固定化酶及反应动力学.ppt
《固定化酶及反应动力学.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《固定化酶及反应动力学.ppt(226页珍藏版)》请在三一办公上搜索。
1、北京理工大学 生命学院,孙立权,第三章 固定化酶催化反应过程动力学,概述固定化后酶性质变化及动力学影响因素外扩散限制效应内扩散限制效应扩散影响下的表观动力学参数,内 容,酶应用过程中的一些不足,酶的稳定性较差:除了某些耐高温的酶,如-淀粉酶、Taq酶等;和胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外,大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下,都容易变性失活。酶的一次性使用:酶一般都是在溶液中与底物反应,这样酶在反应系统中,与底物和产物混在一起,反应结束后,即使酶仍有很高的活力,也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式,不仅使生产成本提高,而且难于连续化生产。产物的分离纯化较困难:酶反应后
2、成为杂质与产物混在一起,无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。,固定化技术,什么是固定化酶?,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶(固定化酶),固定化技术,01 概 述,固定化:将酶通过物理或化学方法固定在载体上或限制在一定空间内。,固定化酶(immobilized enzyme)亦称固相酶或水不溶酶。是用物理的或化学的方法使酶装变为在一定的空间内其运动受到完全约束,或受到局部约束的一种不溶于水,但仍具有活性的酶。能以固相状态作用于底物进行催化反应。水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。,固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代、70年代已
3、在全世界普遍开展。1953年德国的 Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合,制成固定化酶。60年代后期,固定化技术迅速发展起来。1969年,日本的千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸,实现了酶应用史上的一大变革。,在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上,确定固定化酶的统一英文名称为Immobilized enzyme。随着固定化技术的发展,出现固定化菌体。1973年,日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶,由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。在固定化酶和固定化菌体的
4、基础上,70年代后期出现了固定化细胞技术。1976年,法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精,1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶,开始了用固定化细胞生产酶的先例。1982年,日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸,取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍,更有利于胞内物质的分泌,这为胞内酶生产技术路线的变革提供了新的方向。,与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅
5、速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。,为什么固定化?易从反应系统分离,简化产物纯化过程。稳定性增加,不易失活具有一定形状和机械强度,可以装填于反应器固定床反应器可连续生产,过程易控制。简化了提取工艺,增加产物收率,提高产品质量更适合多酶反应酶使用效率提高,产品成本降低存在问题(1)制备困难,活性降低(2)增加了载体成本费及固定化操作费用;(3)增大了颗粒扩散阻力,使反应速度下降。固定化细胞,01 概 述,固定化细胞,将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。特点:1
6、.无需进行酶的分离和纯化。2.细胞本身含有多酶体系,可催化一系列反应。3.酶的辅助因子可以再生,稳定性高。4.保持酶的原始状态,酶的回收率高。5.抗污染能力强。,01 概 述,工业规模的酶固定化方法应具备的条件:(1)载体价廉、固定化费用低;(2)能反复利用,即对非一次性固定化酶,其载体要求能再生;(3)固定化收率高、制备简便、而且结合力强;(4)载体的机械强度高;(5)物理及化学性质稳定,使用于食品加工时要安全无毒,01 概 述,固定化酶制备方法,01 概 述,吸附(载体结合)法:物理吸附(活性碳,硅胶等),离子结合(离子交换剂和离子交换树脂),共价结合。作用力增强,对酶影响加大。交联法:利
