细菌和噬菌体的遗传分析.ppt

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1、第五章 细菌和噬菌体的遗传分析,第一节 细菌和病毒遗传研究的意义,一、细菌：,1.大小：细胞较小、长约12(11/1000mm)、宽约0.5；2.结构：鞭毛、细胞壁、质膜、间体、核质体、核糖体；3.遗传物质：单个主染色体、一个或多个小染色体(质粒)；4.涂布和繁殖：每个细胞在较短时间内(如一夜)能裂殖到107个子细胞，成为肉眼可见的菌落或克隆(clone)。,5.生理特性突变：.营养缺陷型：.抗性突变型：,二、病毒：,单倍体，仅一条染色体。病毒构成：蛋白质外壳+核酸。病毒分类：寄主：动物、植物、细菌等；遗传物质：DNA 或 RNA。,三、细菌和病毒在遗传研究中的优越性：,1世代周期短：2 容易

2、找出营养缺陷型 3便于研究基因突变：裸露的DNA分子(有的病毒为RNA分子)，易受环境条件的影响而发生突变；单倍体生物，不存在显性掩盖隐性问题，突变均能表现出来。,4便于研究基因的作用5.高等动植物具有复杂的体制，比较难以着手研究一些复杂的遗传学问题，例如代谢作用的调控问题等，细菌的体制简单，便于着手，当然在细菌中得到的结论不一定能应用到高等生物中，但是可以得到启发，推动高等生物中这些问题的研究。,第二节 细菌的遗传学分析,一、接合（conjugation）：细菌的杂交试验 A菌株：met-bio-thr+leu+，需加甲硫氨酸和生物素。B菌株：Met+bio+thr-leu-，需加苏氨酸和亮

3、氨酸。,A菌株和B菌株营养缺陷型，不能在基本培养上生长。,A+B菌株混合培养，在完全培养基上，几小时后离心，涂布基本培养基上，长出原养型(Met+bio+thr+leu+)菌落。,是由于转化，还是遗传物质交换和重组?,接合：,概念：是指原核生物的遗传物质从供体(donor)转移到受体(receptor)内的过程。特点：需通过细胞的直接接触。,二、大肠杆菌F+、F-、和Hfr品系的比较分析,（一）F因子的发现Hayes实验：大肠杆菌12中有两个这样的菌株：A菌株：met-bio-thr+leu+thi+B菌株：met+bio+thr-leu-thi-,str处理A+未处理B存活(有重组,基本培养

4、基）str处理B+未处理A无存活,原因解释：菌株A相当于雄性，是遗传物质的供体（donor)，而菌株B相当于雌性，是遗传物质的受体。所以在含有链霉素的培养基中，Astrs菌株 Bstrr菌株这一杂交组合可以得到原养型，原因是供体虽然对链霉素敏感，细胞不能分裂，但并不影响供体的基因转移；受体对链霉素有抗性，所以不影响细胞分裂，也不影响接受外源遗传物质发生重组，从而出现原养型菌落。而反交（A strr菌株 B strs菌株）就不能得到原养型，因为受体对链霉素敏感，虽然供体转移遗传物质，但受体细胞不能分裂，所以不能重组成原养型菌落。,结果:,大肠杆菌中遗传物质的交换不是交互的。事实上，菌株B作为遗传

5、物质的受体，菌株A作为供体。Hayes的解释：大肠杆菌的某些品系的雄性或供体是被一个致育因子或F因子决定的。具有这种因子的能育品系记为F+，相当于雄性。不含这种致育因子F的品系记为F-，相当于雌性。,F因子：是位于大肠杆菌染色体以外的小环状DNA。F+细菌的表面有称作性伞毛与F-细菌接合，伞毛发生改变，成为两细胞间的原生质通道，形成细胞质桥或称结合管，F+细胞的F因子通过接合管向F-细胞转递，使F-变成F+。,（二）F因子的结构,F因子是质粒的一种。质粒：是指染色体外的遗传物质。可以自主复制，并在细胞分裂时分配到子细胞中。特性：(1)自主复制(2)感染 感染性质粒。,质粒中，有的除了可在染色体

