发酵液的预处理和固液分离.ppt

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1、1,第二章 发酵液的预处理和固液分离,2,生物技术下游加工过程的一般步骤,3,预处理和固液分离内容,固液分离,发酵液,胞外上清液/滤液,预处理,提取生化物质的第一步，分两部分：,胞内富集细胞,4,发酵液成分很复杂，包含菌（细胞）体，胞内外代谢产物，及剩余的培养基残分等。不管人们所需要的产物是胞内还是胞外，都首先要进行培养液的预处理和固液分离开，才能进行后续操作：对于胞外产物，可先将菌体或其他悬浮杂质去除，才能从澄清的滤液中提取代谢产物。对于胞外产物，首先富集菌体，再进行细胞破碎和碎片分离，然后提取胞内产物。,5,2.1 发酵液的预处理（Pretreatment）,6,为何要对发酵液进行预处理？

2、,发酵液的基本特性发酵产物浓度较低，大多为1-10%，悬浮物颗粒小，细胞的相对密度与培养液相似。可压缩性液相粘度大，大多为非牛顿型流体；悬浮状态稳定：双电层、水化膜、布朗运动,7,为何要对发酵液进行预处理？,固液分离方法主要是过滤和离心。对于细菌及某些放线菌，菌体细小，液体粘度大，不能直接过滤，若用高速离心，能耗很大，设备昂贵。若用膜分离技术（如微滤）易产生膜污染，通量降低。发酵液中由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它有机粘性物质的存在也会影响固液分离。因而寻找一种经济有效的方法来提高固液分离速度显得十分必要。预处理是生化物质分离纯化过程中必不可少的首要步骤,8,预处理的目的,促进从悬浮液中分离固

3、形物的速度，提高固液分离的效率：改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度。相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子、杂蛋白质、及色素、热原质、毒性物质等有机物质），以利于后续各步操作。尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）；,9,预处理的方法,凝聚和絮凝 Coagulation and flocculation 加热法 Heating调节悬浮液的pH值 Regulation of pH杂蛋白的去处 Removal of useless protein高价无机离子的去处 Removal of inorganic ion助滤剂Filter aids和反应剂

4、 Reactant,10,一 凝聚和絮凝在发酵液预处理中的应用,凝聚与絮凝处理过程就是将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使其聚集起来,增大体积以便固液分离。凝聚和絮凝技术常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中。,11,凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成mm 大小块状凝聚体的过程。絮凝：指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10 mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。,凝聚和絮凝,12,凝聚：胶体粒子在中性盐促进下脱稳相互聚集

5、成大粒子（1mm）机理：1）中和粒子表面电荷 2）消除双电层结构3）破坏水化膜,（一）凝 聚 Coagulation,13,发酵液中菌体表面带有负电荷，由于静电引力使溶液中反离子被吸附在其周围，在界面上形成了双电层。正离子同时受到使它们均匀分布的热运动影响，具有离开胶粒表面的趋势。,胶体双电层结构,14,两种相反作用力下，双电层分裂成两部：1）吸附层或stern层；2）扩散层。形成了扩散双电层的结构模型(Gouy-Chapman-Stern model)。,胶体双电层结构,15,吸附层：距胶核表面约一个离子半径的Stern平面以内，正离子被紧密结合在胶核表面，不流动。分散层：紧密层外围反离子浓

6、度逐渐降低直至达到主体溶液的平均浓度。滑移面：当胶体粒子在溶液中作相对运动时，总有一薄层液体，随着它一起滑移，这一薄层，厚度比吸附层稍大。,16,胶体双电层结构,不同界面上形成不同的电位:胶核表面的电位s是整个双电层的电位;Stern平面上的电位为d;滑移面上的电位为,称电位（电动电位）。,图 2-1,17,电位是控制胶粒间电排斥作用的电位，用来表征双电层的特征，并作为研究凝聚机理的重要参数。带电粒子间的静电相互作用取决于电位的大小。当双电层的电位足够大时，静电排斥作用抵御分子间的相互吸引作用，使蛋白质溶液处于稳定状态。,18,电位的计算：,D 水的介电常数；q 胶体的电动电荷密度，即滑移面上

7、的电荷密度；扩散层的有效厚度，即为吸附层和扩散层界面处电位d降低到其值为1/e处的距离，不能直接测定.,式 2-1,19,扩散层的有效厚度,式中 N 阿伏伽德罗常数；T 热力学温度：k 波尔兹曼常数；e 电子电荷；Zi i种反离子的化合价；Ci i种离子的摩尔浓度。,式 2-2,20,双电层与凝聚,由式（21）和式（22）可知，电位与扩散层厚度和电动电荷密度q成正比，而扩散层厚度又与溶液中反离子强度和电荷成反比。对带负电性菌体的发酵液，高价阳离子的存在，可压缩扩散层的厚度，促使电位迅速降低，而且化合价越高，这种影响越显著。,21,凝聚价或凝聚值,在发酵液中加入具有高价阳离子的电解质，能脱除胶粒