7、用多功能试剂使酶间交联(异氰酸酯,联苯胺,形成共价键)。包埋法:包埋于高分子凝胶网格(网格型),高分子半透膜(微囊型)(医学应用多),酶的固定化技术和固定化酶,01 概 述,活性中心:保护酶的催化作用,并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害,在制备固定化酶时,需要在非常严密的条件下进行。功能基团:如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等,当这些功能基团位于酶的活性中心时,要求不参与酶的固定化结合酶的高级结构:要避免用高温、强酸、强碱等处理,而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活,因此,操作应尽量在非常温和的条件下进行。,固定化酶
8、操作的注意事项,1 吸附法,吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。物理吸附法:通过氢键、疏水作用和电子亲和力等物理作用,将酶固定于水不溶载体上从而制成固定化酶。常用的载体有:有机载体。纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。比如用纤维素作为吸附剂,用膨润的玻璃纸或胶棉膜吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶。吸附后在载体表面形成单分子层,吸附蛋白能力约70mg/cm2。,无机载休。氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。比如用多孔硅为载体吸附米曲酶和枯草杆菌的alpha-淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶,在45进行固定化,用高浓度的底物进行连续反应。半衰期分别为14、35、60d。
9、无机载体的吸附容量较低、而且酶容易脱落。,固定化酶制备方法,01 概 述,吸附(载体结合)法:物理吸附(活性碳,硅胶等),离子结合(离子交换剂和离子交换树脂),共价结合。作用力增强,对酶影响加大。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。,(2)离子交换吸附法:这是将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。酶吸附较牢,在工业上颇具广泛的用途。常用的载体有阴离子交换剂,如二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类(ECTEDLA)-纤维素、四乙氨基乙基(TE
10、AE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93、410、900等。阳离子交换剂,如羧甲基(CM)纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC50、IR200、Dowex50等。,DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶:将DEAE-SephadexA25充分溶胀用0.5mol/LNa0H和水洗涤后,加入pH7.07.5的米曲霉-粗酶液(水解乙酰DL-Ala活力为25umol/m1h)充分混合(1g湿重载体加60ml酶液)后,于低温下搅拌过夜后,吸去上清液,再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶,置4备用。固定化酶活力回收50-60,水解
11、乙酰DLA1a活力为600-800umol/gh湿固定化酶。氨基酰化酶也可固定于DEAE纤维素。此外,DEAE纤维素吸附的淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。,通过酶蛋白化学修饰来增加蛋白质分子上电荷。能有效的克服吸附法制备的固定化酶在使用过程的解吸。用水溶性乙烯顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、可以用DEAE纤维素和DEAEScphadex载体有效的固定。这种固定几乎是不可逆的吸附。此外酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温度、蛋白质浓度及酶和载体的特性相关。pH的变化影响到载体和酶的电荷,从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧(1-2pH单位)吸附将明显减少,但也有个别例