6、外自率地增殖外，还可整合到染色体上，成为染色体的一部分，这样的质粒特称为附加体（episome）。,F质粒的结构：,(1)原点，转移的起点(2)致育基因：形成性伞毛的基因群，接合管(3)DNA复制酶基因(4)配对区域（插入序列）insertion sequence,（三）F+、F-和Hfr品系F+F-的特点：,(1)F质粒转移的频率高，1/10。(2)而染色体转移频率低。10-7，使F-F+F+品系又称为低频重组品系,高频重组品系Hfr（high frequency recombination）,Cavalli（1951）和Hayes（1954）先后从能育的F+品系中分离出两个新的品系，它们和

7、F-杂交，出现重组频率很高。比F+F-高出1000倍。这种品系称为高频重组品系Hfr。,Hfr 的特点：(1)高频重组，染色体转移频率高，1000(2)F质粒转移频率低 F-变成F+很少或没有。,大肠杆菌F因子的三种状态,F因子及其在杂交中的行为,三、细菌重组的特点,（一）细菌的交换 原核生物的遗传交换是在一完整的基因组（称为F内基因子）与一个不完整的基因组（称为供体外基因子）之间进行，所以是在部分二倍体或部分合子间进行,在细菌的重组中，有两个特点,（1）只有偶数交换才能产生平衡的重组子（2）相反的重组子不出现，所以在选择培养中只出现一种重组子,四、中断杂交实验与重组作图（一）中断杂交试验,基

8、因从Hfr细胞按次序转入F-细胞，可根据基因进入F-细胞的时间和次序作成基因图谱。,50年代，雅科（Jacob F.）和沃尔曼（Wollman E.）：中断杂交试验：发现接合时遗传物质转移是直线进行。,中断杂交试验,Hfr菌株的基因型：strs azirtonrgal+lac+leu+thr+F-菌株的基因型：strrazistonsgal-lac-leu-thr-,基因 转入时间（min）频率 thr+8 100 leu+8.5 100 azs 9 90 Tis 11 70 lac+18 40 gal+25 25,结果:,不同的基因进入受体细胞时间是不同的。位于前端的基因，首先进入，可以想象

9、，基因间的距离越长，转移的时间间隔越长，因此，可以用基因转移的时间长短、顺序来表示基因在染色体上的图距,即时间作图法。F+因子最后转移。,根据中断杂交的实验，以Hfr基因在F细胞中出现的时间为标准，可以作出大肠杆菌的连锁遗传图。,总结：,研究细菌接合过程中基因转移方式的实验方法称为中断杂交实验（interrupted mating experiment）。基本步骤：接合：中断接合：杀死Hfr：检查F-菌株所含供体基因：,不同的Hfr菌株：,后来的研究还发现，从一个F+菌株可以筛选出不同的Hfr菌株，拿不同的Hfr菌株同F-菌株进行中断杂交实验，发现它们进入F-菌株的基因顺序各不相同。,对于上述

10、现象，只有接受下面的假说，才能得到圆满的解释：,（1）大肠杆菌的染色体是闭合环状的。（2）F因子可以插入染色体的不同位置。（3）杂交时，环状染色体断裂成线状，并以F因子附着的相反一端为原点，向F转移。,Hfr1和HfrAB312菌系的中断杂交试验及其连锁图（如下图）：,差异：不同Hfr菌株转移的原点(O)和转移方向不同。进一步说明了F因子和细菌染色体都是环状。,原始 Hfr菌株,（三）细菌的重组作图,在中断杂交中，根据基因转移的先后次序，以时间为单位求出各基因间的距离，叫做时间作图法如果2个基因间的转移时间2min则用中断杂交作图不可靠，应采用传统的重组作图法。,杂交 Hfr lac+ade+

11、F-lac-ade-用链霉素基本培养基，可选出F-ade+的菌落 由于lac+ade-近，两者相继进入时间相距很短，难以准确界定，所以只能根据产物确定。如果选出ade+同时也选出lac+，说明lac-ade 间没有发生过交换；如果是lac-ade+说明发生交换。,重组作图,Hfr lac+ade+F-lac-ade-不交换lac+ade+。Hfr lac+ade+F-lac-ade-两基因之外双交换lac-ade-。Hfr lac+ade+F-lac-ade-两基因间发生交换lac-ade+,另一种筛选方式：,将重组子影印在EMB（曙红+美蓝）培养基上，如果是紫红色，说明重组子含有lac+ad

