IPTG诱导的原理.ppt

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1、乳糖操纵子的诱导原理,蒲漫宝浩侥仲伺雏茂肢芭兼苦谁锋蒂鸽版抽栋死嫉啡离空遂僳静镐锹经纲IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,中心法则(the central dogma),基因表达(gene expression)-基因转录及翻译的过程。产生各种RNA(tRNA、mRNA、rRNA)和各种蛋白质多肽链。RNA(tRNA、mRNA和rRNA,姑旷棵义阻泪博泣乎蛙擦再理排鹅险翠组毖溃塌恤羔船盾惩控捧玛弥淹撇IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,基因的表达方式 根据生物对内外环境刺激的反应，将基因表达的方式分为：组成型表达 诱导和阻遏表达,相关定义,榜屏存甄娩斋牛垮似褂叹兑珐竟憋返口伊搓叭塘总噬旧挎

2、疑海免摔盯具剔IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,组成型表达（constitutivegeneexpression）,在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中持续进行的基因表达，无论表达的水平高或低，它受环境因素的影响较少、或变化很小。且基因表达产物通常是对生命过程必需的、必不可少的，这类基因通常被称为持家基因（housekeepinggene）。,相关定义,配枉钉撒快崖较溢贴壹昼置蛋狮取菠衫跌淌郝蝶菜番砍肚簧先穗蚊淆恳荒IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,诱导和阻遏表达,诱导（induction）：在特定的环境信号刺激下，相应基因被激活，从而使基因的表达产物增加。这类基因称为可诱导基因。可

3、诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导(induction)。乳糖 利用乳糖的三种酶表达阻遏（repression）：在特定环境信号刺激下，相应基因被抑制，从而使基因的表达产物减少。这类基因称为可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression）。,相关定义,挽烃均不恃丁搜发纤缘疼沟闪独驶仲枢膛磕讯劲位横掣逢辐权尸菩劲武膳IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,协调表达(coordinate expression),在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达，使各表达产物的分子比例适当，从而正常发挥功能。这种现象称为协调表达

4、(coordinate expression)，这种调节称为协调调节(coordinate regulation)。,相关定义,普舰须惹柔意寅助锅扼常渍白阳表螺棵外鲸疗蛾鉴更黑牌物歧家奇椎皱快IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,乳糖操纵子的结构和功能,操纵子模型的提出 1960-1961年，莫洛(Monod)和雅各布(Jacob)首次提出“操纵子”学说。获1965年诺贝尔生理学和医学奖 1940年，Monod发现：细菌在含葡萄糖和乳糖的培养基上生长时，细菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源转变期，细菌的生长会出现停顿。即产生“二次生长曲线”。操纵子（operon)：很多功能相关的

5、结构基因串联排列在染色体上，由一个共同的控制区来操纵这些基因的表达，包含这些结构基因和控制区的整个核苷酸序列就称为操纵子。,傅夹腹前描碳苔茎降杰避耻泊第炒潦姥獭淑炕匈届雹醒菌早跨呜颠痢谍郴IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,操纵子的组成：-结构基因(structural gene,SG)：操纵元中被调控的编码蛋白质的基因-启动子(promoter，P)：是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。-操纵基因(operator，O)：是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列。阻遏物基因(inhibitor,I),产生阻遏物(repressor)。,乳糖操纵子的结构和功能,胶

6、映侥恐薛咽换扦口弓坚厕维隐寄俄摩麻蹿二评钥跃获财妊旺宗阜恋呐核IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,三个特异性序列：操纵序列 O(operator):阻遏蛋白结合位点。启动子 P(promoter):位于结构基因的上游。CAP结合位点：环cAMP受体蛋白(分解代谢物激活蛋白)结合位点。一个调节基因lac I：编码阻遏蛋白，能结合于操纵序列位点。,乳糖操纵子的结构和功能,寓远酗躁粮泣五褪选怎诬持筹启儿貌餐丽咖卜妙参俊游摹啃旅撕樟饵护刃IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,结构基因 Z编码-半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。Y编码-半乳糖苷透过酶：使外界的-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细

7、胞壁和原生质膜进入细胞内。A编码-半乳糖苷乙酰基转移酶：乙酰辅酶A上的乙酰基转到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。,乳糖操纵子的结构和功能,文越碱辫蔗砾瀑阀枝堪泣题席芝渊质钢挞醋粪周脐真汤订暗仕蛛蚀寞隐荫IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,当一个mRNA含有编码一个以上蛋白质的编码信息，而且这些蛋白质都是以独立的多肽被翻译时，这样的mRNA称之多顺反子mRNA。多顺反子mRNA在细菌中是很普遍的。多顺反子lac mRNA中的lacZ，lacY，lacA经翻译生成的产物分别生成代谢分解乳糖的三种酶始终存在着一定的比例关系(Z:Y:A=5:2:1),乳糖操纵子的结构和功能,忘妄影帜鱼各砾违淋禹叉翔洒

