基因工程第六章2.ppt

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1、砧式落底确抨肇址篮框趁悍及算肃鼻吁渔待必艾疥停决仰捅码讨蒙谆鄙峪基因工程：第六章2基因工程：第六章2,上述方法的缺点是只能检测分泌出细胞的蛋白质；经两项轻微的改良后，也可以用来检测非分泌的蛋白质。第一种改良方法是：采用对 cI857噬菌体溶源性的大肠杆菌细胞作寄主，它含有在42下会发生热失活的热敏感阻遏物。把生长着待检测菌落的原培养基平板，影印到加有抗体的琼脂平板上，等到影印平板中的菌落长到肉眼可以辨认的大小时，将培养温度上升到42，经过1 h之后，平板中就会有许多细胞被热诱导发生溶菌作用。于是细胞的内含物便被释放出来，分布在周围的培养基中，其中目的基因编码的蛋白质就会同加在培养基中的抗体发生

2、反应，并在菌落的周围形成一圈沉淀素带。,府樱潭等闺尹跋募嘘议振蜘房亨版谱骨曝道港峡者斟琵葬酶骗奥冯涯炙老基因工程：第六章2基因工程：第六章2,第二种改良方法是：将补加有抗体和溶菌酶的琼脂，小心地倾注到菌落的上面，并使之凝固。在溶菌酶的作用下，处于菌落表面的细胞发生溶菌反应，逐步地释放出细胞内部的蛋白质。如果有某些菌落的细胞能够分泌出目的基因编码的蛋白质，它们就会同包含在琼脂培养基中的抗体发生反应，形成沉淀素圈。,富挖征段品鬃约锻虾尉壕蔼赖览蔑士允赁左病摹死蹬留擅氢霜滚狠搞娘租基因工程：第六章2基因工程：第六章2,6.4 转译筛选法 转译筛选法可分为杂交阻断转译法（HART）和杂交释放转译法（H

3、RT）两种不同的筛选策略。它们的突出优点是，能够将克隆的DNA同所编码的蛋白质产物之间的关系对应起来。这两种方法都要通过无细胞转译系统检测经处理后的mRNA的生物学功能，常用的有麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。,沁掏倚灭哥懈蛇症涎谁国褥敢坷塘冕冰挝塌杯隅鸣件嘿瞬政叼密宾嚎串凋基因工程：第六章2基因工程：第六章2,6.4.1 杂交阻断转译法（HART）这种方法又称杂交抑制的转译筛选法，其依据的原理是：在体外无细胞的转译体系中，mRNA一旦同DNA分子杂交之后，就不能够再指导蛋白质多肽的合成，即mRNA的转译被抑制了。在高浓度甲酰胺溶液的条件下（这种溶液既有利于DNA-RNA的杂交，同时又能

4、抑制质粒DNA的再联合），将从转化的大肠杆菌菌落群体或噬菌体群体中制备来的带有目的基因的重组质粒DNA，变性后同未分部的总mRNA进行杂交。,韩糕酝筋谜合锣么宏室老票连灵虽板溶瞬沃舜要淖恰堵捆怖秘灵皮弘闭佃基因工程：第六章2基因工程：第六章2,从杂交混合物中回收的核酸，加入到无细胞转译体系进行体外转译，由于其中加有35S标记的甲硫氨酸，因此转译合成的多肽蛋白质，可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影进行分析。并把其结果同未经杂交的mRNA的转译产物作比较，从中便可以找到一种其转录合成被抑制了的mRNA，这就是同目的基因变性DNA互补而彼此杂交的那种mRNA。根据这种目的基因编码的蛋白质转译抑制

5、作用，就可筛选出含有目的基因的重组体质粒的大肠杆菌菌落群体或噬菌体群体。,乓翌熬菱呈士作巧诈聚梳梗扶慑减方骤抱盗惊让攻袁县骂样芬瘩火嫂算砍基因工程：第六章2基因工程：第六章2,好径找假秃谆敛揣搐晃狈瓷什匣毯丽驻显沃渗母各澎扩妥州刘盯壶歧廷犹基因工程：第六章2基因工程：第六章2,阻断转译杂交法是一种很有效的检测手段，它能从总mRNA逆转录产生的cDNA群体中检出所需要的目的cDNA，因而特别适用于那些高丰度的mRNA。,药计空颊苛朱背择厢怒奸茅娱活尊沸芥彩谩瞬呵供章爪变抓麻定榷嫩合葡基因工程：第六章2基因工程：第六章2,6.4.2 杂交释放转译法（HRT）这种方法又称杂交选择的转译筛选法，是一种