12、外。盐对吸附的影响较为复杂在一些特殊事例中、盐可以促进蛋白质的吸附。这就是所谓的盐析吸附。对蛋白质吸附来说,随温度的升高吸附下降。载体的表面积、多孔性及其顶处理都影响对酶的吸附。,吸附法制备固定化酶操作简单,可充分选择不同电荷、不同形状的载体,吸附过程可以同时纯化酶,固定化酶在使用过程失活后可重新活化,同时,载体可以回收再利用。但由于有些机理不十分明了,在给酶量、吸附程度与固定化酶活力回收的关系不可预见性大,同时由于吸附法制备的固定化酶易脱落,影响产物纯度和酶的操作为稳定性。,共价结合法是将酶蛋白分子上官能团和载体上的反应基团通过化学价键形成不可逆的连接的方法。在温和的条件下能偶联的酶蛋白基团
13、包括有氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等。常用的载体包括天然高分子(纤维素、琼脂糖、葡萄糖凝胶、胶原及其衍生物),合成高分子(聚酰胺、聚丙烯酰胺、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等)和无机支持物(多孔玻璃、金属氧化物等)。共价结合法制备的固定化酶,酶和载体的连接键结合牢固,使用寿命长,但制备过程中酶直接参与化学反应,常常引起酶蛋白质的结构发生变化,导致酶活力的下降,往往需要严格控制操作条件才能获得活力较高的固定化酶。,(1)酶分子和载体连接的功能基团 从理论上讲,酶蛋白上可供载体结合的功能基团有以下几种:酶蛋白N端的M氨基或赖氨酸残基的-氨基。酶蛋白C-端
14、的羧基以及Asp残基的-羧基和Glu残基-羧基。Cys残基的巯基。Ser、Tyr、Thr残基的羟基。Phe和Tyr残基的苯环。His残基的咪唑基。Trp残基的吲哚基。在实际中偶联最普遍的基团是:氨基、羧基以及苯环。被偶联的基团还应是酶活性的非必需基团,否则将导致酶失去活性。,(2)载体的选择 载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体的一般要求是:一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定 性上都优于疏水载体。载体结构疏松,表面积大,有一定的机械强度。载体必须有在温和条件与酶共价结合的功能基团。载休没有或很少有非专一性吸附。载体来源容易便便并能反复使用。,(3)偶联反应 酶和载体的连接反
15、应取决于载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团,而且是在十分温和的pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进行。现已有许多种偶联反应都能制备固定化酶。这些方法在实际运用中经济意义起着决定性作用,必须考虑到酶的偶联效率固定化酶总活力,操作的简便性以及载体与试剂的成本等因素。现介绍如下:,重氮法 是将带芳香族氨基的载体,先用NaNO2和稀盐酸酸处理成重氮盐衍生物,再在中性偏碱(pH89)条件下与酶蛋白发生偶联反应,得到固定化酶。,可能与酶蛋白中Tyr的酚基,His的咪唑基生成重氮衍生物,在过量重氮盐存在下还可与酶蛋白的N端氨基或Lys的氨基形成双偶氮化合物。常用载体及其反应如下:,a.多糖类的芳香
16、族氨基衍生物。我国独创的使用对-硫酸脂乙砜基胺(ABSE)多糖(纤维素,葡聚糖,文联琼脂糖,交联琼脂及淀粉)属于此类载体。在碱性条件下用对硫酸脂乙砜基胺话化多糖,制得的醚键连接的乙砜基苯胺衍生物,经重氮化后偶联酶:,b.氮基酸共聚体。如LLeu和对氨基DL苯丙氨酸共聚物:待1mol/L的LLeu和对氨基DLPhe的N羧基酐的苯溶液在少量水存在及室温下进行反应制成。共聚物与亚硝酸作用转变为重氮盐,可供酶固定用。用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。,c.聚丙烯酰胺衍生物。该类衍生物的商品名称为bioGel或Enzacry。如EnzacryIAA是含有芳香氨基的聚丙烯酰胺衍生物,经重氮
17、化可固定酶。用此法制备的有氨基酰化酶,淀粉酶等固定化酶。,d.苯乙酰树脂。这是聚氨基苯乙烯(a)和一种异丁烯一间一氨基苯乙烯(b)的共聚物,通过重氮化后可固定酶如胃蛋白酶、核糖核酸酶等。,e.多孔玻璃的氨基硅烷衍生物。玻璃的化学改造物多孔玻璃在丙酮中与Y氨基丙基三氧乙烷硅回流加热,生成烷基胺玻璃:,烷基氨玻璃用对硝基苯酚氯处理后,再还原,转变为芳香基衍生物:,此芳香基衍生物经重氮化后与酶结合产生固定化酶。,芳香烃化反应 具有卤素取代的芳香环或含有卤素取代的杂环的高聚物以及含有卤乙酰基的高聚物,可以通过烷基化、芳香基化,在碱性条件下,与酶分子上的氨基、酚基、巯基等反应,如:a.将纤维素在二恶烷(
18、Diaxanc)-溴乙酸中与嗅乙酰溴反应,形成溴乙酰纤维素,可供胰蛋白酶、糜蛋白酶和核糖核酸酶之固定化:,常用载休有卤乙酰、卤异丁烯衍生物,如氯乙酰纤维素、溴乙酰纤维索、碘乙酰纤维素等。,b.纤维素等载体在碱性条件下和均三氯三嗪等反应,引入活泼的卤素基后,能与酶的氨基、酚羟基、巯基反应,产生固定化酶。,与纤维素共价结合的另一类芳香烃化功能基是3-F-4,6-二硝基苯。控制pH7,使它勺酶分子的氨基反应,产生固定化酶。,c.四元缩合反应 利用四元化合物(羧酸、胺、醛和异氰酸)发生缩合反应,形成N取代的酰胺。在反应中,羧酸(R1)和胺化合物(R2)形成酰胺键,醛(R3)和异氰酸(R4)结合形成酰胺