8、表面的水化膜，降低电位，使双电层的排斥力减少，当不足以抗衡胶粒间的范德华引力时，由于热运动的结果导致胶粒的互相碰撞而聚集起来。电解质的凝聚能力可用凝聚价或凝聚值来表示，使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（毫摩尔升），称为凝聚价或凝聚值。,22,SchulzeHardy法则：反离子的价数越高，凝聚价越小，即凝聚能力越强。阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力受化合价、水化半径、离子运动能力的影响，次序为,Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+,23,常用的凝聚剂电解质有：,硫酸铝 Al2(SO4)318H2O（明矾）；氯化铝 AlCl36H2O;三氯化铁 FeCl3;硫酸亚铁 FeSO47

9、H2O；石灰；ZnSO4；MgCO3,24,絮凝：大分子聚电解质将胶体粒子交联成网状，形成絮凝团的过程机理：架桥作用采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。,（二）絮 凝 flocculation,25,絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括离子基团以及非离子型基团。它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生架桥联结时，就形成较大絮团，产生絮凝作用。,絮 凝,26,高分子絮凝剂的吸附架桥作用,27,可分为四类：人工合成有机高

10、分子聚合物、天然有机高分子聚合物、无机高分子聚合物、微生物絮凝剂1）目前常用的是人工合成有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚乙烯亚胺衍生物；聚丙烯酸类和聚苯乙烯类衍生物。,工业上使用的絮凝剂,28,高分子聚合物絮凝剂根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类：阴离子型（含有羧基)、阳离子型（含有胺基）、非离子型,29,聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点用量少，一般以mg/L计量；絮凝体粗大，分离效果好；絮凝速度快；种类多，适用范围广。,聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点：存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。,目前最常见：聚丙烯酰胺类絮凝剂,30,2）天然有机高分子絮凝剂,人

11、工合成有机高分子絮凝剂虽然发展很快，但还存在着残留单体有毒，生物降解难等问题，所以其应用受到了限制。天然有机高分子絮凝剂具有无毒，易生物降解，原料来源广等优点。天然有机高分子改性絮凝剂根据其原料来源不同可分为淀粉类、纤维素类、植物胶类和聚多糖类。其中淀粉改性絮凝剂的研究开发最引人注目。,31,3）无机高分子聚合物,有聚合铁系和铝系两大类铁系絮凝剂具有操作简单、费用低，受温度影响小，亲和力强，能有效地去除悬浮物、表面活性剂、破坏油水乳状液的能力很强等优点，缺点腐蚀性强、稳定性差。铝系是目前应用广、工艺较成熟的一类无机金属盐絮凝剂，絮凝效果好，缺点具毒性等。,32,微生物絮凝剂,微生物絮凝剂是近年

12、来研究和开发的新型絮凝剂，一类由微生物或其分泌物产生的具有絮凝细胞功能的代谢产物。包括直接利用微生物细胞的絮凝剂、利用微生物细胞壁代谢产物的絮凝剂和克隆技术所获得的絮凝剂 主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相比，最大的优点是安全，无毒和不污染环境。,33,微生物絮凝剂,1、微生物絮凝剂的商业化生产始于20世纪90年代，如红平红球菌及由此制成的NOC-1是目前发现的最佳微生物絮凝剂 2、微生物絮凝剂或将大部分替代普通絮凝剂3、浮游藻类、草分枝杆茵、硅酸盐芽孢杆菌。,34,絮凝的影响因素,发酵液的性质（细胞浓度，表面电荷）；絮凝剂的浓度，

13、最佳用量为粒子表面积约有一 半被聚合物覆盖；絮凝剂的分子量；pH 控制；搅拌速度。,35,a.絮凝剂浓度 浓度增加有助于架桥充分，但是过多的加量会引起吸附 饱和，在胶粒上形成覆盖层而产生再次稳定现象。最佳用量为粒子表面积约有一半被聚合物覆盖；,36,分子量提高、链增长，可使架桥效果明显；但分子量不能超过一定的限度，因为随分子量提高，高分子絮凝剂的水溶性降低，因此，分子量的选择应适当。,b.高分子絮凝剂分子量,37,溶液pH的变化会影响絮凝剂功能团的电离度，从而影响分子链的伸展形态。电离度增大，链节上相邻离子基团间的电排斥作用，使分子链从卷曲状态变为伸展状态，架桥能力提高。,c.溶液pH,38,