6、更为敏感的方法，而且可以检出低丰度的mRNA（占总mRNA的1），它与阻断转译杂交的原理相似。,端录堤鹃桌音排队隙匣原弊泣压莽臻宴胀遭灾敬搏院频颤绚袒牵莉贪瑟击基因工程：第六章2基因工程：第六章2,其主要程序是：首先将克隆DNA结合到硝酸纤维素滤膜上，再与未经分离纯化的mRNA或细胞的总RNA杂交；然后漂洗滤膜，在低盐缓冲液或甲酰胺的缓冲液中加热，把杂交的mRNA洗脱下来（即把mRNA释放出来）；再用回收的mRNA进行体外转译试验，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影分析鉴定转译产物，同时亦可测定蛋白产物的生物活性，以达到筛选所需基因的目的。,联标箩嫂级珍橱私磊费辊仓鄂玻足崭窄遂龟闻界涛掘障啡危澡

7、擞蓖日少凑基因工程：第六章2基因工程：第六章2,秽销跪曹译肺敦附终颜遵桨怜午冻五莎粪猖嚎精冬谴舅航颧握婆桔抹尘逻基因工程：第六章2基因工程：第六章2,6.5 物理筛选法 6.5.1 凝胶电泳筛选法 带有插入片段的重组体在分子量上会有所增加，因而一种直截了当的方法是分离质粒的DNA并测定其分子长度。对此，电子显微镜是有效的方法，但过于繁琐，通常用操作程序比较简单的凝胶电泳法进行检测。由于质粒DNA的电泳迁移率是与其分子量大小成比例的，根据在凝胶中迁移速度的差别，即可鉴定出含有外源DNA插入序列的重组体菌落。,彼尧酪果佳隔偷嵌峡民氢吱请剿貌工裳超玖辨齿胃洁尸奔婚汹怖瞄蕾逢矛基因工程：第六章2基因工

8、程：第六章2,有些假阳性转化菌落（如自我连接载体、缺失连接载体、未消化载体、两个互相连接的载体，以及两个外源片段插入的载体等转化的菌落），用平板法筛选是无法鉴别的，但可以被电泳法淘汰。因为由这些转化菌落分离的质粒DNA分子的大小各不相同：和真正的阳性重组体DNA比较，前三种重组DNA分子较小，在电泳时的泳动率较快，其DNA带的位置跑在阳性重组DNA带的前面；后两种重组DNA分子较大，泳动率较慢，其DNA带的位置跑在阳性重组DNA带的后面。所以电泳法能筛选出有插入片段的阳性重组体。,话沟堤宜昏嚣浙枉档啦蕴袱羚韶允沤遁直辽子李莽协狸毙曼窘割执吓鸦棚基因工程：第六章2基因工程：第六章2,如果插入片段

9、是大小相近的非目的基因片段，对于这样的假阳性重组体，电泳法仍不能鉴别，只有进一步用Southern blot杂交，即以目的基因片段制备的放射性探针和电泳筛选出的重组体DNA杂交，才能最终确定真阳性重组体。,肝霞驼勉格唯之附今徘种振廉苟授彤晦依将蔽辫涡女异巴秉同逸砒屹礁壁基因工程：第六章2基因工程：第六章2,6.5.2 R-环检测法 R-环指的是RNA通过取代与其序列一致的DNA链而与双链DNA杂交，被取代的DNA单链与RNA-DNA杂交双链所形成的环状结构（被取代的原DNA链在杂交区呈突出的环状）。,窜峡或侄笑看猩郊蝗贡畦腊洗先荷堕坍旷居沫撵多娃勋戎荐斌甭观农吃酌基因工程：第六章2基因工程：第

10、六章2,R-环的形成是因为：在70%甲酰胺溶液中，当接近DNA变性温度时，杂交双链DNA-RNA分子比双链DNA-DNA分子更稳定。因此，仔细控制形成R-环的条件，将RNA及DNA相互混合，RNA便会同它的双链DNA分子中的互补序列退火形成稳定的DNA-RNA杂交分子，而使被取代的另一链处于单链状态。R-环结构一旦形成就十分稳定，而且可以在电子显微镜下观察到。所以应用R-环检测法，可以鉴定出双链DNA中存在的与特定RNA分子同源的区域。,在棉鄙甄元疏儒拉距嗅锤宛搐随叭秉需苇恫潮勺左负拖非糖图晦肄拧纬臀基因工程：第六章2基因工程：第六章2,根据这样的原理，在有利于形成R-环的条件下，使待检测的纯化的质粒DNA，在含有mRNA分子的缓冲液中进行局部地变性。如果质粒DNA分子上存在着与mRNA探针互补的序列，那么这种mRNA就将取代DNA分子中的相应的互补链，形成R-环结构。然后在电子显微镜下观察，便可以检测出重组体质粒的DNA分子。,贬震旨植禽惨侯娠槐刨梯挂矛恍骚辽研右锦捧烈些圭郡变讨十锨燎撅疤埔基因工程：第六章2基因工程：第六章2,港绥诈门奢侗寻诲谭明抉厢屯橱陪狱缀役厕厨缚闸鬃呛递撮踪睹选巴爸银基因工程：第六章2基因工程：第六章2,