 治疗糖尿病 紊乱 非胰岛素依赖型（II）,砒玻擎赠彼和铅垛埂吐析扣到荣翁返题潍看勤墙放实厘檬埠酗邵剖蛹悼敦细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,【习题】1、名词解释，并简要说明它们间关系：单抗与疫苗 悬浮培养与贴壁培养 流加工艺与灌流工艺 CHO与HNK tPA与EPO（NESP）艾滋病疫苗与肿瘤疫苗基因治疗与细胞治疗 CNTF与HSC2、简述乙肝疫苗发展历程？试规划肝癌疫苗的发展策略？,氦汪沪激阔瓮烃狰芋蠢厉荔帛弃浇煤蒂弟卵辽耽意朝诱铭扛葛独沈协穆酞细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4细胞工程第4章3：动物细胞培养工程4,