14、对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理，单独使用可达到较好絮凝效果；对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果。这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。,（三）混 凝,39,二 预处理-加热,1）加热降低液体粘度流体力学原理：过滤速率与液体的粘度成反比，降低液体粘度（加水稀释法和加热法等）可有效提高过滤速率。液体黏度是温度的指数函数，升温是降低黏度的有效措施。,加热是发酵液预处理最简单最常用的方法。加热能改善发酵液的操作特性。,麦芽汁的黏度-温度曲线。,40,二 预处理-加热,2）加热使蛋白质

15、变性凝固 变性蛋白质的溶解度小。如柠檬酸发酵液加热至80以上，可使蛋白质变性凝固，过滤速度加快。加热处理只适用于对热较稳定的液体。注意加热温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。有时加热会增加发酵液的颜色增加后处理的难度。,41,三 预处理-调节pH,pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。细胞(碎片)及某些胶体物质在某个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。调节发酵液的pH到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方法。大幅度改变pH还能使蛋白质变性凝固。通过调整pH值改变膜过滤中易吸附分子的电荷性质，可减少膜堵塞和污染；影响离子型絮凝剂

16、的电离度。,42,0,0,200,400,600,6,12,18,pH 4.6,pH 4.2,pH 3.8,pH 2.8,Filtrate Volume,cm,3,Time,minutes,Fig The effect on filtrate volume of pH,43,案例 链霉素生产中，采用调pH至酸性pH3.0，加热至70，维持半个小时的方法来使蛋白变性，能使过滤速度增大10-100倍，滤液粘度可降低1/6。,44,四 加入惰性助滤剂（filter aids）,助滤剂是一种颗粒均匀，质地坚硬，不可压缩的粒状惰性物质。在发酵液中加入固体助滤剂，则菌体可吸附于助滤剂微粒上，助滤剂就作为胶

17、体粒子的载体，均匀地分布于滤饼层中，降低了滤饼的可压缩性，减小了过滤阻力。目前生物工业中常用的助滤剂是硅藻土，其次是珍珠岩粉、活性炭、石英砂、石棉粉、纤维素、白土等。,45,助滤剂的选择,(1)粒度根据悬浮液中的颗粒和滤液的澄清度确定，一般颗粒较小的滤饼应采用细小的助滤剂。(2)助滤剂的品种应根据过滤介质选择助滤剂品种。使用粗目滤网时易泄漏，可选择石棉粉、纤维素；采用细目滤布时，可使用细硅藻土；(3)用量间歇操作时，过滤介质表面预涂助滤剂，其厚度应不小于2mm。连续过滤机中根据过滤速度确定。使用硅藻土时，通常细粒为500g/m3，中等粒度700g/m3,粗粒700-1000g/m3。,46,五

18、.加入反应剂,加入某些不影响目标产物的反应剂，可消除发酵液中的一些杂质对过滤的影响，从而提高过滤速度。1）加入反应剂与某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀,生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，又能使蛋白质凝固，过滤性能上升，沉淀本身可作为助滤剂.如在新生霉素发酵液中加入CaCl2和Na3PO4，生成Ca3(PO4)2沉淀。2）发酵液中含有不溶性多糖物质时，用酶将其转化为单糖，以提高过滤速率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀粉酶，搅拌30min后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可提高过滤效率5倍。,47,发酵液中的杂质,高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+

19、）杂蛋白,常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞，影响过滤效率。采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化，使两相分离不清。,因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。,六、发酵液的相对纯化,在采用离子交换提取时，会影响树脂对生化物质的交换容量。,48,（一）高价无机离子的去除方法,Ca2+草酸、草酸钠，形成草酸钙沉淀（注意回收草酸）；Mg2+三聚磷酸钠，形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物；Fe2+黄血盐，普鲁士兰沉淀,49,（二）杂蛋白的去除方法,沉淀法precipitation变性法 Denaturation吸附法 adsorption,50,1.杂蛋白

20、去除-沉淀法 precipitation,A 等电点沉淀法（isoelectric precipitation）蛋白质的等电点大都在酸性范围内(pH4.05.5)，调节发酵液的pH到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方法。,B.酸碱调节，使蛋白质与离子形成沉淀在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子形成沉淀，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、苦味酸盐等；在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子形成沉淀，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等。,51,2.杂蛋白去除-变性 Denaturation,蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程称为变性。变性蛋白质溶解度较小。加热，大幅度调节pH值，加酒精、丙酮等有机溶剂或表面