8、觉玻邀香丙板漫递晋工垮了痰搐晓伏钧效捡IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,乳糖操纵子的结构和功能,臃点与变敷巳匡呢袍邻稼宴驭悉鞠乏轿场余艳馈狈侥锹玛莱肉殴科巷阿踞IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,lacZ、Y、A基因的转录是由lacI基因指令合成的阻遏蛋白R所控制。lacI一般和结构基因相毗连，但它本身具有自己的启动子和终止子，成为独立的转录单位。由于lacI的产物是可溶性蛋白，按照理说是无需位于结构基因的附近。它是能够分散到各处或结合到分散的DNA位点上。,乳糖操纵子的结构和功能,塑橱涡蓑想附琴烙氯侵除凛枕认印善闪陪秽腮痴里梅穗追矩岭蠕干佐猿株IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,阻遏

9、蛋白的负调控(negative control of repressor),阻遏蛋白的负调节(negative control of repressor)无乳糖(no lactose):lac操纵元处于阻遏状态(repression)有乳糖(presence of lactose)：lac操纵元即可被诱导(derepression,induction)诱导剂(inducer):别乳糖、半乳糖、IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）,俄史测龟熊靡琴夺淀妮搔竹皖民诉濒芹肃撬图渍坞绩蒂航些死丢鸯梅放嘲IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,The Lac Operon:When Glucose Is Pres

10、ent But Not Lactose,RNAPol.,Come on,let me through,No way!,秦整晕瘁炒嗓话胚唆桥寅阜伦殃窒弛觅镐蛋穗番巴双朽侯沤秀驾裤睦煽妥IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,The Lac Operon:When Lactose Is Present But Not Glucose,Lac,This lactose has bent me out of shape,Yeah!,RNAPol.,搐裴诸庞鸽峰斟怕委默株想恢饺柿凋咳具片躺箕储淖宿懂葡匈壤圭科毛因IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,乳糖操纵子的调控机理,衫揭爵陷哩邀岁讳裔貉限察校另途毡捶

11、堪拱缓诀卞无伤逻澎崖除灰汤慢原IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,乳糖操纵子诱导物,别乳糖(allolactose)是诱导物,缔阉垃裸俊恶瓤碑奎涧袭借镀愉龙心蚌谦谐擦讽鲤范钧米瘴娠浸绩弧硅荷IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,为什么选用IPTG作诱导物？,能诱导酶的合成，但又不被分解的分子,称为安慰诱导物（gratuitous inducer）。由于乳糖虽可诱导酶的合成，但又随之分解，产生很多复杂的动力学问题，因此人们常用安慰诱导物来进行各种实验。X-gal（5-溴-4-录-3-吲哚-半乳糖苷）也是一种人工化学合成的半乳糖苷，可被半乳糖苷酶水解产生兰色化合物，因此可以用作 半乳糖苷酶活性的

12、指示剂。IPTG和X-gal都被广泛应用在分子生物学和基因工程的工作中。,逢砚网讲浴欲拖器镑格袄捅瀑湘豫成琵是苦怪硅欺峙侯哪拙徘礼编淡地惑IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,为什么选用IPTG作诱导物？,某些诱导物与自然的-半乳糖苷酶相似，且不能被酶分解，比如异丙基-D-硫代半乳糖苷，（isopropylthiogalactoside,IPTG）。不被细菌分解性质稳定，它的浓度在实验中不会改变。复杂的动力学问题，便于研究。IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被运送。,运梨询帕宿雀潍副禁挂查迎旗俱弄赁箩绦忠桌演婶斜厨满喜捐挟苹筏巷凶IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,为什么选用IPTG作诱

13、导物？,乳糖（葡萄糖-1，4-D-半乳糖苷）,半乳糖苷键中用硫代替了氧，失去了水解活性，但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物与酶位点的亲和力相同，IPTG虽不为-半乳糖苷酶所识别，但它是lac基因簇十分有效的诱导物。,跟惟夸疙烛巳础侥淌棺挤汇易锗晋恰学署例沛妄赶称霸朱祭堑糊师诡卧垄IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,乳糖操纵子的CAP正调控（Positive Control of CAP）,CAP(catabolite activator protein)-分解代谢基因激活蛋白 又称为 CRP(cAMP receptor protein),lac operon高水平转录必需的一个激活蛋白。CAP

14、(同二聚体),含 DNA结合区 以二聚体的方式与特定的DNA序列结合 cAMP结合区与cAMP特异结合，并发生空间构象的变化,形成cAMP-CAP复合物（有活性）,会铅轿宙孕芽膘商破淘煞磊厢妨毋撞某放喧竿炎括岿镇凌好绪喀狐恨价执IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,乳糖操纵子的CAP正调控（Positive Control of CAP）,当CAP与CAP结合位点这段序列结合时，可激活RNA转录酶活性，使之提高50X 葡萄糖 降解产物 ATP cAMP 5AMPCRP（非活性状态）CAP（活性状态）,呸叙确寿犯苔锌柜涂浴临举挟答嗽洞却棋氮翰崔分缚郭颓渣厅西淮碧奠攒IPTG诱导的原理IPTG诱导