12、e+。如果是粉红色，说明重组子含有lac-ade+。,结论：,用时间单位法lac-ade的图距是一分钟，所以时间单位和重组值的关系大致是1分钟=20%的重组值。,E.Coli的染色体,全长约100min，含4106核苷酸对，所以总图距相当于2000cM，故1cM=2000bp。这种接合重组作图在短距离内是有效的。如相距2min以上的就有可能表现不连锁。同时这种接合重组不产生交互的重组类型，所以得出的图距和减数分裂生物中所确定的图距不同。,第三节 F因子与性导,一、F因子,在1959年，Adelberg在E.coli中发现一种新的F因子。HfrF+因子的时候，F因子偶尔可能获得细菌染色体的一部分

13、,它携带有大肠杆菌染色体的一些基因，这种F因子称为F因子,当F因子再整合到细菌染色体时，它就只能在原来的地点配对、交换而插入其中，而不能象F因子那样可以在任何位点整合。F菌株：指带有F因子的细菌。,F因子：,F因子携带染色体的节段大小：从一个标准基因到半个细菌染色体,F因子特点：,（1）F与dgal或dbio颗粒不同，F携带细菌的基因，但不减少自身的基因，如果自身的基因丢失，转移就可能停止。（见下节）（2）F不存在蛋白质外壳包装的问题，所以它的长度不为包装所限制，可以携带不同长度的细菌DNA片段。FF-F,二、性导,性导是指接合时由F因子所携带的外源DNA整合到细菌染色体的过程。,F因子转入受

14、体细胞后，由于引入体细胞的部分基因，从而形成部分二倍体，这种利用F因子将供体细胞的基因导入受体形成部分二倍体的过程叫性导（sexduction或F-duction）,性导的结果：,这种部分二倍体如果不发生重组：F因子自主复制。如果发生重组：单交换：形成Hfr。双交换:形成F品系。,第四节 细菌的转化作图,转化:从细菌的培养物提取的可以在体外转移到受体细菌中，这一过程称为转化（transformation）。,能接受外源DNA分子并被转化的细菌细胞称为感受态细胞（competence cell），即细胞处于能摄取核酸分子时的生理状态。而促进转化作用的酶或蛋白质分子称为感受态因子（competen

15、ce factor）。,转化频率低的原因可能有：,1.受体细菌细胞壁并非任何区域都允许外源DNA片段通过，而只是在特定区域形成临时性通道，因此将这一区域称为受体部位（receptor site）,而在受体细胞表面这一部位的数目是有限的。2.外源DNA进入除受体部位允许通过外，还必须有酶或蛋白质分子以及能量等的协同作用。显然外源DNA只有在酶促旺盛的受体部位进入。,转化的过程,转化的应用：,通过转化可以测定基因的连锁、基因的排列顺序以及图距。通过转化片段平均大小相关的共转化频率测定，就可以获得这些基因的连锁图谱。Nester等用枯草杆菌的一个菌株trp2+his2+tyr1+作为供体，提取其DN

16、A向受体trp2-his2-tyr1-菌株进行转化，结果如下：,第五节 噬菌体的遗传学分析,一、噬菌体的结构和生活周期噬菌体基本上由一个蛋白质外壳和其中包含的核酸所组成。,(一)、烈性噬菌体（virulent phages）,概念：使宿主菌发生裂解的噬菌体。繁殖：吸附在特异的受体上酶细胞壁形成微孔注入核酸停止细菌的代谢合成phage的成分裂解，释放。如下图：大肠杆菌的T偶数系列噬菌体,（二）温和性噬菌体（temperate phage）,具有裂解和溶源两种途径：(1)裂解途径：和烈性噬菌体相同，如右图。,(2)溶源途径：,溶源周期经诱导进入裂解周期,(3)溶源性：,原噬菌体(prophage)

17、：整合进细菌基因组中的噬菌体称为原噬菌体。在细菌染色体的特异位点整合进整个噬菌体基因组。溶源菌(lysogenic bacterium)：含有原噬菌体的细菌具有产生和释放噬菌体的潜力，这种细菌称为溶源菌。失去原噬菌体的细菌称为非溶源性细菌（nonlysogenic bacterium）。,溶源性细菌有两个重要特性:(1)免疫性：原噬菌体产生一种阴遏蛋白，抑制同类噬菌体DNA的复制，因而能抵抗同类噬菌体的超感染。(2)可诱导性：自发万分之一；紫外线或丝裂霉素90%。,带有原噬菌体的细菌称溶源性细菌（lysogenic bacterium）,二、裂性噬菌体的基因重组和遗传作图,T2噬菌体有两种不同