21、活性剂等。,不足之处：加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。,52,2蛋白质变性例子,链霉素生产中，采用调pH至酸性（pH3.0），加热至70，维持半个小时的方法来使蛋白变性，能使过滤速度增大10-100倍，滤液粘度可降低1/6。柠檬酸发酵液，采用加热至80以上，使蛋白质变性凝固和降低发酵液粘度，从而大大提高了过滤速度。,53,3.杂蛋白去除-吸附法 adsorption,加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。四环类抗生素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾K2Zn3Fe(

22、CN)52的胶状沉淀来吸附蛋白质，利用此法除蛋白质已取得很好的效果。在枯草杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢二钠，这两者本身生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，从而加快了过滤速度。,54,2.2 固液分离,55,一 影响发酵液固液分离的因素,1）发酵液中悬浮粒子的大小,56,2）发酵液的黏度viscosity：固液分离速度通常与粘度成反比，粘度越大，固液分离越困难。影响粘度的因素：菌体的种类和浓度（重要因素），通常丝状菌、动物或植物细胞悬浮液粘度较大，浓度增大，粘度也提高。培养液中蛋白质、核酸大量存在：通常细胞破碎或细胞自溶后粘度增大。因此细胞破碎的程度应控制

23、，发酵放罐时间要适宜。培养基成分：如用黄豆粉、花生粉作氮源，淀粉作碳源，粘度都会升高。此外，某些染菌发酵液，如染细菌，则粘度会增大。发酵过程的不正常处理，如大量过剩的培养基和消沫油加入，都会使粘度增大。,影响发酵液固液分离的因素,57,收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相，收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物（细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等）。,固液分离的目的包括两方面：,58,二 常见的固液分离方法,过滤 filtration离心 Centrifugation 膜分离 membrane separation双水相萃取 ATPS扩张床吸附 EBA,59,2.2.1

24、过 滤 filtration,过滤操作是借助于过滤介质，在一定的压力差P作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。过滤介质filter medium:过滤采用的多孔物质；滤浆filter pulp:所处理的悬浮液；滤液filtrate:通过多孔通道的液体；滤饼或滤渣 filter cake:被截留的固体物质。,60,滤饼过滤：,当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布阻拦而逐渐形成滤饼（滤渣）。在滤饼过滤中，当滤饼至一定厚度时即起主要的过滤作用适合于固体含量大于0.1%的悬浮液的过滤分离。,61,过滤推动力：悬浮液自身压强差、重力悬浮液的外加压力过

25、滤介质的抽真空离心力过滤阻力：介质阻力：可视为不变，且一般过滤初较明显滤饼阻力:滤饼厚度：随过滤进行而增加滤饼特性：颗粒形状、大小。大多情况下，过滤阻力主要取决于滤饼阻力。,62,滤饼的质量比阻,衡量过滤特性的主要指标是滤饼的质量比阻rB，它表示单位滤饼厚度的阻力系数。与滤饼的结构特性有关。对于不可压缩性滤饼，rB为常数，但对于可压缩性滤饼，rB是操作压力差的函数：rBr(P)m（2-3）r-不可压缩滤渣的比阻，对于一定的料液为常数；m-压缩性指数，一般取0.50.8，对不可压缩性滤饼m为0。可压缩滤饼:形成的滤饼刚性不足，其内部空隙结构随着滤饼的增厚或压差的增大而变形，空隙率减小.,63,滤

26、饼的质量比阻与过滤关系,滤饼的比阻值是随操作压力差的提高而增大的。开始过滤时应注意不能很快提高压差，通常靠液柱的自然压差进料，并应缓慢地，逐步地升高压力，一般在相当长的时间内，压力差不要超过0.05 MPa，最后的压差也不超过0.30.4 MPa。若操作压力控制过高，由于比阻值的急剧增加，会使过滤速度很快下降，以至达到不能继续过滤的程度。,64,恒压下的过滤方程,恒压下，可压缩性滤饼的比阻应为常数。如过滤介质的阻力相对较小可以忽略不计，,q 到瞬间，通过单位过滤面积的滤液量，m3；P 压力差，Pa；滤液粘度，Pas；rB 滤饼的重量比阻，m/kg；XB 通过单位体积滤液所形成的滤渣重量(干重)