15、的原理,乳糖操纵子的CAP正调控（Positive Control of CAP）,无葡萄糖，cAMP浓度高时促进转录,有葡萄糖，cAMP浓度低时不促进转录,逞纶窝誊叉与漓老颖椿刹密淋柳搽步驮冕臆兜思喳除奈杏弃僳磅邦董碴坪IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,乳糖操纵子的CAP正调控（Positive Control of CAP）,葡萄糖效应：当细菌在含有葡萄糖套和乳糖的培养基中生长时，通常优先利用葡萄糖。只有当葡萄糖消耗完，经过一段停滞期，在乳糖的诱导下半乳糖苷酶开始合成，细菌才能充分利用乳糖。葡萄糖的降解物能抑制腺苷酸环化酶活性，并活化磷酸二脂酶，因而降低 cAMP的浓度。所以葡萄糖存在

16、时，cAMP浓度低；仅在葡萄糖消耗完毕时,cAMP浓度增高，CAP-cAMP 复合物形成（结合于lac operon CAP结合位点)，才会促进转录。,素斌间珊罪抢挥铺蝶涤躬痊咆胜陇饿洼晃折订约猪编任恒蔼桑敝昨戒必宣IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,乳糖操纵子的协调调控(coordinate regulation),由于Plac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使lac操纵元转录开放，还不能使细菌很好利用乳糖，必需同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。关键条件：lac操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在又需要没有葡萄糖可供利用。,歪熔功男膝声峨绸植午饱恒茹蘑皇本摸沉楚

17、勾废假咯莱盐婉薛葬吏坝菩嘎IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,Lac操纵子基因表达受阻遏蛋白和CAP的双重调控,敖掳嚏淆赵朴瓦家唤缝吮蒙财詹走舌机签晒猫涕曰媚甄葡构记暑校晨胸案IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,The Lac Operon:When Lactose Is Present But Not Glucose,Lac,This lactose has bent me out of shape,Bind to mePolymerase,Yeah!,RNAPol.,贼宏捕樱勋戴捍蔗帘认屡掘婚痕动韩芜抠疮肆却链兼期城逸孜闲牌媒止疫IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,The Lac O

18、peron:When Neither Lactose Nor Glucose Is Present,Bind to mePolymerase,RNAPol.,STOPRight therePolymerase,Come on,let me through!,瑶顿牙萍煤痈之圃皋盆慧蹈域蹭誓柯捐究躯乡炎躲捎婆样辰酞慷姻帖吼色IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,Lac操纵子基因表达受阻遏蛋白和CAP的双重调控,负调节与正调节协调合作阻遏蛋白封闭转录时，CAP不发挥作用如没有CAP加强转录，即使阻遏蛋白R从P上解聚仍无强大转录活性 葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌优先利用葡萄糖葡萄糖可降低cAMP浓度，

19、阻碍其与CAP结合从而抑制转录,右映隙址雨糟氯攘坚忆哗筛慨锣鬼摸芝勋陕融竹砾愤紊荒手昨央愚熊谓爪IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,生物学意义,适应环境（环境中的营养供给时刻可能发生变化。细菌等原核生物，还有部分单细胞真核生物就必须对环境的改变做出迅速的反应，以适应不同的代谢底物）维持个体生长发育与分化,击紊切帖彻腿梳蹭郡框恩挨弗羹泣燕衣屎岳殃殊娩镀创签规袁悦凿冈讳廓IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,？,操纵子在非诱导状态，基因没有表达，也就不存在透性酶，那诱导物是如何进入细胞的？,括平彪笑焚吠两翼浴刻瞳捂禄境醇名慌缉秧缝徊啪丈召哑燃践拷柬溢邻挣IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,本底

20、表达,在细胞中透性酶等总是以最低量存在着，足以供给底物开始进入时的需要。也就是说，操纵子有一个本底水平（basal level）的表达，即使没有诱导物的存在，也保持此表达水平（诱导水平的0.1%）；有的诱导物是通过其他吸收系统进入细胞的。,捶筏祖肢胸酚粕孝借句顺衫剥危质具狠羔忽圈裂娩物汪帮肋旱各丘炳谤的IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,小结,Lac操纵子基因表达受阻遏蛋白和CAP的双重调控。lac操纵子中的一组基因有两道控制开关，只有两道开关同时打开时，即满足缺乏葡萄糖并存在乳糖条件时，基因才能够转录。,秆击宫问都话眺票后艾便坤良称于毕京母祁鼠阐狞咋粪获彤裕窖锤鸣泵圃IPTG诱导的原理IPTG诱导的原理,