18、基因型和表现型噬菌斑的形状1)小噬菌斑r+2)大噬菌斑r(快速溶菌)寄主范围1）能感染E.coliB，不能 感染B/2，噬菌斑混浊。h+2)能感染E.coliB和B/2，噬菌斑透明。用h表示。,rh+r+h杂交,用不同快速溶菌突变型rh+与宿主范围突变型r+h杂交。实验方法：将过量的上述两种噬菌体混合在一起感染B，把释放的子代噬菌体接种在同时长有B和B/2的平板上，可看到四种噬菌斑。,杂交结果噬菌斑的表现型 基因型 清亮、小 hr+混浊、大 h+r 混浊、小 h+r+混浊、大 hr,Lizy-Genetics,58,Plaque morphology,实例,不同的快速溶菌突变型，在表型上也不相

19、同。记作ra，rb，rc。确定4个基因ra，rb，rc，h的连锁图。用不同快速溶菌突变型r-h+与宿主范围突变型r+h杂交，结果见表。,根据每一杂交作一连锁图:,4个基因的连锁关系有4种可能:,进行rcrb+rc+rb,把得到的重组值与rbh比较,知rcrbrbh，所以是 rchrb 原来T2噬菌体的连锁图也是环状的。,自学：,噬菌体的基因重组与作图P194T4突变的三点测交与作图P195,三、转导,转导是指通过噬菌体把细菌的基因从一个细菌转移到另一个细菌的过程。原噬菌体从寄主染色体脱落时可带有寄主染色体上的基因。当它侵染另一菌体时，便将这些基因转移给受体菌而实现转导。,特点：以噬菌体为媒介

20、细菌的一段染色体被错误地包装在噬菌体的蛋白质外壳内 通过感染转移到另一个受体细胞内。,转导现象的发现,黎德伯格与津德（1951）在鼠伤寒沙门氏菌研究LT22phe-trp-tyr-met+his+LT2phe+trp+tyr+met-his-混合培养在基本培养基发现原养型的菌落 频率为1/105,原因:.是否属于恢复突变?.是否属于接合、性导?.是否属于转化?唯一可能的结论是：这种重组通过一种过滤性因子实现。为噬菌体P22（溶源性）,转导过程：,（一）普遍性转导,噬菌体P22可以转导沙门氏菌染色体组的任何不同的部分，因此称为普遍性转导。.作用：可转导细菌染色体组的任何部分。,普遍性转导,2测定

21、细菌基因间的连锁关系：,任一基因的转导频率：两个基因同时转导的现象称为共转导或称并发转导。两基因共转导频率愈高，表明两个基因连锁愈紧密。,双因子转导实验：三因子转导实验：,三因子转导分析：,只做一次实验就可推出3个基因的次序。双因子转导分析：每次观察2个基因的转导，通过每两个基因之间的共转导频率就可以确定3个基因在染色体的顺序。,例：用E.coliP1噬菌体，,供体thr+leu+azi+受体thr-leu-azi-,用P1进行的E.coli的转导实验,3个位点之间的连锁关系：,实验1：2种可能排列：azileuthr leuazi thr实验2：肯定3个基因的顺序是：azileuthr,实验

22、3：证明这一顺序，因为leu+和thr+片段之间从未携带有azi。,完全转导（complete transduction）和流产转导(abortive transduction),（二）局限性转导,有的噬菌体只能转导少数的几个基因,叫做局限性转导。例如E.coli的入噬菌体，只能转导gal和bio合成等几个基因。,这是因为入噬菌体插入寄主染色体的位置是固定的。总是在基因gal和bio之间，当它从染色体上脱落时，可能携带这一小段染色体。,E.Coli的基因定位,应用中断杂交技术、重组作图、转化和转导相结合 细菌非常详细的染色体连锁图谱。1963年，E.coli已定位近100个基因(下图)；1990年，定位基因已超过1400个；1997年完成全部测序：4639221对碱基，其功能基因已基本了解。,