27、,kgm3；过滤时间，s,65,过滤速度的强化,1降低滤饼比阻力rB 一切能够降低rB的方法：如添加电解质、絮凝剂、凝固剂助滤剂等。2降低滤液黏度 黏度愈低，过滤阻力愈小。加热、去杂蛋白、絮凝、调pH、选择合适的放罐时间。3降低悬浮液中悬浮固体的浓度过滤速度与获得滤饼体积成反比。因此应尽可能降低培养基配料浓度（如玉米粉、豆饼粉的浓度）。4.对发酵液进行预处理，改善滤液性质。,66,质量比阻的计算,质量比阻可根据式24，利用图解法求得。以/q为纵轴，以q为横轴所得的直线斜率为M，则rB可按下式计算：,根据滤饼的质量比阻值，可衡量各种不同发酵液过滤的难易程度。真菌的菌丝比较粗大,如青霉素的重量比阻

28、为(0.15一0.20)xl012 m/kg左右，发酵液容易过滤。放线菌发酵液菌丝细而分枝,交织成网络状,如链霉素重量比阻为2000 x1012m/kg左右,过滤较困难,一般需经预处理。细菌发酵液的菌体更细小，质量比阻值更大，直接过滤十分困难。,2,67,2 过滤介质选择,过滤介质起过滤作用，还是滤饼的支撑物。应具有足够的机械强度和尽可能小的流动阻力。合理选择过滤介质：过滤介质所能截留的固体粒子大小：通常以过滤介质的孔径表示。常用的过滤介质中，纤维滤布所能截留的最小粒子约10m，硅藻土为lm，超滤膜可小于0.5m。过滤介质的透过性：是指在一定的压力差下，单位时间单位过滤面积上通过滤液的体积量，

29、它取决于过滤介质上毛细孔径的大小及数目。,68,过滤介质-织物介质,又称滤布，应用最广泛，包括由棉、麻等天然纤维滤布和合成纤维滤布。其过滤性能受许多因素的影响，其中最重要的是纤维的特性、编织纹法和线型。,69,过滤介质-粒状介质,有硅藻土、珍珠岩粉、细砂、活性炭、白土等。最常用的是硅藻土，是优良的过滤介质：一般不与酸碱反应，化学性能稳定；形状不规则，空隙大且多孔，具有很大的吸附表面；无毒且不可压缩，形成的过滤层阻力不随操作压力变化。硅藻土过滤介质通常有三种用法：（1）作为深层过滤介质。硅藻土过滤层具有曲折的毛细孔道，借筛分、吸附和深层效应作用除去悬浮液中的固体粒子，截留效果可达到1m。（2）作

30、为预涂层。在支持介质的表面上预先形成一层较薄的硅藻土预涂层，用以保护支持介质的毛细孔道不被滤饼层中的固体粒子堵塞。（3）用作助滤剂。,70,过滤介质-多孔固体介质,如多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料等，可加工成板状或管状，孔隙很小且耐腐蚀，常用于过滤含有少量微粒的悬浮液。,71,典型过滤设备：,按操作方式分类：间歇过滤机、连续过滤机,按操作压强差分类：压滤、吸滤和离心过滤,实验室用抽滤装置板框压滤机（间歇操作）转筒真空过滤机（连续操作）过滤式离心机,固液分离过滤设备,72,1）实验室用抽滤装置,73,2）板框压滤机plate and frame filter,板框压滤机的过滤推动力来自泵产生的液压

31、或进料贮槽中的气压。,广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量1-10%的悬浮液的分离。,74,板框压滤机,包括板和框，多做成正方形，角端均开有小孔，装合压紧后即构成供滤浆或洗水流通的孔道。框的两侧覆以滤布，空框与滤布围成了容纳滤浆及滤饼的空间，滤板用以支撑滤布并提供滤液流出的通道。,75,板框式压滤机在过滤时，悬浮液由离心泵或齿轮泵经滤浆通道打入框内，滤液穿过滤框两侧滤布，沿相邻滤板沟槽流至滤液出口，固体则被截留于框内形成滤饼。滤饼充满滤框后停止过滤。,76,板框压滤机,优点,过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，对不同过滤特性的发酵液

32、适应性强。它最重要的特征是通过过滤介质时产生的压力降可以超过0.1MPa,这是真空过滤器无法达到的。,缺点,不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非过滤的辅助时间较长。,77,自动板框式压滤机,自动板框压滤机在板框压紧；卸饼、清洗等操作中可自动完成，劳动强度小，辅助操作时间短。自动压滤机结构复杂，价格昂贵，在一定程度上限制了它的应用和发展。,78,3）真空转鼓过滤机（rotary-drum vacuum filter）,真空过滤设备以大气与真空之间的压力差作为过滤操作的推动力。生物工业中，用得较多的是转筒式真空过滤机和带式真空过滤机。转筒真空过滤机的结构转筒真空过滤机是一种连续操作的

