RNA提取常见问题.ppt
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1、RNA提取的通用方法,异硫氰酸胍/苯酚法,原理:细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解,同时核蛋白体上的蛋白变性,核酸释放;释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相,从而得以分离;有机溶剂抽提,沉淀,得到纯净RNA。,纫蓑线站柒颠汁菇他泳缠苏妮符痕孰岁粗粹褥紫扇戚吟毗囤船培循江曼铲RNA提取常见问题RNA提取常见问题,异硫氰酸胍/苯酚法,步骤:材料准备:尽量新鲜。裂解变性:异硫氰酸胍(亚硫氢胍,巯基乙醇,N-月桂肌氨酸等)。使细胞及核蛋白复合物变性,释放RNA,有效抑制核酸酶。纯化分离:苯酚,氯仿,异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。洗涤:70乙醇。沉
2、淀:异丙醇、无水乙醇。乙酸钠(pH4.0):维持变性的细胞裂解液的pH值,沉淀RNA。此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。,RNA提取的通用方法,个称厨距喷见烁赃窑争厦铱撤韭滚奠侯赂驼露檄厘畴破瞒汛淬碱遍获啤鳞RNA提取常见问题RNA提取常见问题,影响RNA提取的因素,材料:新鲜,切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难,且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中,于70或20保存如要多次提取,请分成多份保存液氮长期保存,70短期保存,谓沧异俯居鹿宪味箔阳诞箩钙墓土照魄幌侦涂汗孝级甫摄撵跨挖涯就机荆RNA提取常见问题RNA提取常见问题,影响RNA提取的因素,样品破碎及裂解
3、:根据不同材料选择不同的处理方法:培养细胞:通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌:一般TRIzol可直接裂解,对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁动植物组织:先液氮研磨和匀浆,后加裂解液裂解。期间动作快速,样品保持冷冻样品量适当,保证充分裂解为减少DNA污染,可适当加大裂解液的用量,甭直斑庚建加桓绑匣拦楼手故厅疚舰勉砍梳泽喜氦小控堤静脐谬似照斩神RNA提取常见问题RNA提取常见问题,纯化:在使用氯仿抽提纯化时,一定要充分混匀,且动作快速;经典的纯化方法,如 LiCl 沉淀等,虽然经济,但操作时间长,易造成 RNA 降解;柱离心式纯化方法:抽提速度快,能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质,
4、是目前较为理想的选择。,影响RNA提取的因素,泅堂焦桓酪沈妓君诽龋循缝肃手粮苯躁狼娘棠凉框打慌澳活伎诽亡诉蠕携RNA提取常见问题RNA提取常见问题,RNA提取常见问题,RNA 的降解 OD260/OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳,萎肩虎谬膝滑谗带政邦挎渺磷莽雄役袖沂星敌皿雇身秩枷蕴健唬裳笺徘栋RNA提取常见问题RNA提取常见问题,RNA降解,新鲜细胞或组织:裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏,胸腺等),很难避免 RNA 的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎,并且匀浆时使用更多裂解液。,每钟丙寐透茸途隧亢痞执自曲素单毋
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