19、氮的侧链:,当选择适当条件,适当的载体及控制反应液中的添加物,可以使连接键或通过酶的氨基或通过羧基,将酶固定并免除有害反应。例如:在乙醛和小分子的3(二甲氨基)丙基异氰酸存在下,用0.5mol/L HCl维持pH6.5,搅拌反应6h,用带氨基的聚合物,可以与酶分子的羧基偶联。而带COOH的高聚物在醛和异氰酸存在下,可与酶分子的NH2偶联。,d.巯基二硫基交换反应 带有SH或二硫基的载体,通过巯基二硫基的交换反应,和酶分子上非必需巯基偶联。若载体的功能基团为SH时,可先用2,2二吡啶二硫化物处理,生成的二硫基中间产物在酸性条件下能与酶分子的巯基发生交换反应,从而产生固定化酶。,此法通过小分子巯基
20、化合物的运转,使载体可以再生:,e.金属偶联法 利用某些过渡金属盐溶液将载体(纤维素、尼龙、硼硅玻璃、滤纸及酵母细胞等)浸泡24h,洗除末反应的金属盐后,制得的活化载体放入酶溶液中,即可将酶固定化。如:,f.缩合反应 一些带羧基或氨基的载体用羰二亚胺活化后,与酶分子的氨基或羧基直接偶联,形成肽键,产生固定化酶。般在弱酸条件下(pH4.755)将酶、羰二亚胺、载体同时混合,羰二亚胺与载体的羧基反应生成活泼的O乙酰异脲衍生物,与酶分子的氨基缩合成肽键或者重排为酰基脲。,例如以丙烯酰胺和丙烯酸共聚物为载体用缩合法制备固定化胰蛋白酶。0.95g丙烯酸用3mol/L NaOH调pH6.5,加入1.95g
21、丙烯酰胺和0.1g N,N甲叉双丙烯酰胺,再加入0.1mol/L pH6.5磷酸缓冲液,使体积为10m1,加入25mg过硫酸铵和22ulN,N,N,N,N四甲基乙二胺,抽真空除气泡,4聚合30min,压挤成粒,搅拌下水洗丙酮干燥备用。70g干胶在20m10.5mol/L HCl中搅拌30min,用水和 O.1mol/L pH 6.5磷酸缓冲液洗涤后转至小烧杯,加入3.5ml 0.1mol/L pH65磷酸缓冲液的8.75mg胶原蛋白酶后,搅拌5min,接着加1环己基3(2吗啉乙基)羰二亚胺甲基对甲苯磺酸,连续搅拌18h,洗涤后即为固定化酶。,g.叠氮反应 带有羧基或羟基、羧甲基等的载体,首先在
22、酸性条件下用甲醇处理使之酯化,再用水合肼处理形成酰肼,最后在HNO3作用下转变成叠氮衍生物。此衍生物在低温下可与酶蛋白的羟基、酚基或巯基等反应,但产物可用中性羟胺水解掉,使之仅与一NH2反应。,此法常用载体有羧甲基纤维素、CMSephadex、聚天冬氨酸、BioGel.CM100、乙烯顺丁烯二酸酐共聚物、Amberlite IRC50等。叠氮法用途较广,举例如下:,以CM一纤维素(CMC)叠氮衍生物为载体固定化胰蛋白酶。首先,载体的酯化与肼解:CMC依次用水、乙醇和乙醚洗涤,干燥后,悬于无水甲醇,在冰浴冷却下通入HCl气体,使之饱和。室温下过夜,并重复此过程(甲酯化)。然后用甲醇、乙醚充分洗涤
23、,并空气干燥。将产物悬于甲醇中,加入80水合肼,回流1h。放置过夜,过滤,再用甲醇洗涤,干燥。其次为偶联:1g CMC酰肼和150m1 2HCl在冰浴中混合,搅拌下滴加9ml%3 NaNa2,冰水浴中搅拌20min。离心弃去上清液。沉淀用150m1二氧氯环洗涤再用150m1冷的蒸馏水洗涤二次,并且悬于预冷的10ml 0.05mol/L pH87磷酸缓冲液的胰蛋白酶溶液中,5搅拌反应23h,用HCl凋PH4,冷0.001mol/L HCl洗三次,冷水洗一次,冻干,即为固定化酶。,j.异硫氰酸反应 含有芳香氨基的载体,在碱性pH条件下,与光气或硫芥子气反应生成异硫氰酸或异琉氰酸衍生物,可在温和条件
24、下与酶分子的氨基连接,产生固定化酶。,用含有酰基叠氮的载体在加热下与HClI反应,亦得到异硫氰酸衍生物亦可用于固定化酶。,k.溴化氰亚胺碳酸基反应 含有羟基的载体(如纤维素、葡聚糖、琼脂等)在碱性条件下,载体的羟基与CNBr反应,生成活泼的亚胺碳酸基,在弱碱条件下,可与酶分子的氨基偶联,产生固定化酶。,例如:用CNBr活化的琼脂糖固定化胰蛋白酶。将Sepharose 4B用蒸馏水洗净,含0.1g干物质的湿胶加5ml水和4ml现配溴化氰水溶液(25mg/m1),搅拌下用2mol/LNaOH调pHll.0,2325反应6min,抽干立即用300ml 0.1mol/L NaHCO3洗净,(58min
25、内完成)。活化的载体用0.025mol/L pH10.2(含0.02mol/L CaCl2)硼酸缓冲液液快速淋洗后,用5m1缓冲液转入烧杯内加16mg结晶胰蛋白酶,搅拌4h,用0.1mol/L pH8.5硼酸缓冲液(内含1mol/L NaCl)洗涤后,复用pH4.1的醋酸缓冲液洗涤,便制成了固定化胰蛋白酶。,酰氯化反应 含羧基载体如羧基树脂(Amberlite IRC50等),可用氯化亚砜处理,生成酰氯衍生物,与酶分子的氨基偶联,产生固定化酶。,m酸酐反应 乙烯或苯乙烯、甲代乙烯基与顺丁烯二酸酐的共聚物,在己二胺作用下,酸酐与酶蛋白的氨基起偶联反应,产生固定化酶。,n活化酯法 含羧基的共聚物载
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 固定 反应 动力学
链接地址:https://www.31ppt.com/p-5097367.html