33、过滤设备，设备的主体是一个由筛板组成能转动的水平圆筒，表面有一层金属丝网，网上覆盖滤布,圆筒内沿径向被筛板分隔成若干个空间。,79,转筒真空过滤机结构：,80,转筒下部浸入滤浆槽中，浸没角约900-1300，圆筒缓慢旋转时(转速约0.5-2rmin)，筒内每一空间相继与分配头中的3个室相通，可顺序进行过滤、洗涤、吸干、吹松、卸饼等项操作。即整个圆筒分为过滤区、洗涤及脱水区，卸渣及再生区3个区域。,81,转筒真空过滤机,优点：转筒真空过滤机可吸滤、洗涤、卸饼、再生连续化操作，生产能力大，劳动强度小，缺点：辅助设备多，投资大，且由于真空过滤，推动力小（不超过8104 Pa），滤饼湿度大（2030）

34、。主要适用霉菌发酵液，对菌体细小、黏度大铺助滤剂。对于滤饼阻力较大的物料适应能力较差。,82,带式真空过滤机,带式真空过滤机（是自动连续运转、并能按工艺要求进行无级调速以及操作方便和动力消耗低的一种新型高效的脱水设备。,83,带式真空过滤机流程,1、进料过滤滤饼洗涤吸干卸料滤布清洗连续进行，配有PLC控制，自动化程度高。2、真空过滤盘分段设计，可满足不同物料过滤、洗涤、吸干的工艺要求，滤带运行速度采用变频无级调速，对不同物料有广泛的适应性。3、在同一设备上可采用多次逆流洗涤得到高浓度的滤液，也可采用并流洗涤或顺流洗涤获得高纯度的滤饼。,84,结构：,转鼓(上有小孔，亦称悬框)；滤网；滤布；机架

35、。,原理：,由于离心力作用，液体产生径向压差，通过滤饼、滤网及滤筐而流出。,4）离心过滤机（centrifugal filter）,85,几种过滤设备的比较,86,5）硅藻土过滤机 diatomite filter,硅藻土中的硅藻有许多不同的形状，由于硅藻土具有细腻、松散、质轻、多孔、吸水和渗透性强的特性，所以它是一种性能优良的工业滤剂。硅藻土过滤是以硅藻土作为过滤介质，它是一种预涂型过滤器，预涂、过滤、反冲洗是硅藻土过滤的一般工艺过程。在酿造、饮料、酒类和水处理等方面得到广泛应用。目前，国内主要用于酒类和饮料过滤,87,硅藻,88,硅藻土过滤机,89,又称切向流过滤（Cross-Flow F

36、iltration）传统过滤时过滤液体垂直于过滤介质，过滤阻力主要来之滤饼。错流过滤打破了传统过滤的机制，即液体的流向和滤膜相切。在压力推动下，悬浮液以高速在管状滤膜的内壁作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走，而附着在滤膜上的滤饼很薄，因而能在长时间内保持稳定不变的过滤速度,）错 流 过 滤,90,微滤过程示意图,料液快速经过薄膜,以减少形成滤饼,错 流 过 滤,91,朗极化工公司膜澄清过滤和膜浓缩的“错流过滤系统”陶瓷膜,错 流 过 滤,92,错流过滤特点,收率高（97-98%）质量好减少处理步聚染菌罐也能进行处理介质阻力大不能得到干滤饼需要大的膜面积目前适用于小分

37、子的分离,2.2 固液分离2.2.2 离心,94,一、基本原理,对于浓度较小，粒径较大，硬度较强的不溶物，可以采用过滤分离。但当固体颗粒细小而难以过滤时，发酵液不易被过滤纯化，离心操作往显得十分有效。离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。动植物细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离等常用离心分离。,95,优点：分离速度快，分离效率高、液相澄清度好；缺点：与过滤设备相比，设备投资高、能耗大、离心产生的固体浓缩物和过滤产生的浓缩不同。通常情况下离心只能得到一种较为浓缩的悬浮液或浆体。而过滤可获得的水分含量较低的滤饼。,离心分离,96,按速度和离心

38、力：1、常速离心机 最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)104g以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；2、高速（冷冻）离心机 1104-2.5104rpm，相对离心力104105g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；3、超速离心机 转速2.5104-8104rpm，相对离心力5105g；用于DNA、RNA、蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。,二、离心机的种类与用途,97,按离心机的作用方式：斜角式平抛式管式碟片式螺旋式多室,98,1）斜角式离心机是一类结构最简单的实验室常用离心机，指离心管腔与转轴成一定倾角的转子；角度越大，

39、沉降越结实，分离效果越好，角度越小，颗粒沉降距离短，沉降速度快，但分离效果差。颗粒在角转子中沉降时，先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧会出现颗粒沉积。,99,1）斜角式离心机,结构稳定，可装载较多的样品使用较高的转速。加速或减速时，对样品有搅动。有些梯度离心要求用角转头，否则形成的梯度不均一，线性很差,100,2）平抛式离心机平抛式离心机一类结构简单的实验室常用的低中速离心机，转速一般在3000-6000rpm。颗粒在水平转子中的沉降是沿管子轴向移动。样品便于收集受振动和变速搅乱后对流现象小，但转头结构复杂，最高转速相对要低容量也小一些。,101,平抛式离心机转子,1

40、02,）管式离心机（tubular-bowl centrifuge）,管式离心机具有一个细长而高速旋转的转鼓，转鼓内装有纵向平板，其下部有进料口，上部两侧有重液相和轻液相出口。,103,管式离心机,待处理的物料在一定压力（3104 Pa左右）下由进料管经底部空心轴进入鼓内，靠挡板分布于鼓的四周，并使料液迅速达到与转鼓相同的角速度。转鼓带动物料高速旋转，在离心力下，悬浮液沿转鼓内壁向上流动的料液，因其密度差的存在而分离。澄清后的液相流动到转鼓上部的排液口排出。比重大的固体微粒逐渐沉积在转鼓内壁 形成沉渣层，达到一定数量后，停机人工清除。,104,管式离心机特点：结构简单，可提供较大离心力，转速高

41、，分离因数高达15000-65000。管状离心机可以冷却，有利蛋白质分离间歇操作，须定时拆卸、清洗适用于于分离乳浊液及含细颗粒的稀悬浮液，适用于固含量低于1%，颗粒度小于5m，黏度大的悬浮液澄清或固液两相密度差较小的分离。,105,4）碟片式离心机disk-bowl centrifuge,是在管式离心机的基础上发展起来的，在转鼓中加入了许多重迭的碟片，缩短了颗粒的沉降距离，提高了分离效率。是生物工业中应用最为广泛的一种离心机 有一个密封的转鼓，内装十至上百个锥顶角为60100的锥形碟片。碟片间的距离一般为0.5-2.5mm,106,碟片式离心机工作原理,当悬浮液在动压头的作用下，经中心管流入高

42、速旋转的碟片之间的间隙时，便产生了惯性离心力，其中密度较大的固体颗粒在离心力作用下向上层碟片的下表面运动，而后在离心力作用下被向外甩出，沿碟片下表面向转子外围下滑，而液体则由于密度小，在后续液体的推动下沿着碟片的隙道向转子中心流动，然后沿中心轴上升，从套管中排出，达到分离的目的,107,5）螺旋式离心机scroll-type centrifuge,连续操作的沉降设备。转鼓内有可旋转的螺旋输送器，其转数比转鼓的转数稍低。有立式和卧式两种，卧螺机是一种全速旋转，连续进料、分离和卸料的离心机，最大离心力可达6000，操作温度可达300用于分离含固量较多的悬浮液，生产能力较大。,108,螺旋式离心机工

43、作原理,转鼓与螺旋以一定差速同向高速旋转，悬浮液通过螺旋输送器的空心轴进入机内中部，由进料管连续引入螺旋内筒，加速后进入转鼓。在离心力场作用下，固相物沉积在转鼓壁上形成沉渣层。输料螺旋将沉积的固相物连续不断定推至转鼓锥端，经排渣口排出机外，较轻的液相物则形成内层液环，由转鼓大端溢流口连续溢出转鼓，经排液口排出机外。,109,6）多室式multichamber centrifuge,转鼓内有若干同心圆筒组成的环状分离室，加长了被分离液体的流程，使液层减薄，增加了沉降面积，减少了沉降距离。同时还有粒度筛分的作用，悬浮液中的粗颗粒沉降到靠近内部的分离室壁上，细颗粒则沉降到靠近外部的室壁上，澄清的分离

44、液经溢流排出。常用于抗菌素液液萃取分离，果汁和酒类饮料的澄清等。,110,1、差速离心 2、密度梯度离心 3、等密梯度离心,三、超离心法,111,1、差速离心 差速离心是指采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法。,112,2、密度梯度离心（1）定义：样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方法。（2）梯度介质：为了使沉降系数比较接近的颗粒得以分离，必须配制好适宜的密度梯度系统。密度梯度系统是在溶剂中加入一定的溶质制成的。这种溶质称为梯度介质。常用的梯度介质有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系统，其适用范围是：蔗糖浓度560%，密度

45、范围1.021.30 g/cm3。,113,（3）不同密度梯度条件下物质的分离,离心后不同大小、不同形状、具有一定沉降系数差异的颗粒，在密度梯度溶液中形成若干条界面清楚的不连续区带。,114,（4）密度梯度的形成 两种不同浓度的溶液（蔗糖溶液）以不同比例混合形成。,115,3、等密度梯度离心 当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围内时，在离心力的作用下，不同密度的颗粒或向下沉降，或向上飘浮，只要时间足够长，就可以一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置（等密度点），形成区带。这种方法称为等密度梯度离心，或称为平衡等密度离心。,116,等密梯度离心常用的离心介质是铯盐，如氯化铯（Cs

46、Cl）、硫酸铯（Cs2SO4）、溴化铯（CsBr）等。有时也可以采用三碘苯的衍生物作为离心介质。,117,118,四、离心条件的确定,1、离心力（离心速度）2、离心时间3、温度与pH,119,1、离心力（离心速度）一般可以用离心速度，即转子每分钟的转数表示。如5000r/min等。在高速离心，特别是超速离心时，往往以相对离心力（RCF）表示。如60000g等。（此表示方法已不经常使用）相对离心力是指颗粒所受到的离心力与地心引力之比值。,120,Fc RCF=mr2/mg Fg=4 2n2 r/3600980=1.11810-5n2r(2 n/60)式中:RCF:相对离心力(g)Fc：离心力 F

47、g：地心引力 n:转子每分钟转数(r/min)r:旋转半径(cm),121,离心力与转速换算,转速/rpm,相对离心力/g,离心半径/cm,122,2、离心时间对于常速离心、高速离心和差速离心来说，离心时间是指颗粒从离心管中样品液的液面完全沉降到离心管底的时间，称为沉降时间 或澄清时间；对于密度梯度离心而言，离心时间是指形成界限分明的区带的时间，称为区带形成时间；等密梯度离心所需的离心时间是指颗粒完全达到等密度点的平衡时间，称为平衡时间。,123,最常用到的是沉降时间。沉降时间决定于颗粒的沉降速度和沉降距离。对于已经知道沉降系数的颗粒，其沉降时间可以用下列公式计算：,124,沉降时间的计算公式

48、：式中，t：沉降时间（s）S：颗粒的沉降系数（s）：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。：转子角速度（rad/s）r1，r2：分别为旋转轴中心到样品液液面和离心管底的距离（cm）,125,上式中括号中部分可以用转子的效率因子K表示。K与转子的半径和转速有关。生产厂家已经在转子出厂时表示出了最大转速式的K值。对于某一具体的颗粒来说，沉降系数S为定值，所以K值越小，其沉降时间就越短，转子的使用效率就越高。,126,3、温度与pH对于生物活性物质，离心温度一般控制在4左右，对于某些耐热性较好的物质，也可以在室温条件下进行离心分离。离心介质的pH值必须是处于被分离物质稳定的pH值范围内，必要时可以采用

49、缓冲溶液。,127,2.3全发酵液提取,一种新型的生物分离技术概念被提出：集成化分离技术，即对已有的两种或两种以上的单元操作进行有效的组合，组成一种有效的单元操作，以达到提高产品收率、缩短纯化步骤、降低纯化费用和投资成本的目的。1.用膜技术进行全发酵液提取2.用双水相萃取进行全发酵液提取3.用扩张床吸附进行全发酵液提取,128,扩张床亦称膨胀床是发展中的吸附分离技术。九十年代初，英国剑桥大学的等通过对吸附剂的改进及对层析柱和流体分布器的精心设计，得到了稳定、返混小的扩张床。,扩张床吸附技术Expanded bed adsorption,吸附介质颗粒在向上流动的上清作用下扩张起来，上清中的目标蛋

50、白被吸附于介质上，而细胞及碎片通过柱子而流出，而洗脱目标蛋白时从反方向将吸附介质压紧，再用洗脱液将目标蛋白洗下来。操作分为五个部分:(1)平衡、(2)吸附、(3)冲洗、(4)洗脱和(5)再生。,130,扩张床吸附技术,扩张床吸附集澄清、浓缩和初步纯化于一体的分离纯化技术。可以减少离心或过滤等单元操作步骤，节约操作周期。提高目标产物的收率，降低了分离纯化的成本，被称为近几十年来出现的第一个新的单元操作。随着商业化吸附剂和装置的出现，愈来愈多地引起人们的兴趣和关注。,131,132,思考题,发酵液为何需要预处理？处理方法有哪些？2 何谓过滤操作？如何强化过滤速度？3 凝集与絮凝过程有何区别？如何将