《氨基酸发酵机制》PPT课件.ppt

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1、第五章 氨基酸发酵机制 全世界AA的年需求量以10%的速度增长，年总产量120万吨以上，而其需求量达800万吨，作为食品添加剂占40%，饲料添加剂占40%，医药保健品占20%。年产值已接近600亿美元。氨基酸主要用于食品、医药、农业、化妆品等方面。在食品工业上的应用：甘氨酸、丙氨酸具有甜味，天冬氨酸、谷氨酸具有酸味，谷氨酸钠、天冬氨酸钠具有鲜味，它们都可用作食品添加剂。赖氨酸、蛋氨酸等人体必需的氨基酸常作为食品添加剂，用以提高食品的营养价值。饲料工业作为饲料添加剂的氨基酸有蛋氨酸、赖氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸、丙氨酸和苏氨酸7种。,新型甜味剂-蛋白糖 http:/,在医药工业上的应用：氨基酸在医药

2、上的应用很广。例如，氨基酸的混合液可供病人注射用，氨基酸的混合粉剂可作宇航员、飞行员的补品。在化妆品生产中的应用：氨基酸及其衍生物与皮肤的成分相似，具有调节皮肤pH和保护皮肤的功能，现已广泛用于配制各种化妆品。例如，胱氨酸用于护发素中，丝氨酸用于面霜中。在农业上的应用：赖氨酸、蛋氨酸添加在饲料中，能加速家畜、家禽的生长，改善肉的质量。氨基酸也用于其他方面：例如，聚谷氨酸用于合成人造皮革和涂料。,第一节 氨基酸发酵的代谢调控,正常情况下微生物自身不能累积氨基酸，因此要打破微生物的正常代谢调节途径。经常采用的几种方法：1、控制旁路代谢：以D-苏氨酸为底物发酵 D-苏氨酸 L-苏氨酸 脱氢酶 脱氢酶

3、 a-酮基丁酸 反馈抑制 L-异亮氨酸,2、降低反馈作用物的浓度：谷氨酸 N-乙酰谷氨酸 N-乙酰-Y-谷氨酰磷酸 鸟氨酸反馈抑制 瓜氨酸 精氨酸 谷氨酸棒杆菌缺乏将鸟氨酸转化为瓜氨酸的酶，消除反馈抑制，可用于生产鸟氨酸。,3、控制细胞渗透性：谷氨酸发酵：当细胞内生物素水平高时，谷氨酸不能透过细胞膜，需加入表面活性剂或青霉素，提高细胞膜通透性。4、控制发酵的环境：氨基酸发酵是人为控制环境的结果，见表5-15、促进ATP的积累以利氨基酸的生物合成：氨基酸的合成需要能量，ATP的积累有利于氨基酸的生物合成。,第二节 谷氨酸发酵机制 谷氨酸，学名：-氨基戊二酸；其单钠盐：谷氨酸钠，商品名称味精，是重

4、要的调味品。目前我国味精的年产量已达100万吨，产销量占世界第一位。早期生产谷氨酸的方法有两种，一是提取法：甜菜厂付产物糖蜜中含有焦谷氨酸，用强碱处理可得到谷氨酸；二是蛋白质水解法：将面筋加酸水解，再分离提纯。1957年发酵法生产谷氨酸在日本协和发酵公司投产。,谷氨酸生产菌能够在体外积累菌体最大生长需要量300多倍的谷氨酸，研究发现：大量积累并非是当初设想的由于特异代谢途径导致，而是：代谢调节控制；细胞膜通透性的特异调节；发酵条件的适合；综合调控的结果。,一、谷氨酸的生物合成途径及调节机制,谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖经糖酵解（EMP途径）和己糖磷酸支路（HMP途径）生成丙酮酸，再氧化成

5、乙酰辅酶A（乙酰COA），然后进入三羧酸循环，生成酮戊二酸。酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷氨酸。即，谷氨酸的生物合成途径包括EMP、HMP、TCA循环、DCA循环和CO2固定作用等。,一）EMP途径、HMP途径 谷氨酸生产菌存在着两种代谢途径：EMP、HMP；EMP/HMP=90/10，生物素量增加，HMP途径增加（26%，38%）。二）TCA、DCA和CO2固定作用 1.TCA环（三羧酸循环）KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失 这是菌体生成并积累KGA的关键，从上图可以看出，KGA是菌体进行TCA循环的中间性产物，在KGA脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A，只有当

6、体内KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够停止，KGA才得以积累。在有NH4存在下，由谷氨酸脱氢酶催化还原氨基化生成谷氨酸。,2.DCA环（乙醛酸循环）菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶异柠檬酸裂解酶。该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA 循环的封闭是实现GA 发酵的首要条件。3.CO2固定 体系中如果不存在CO2固定反应，则有：,则 3/2 C6H12O6+NH4+=C5H9O4 N+4 CO2 产率：147/（180*3/2）=54.4%,体系中存在CO2固定反应，则有：,则有：C6H12O6+NH4+=

7、C5H9O4 N+CO2 产率：147/180=81.7%可见，在GA的生物合成过程中，CO2固定反应对于产率的提高有着多么重要的作用。在许多微生物发酵的过程中，通常需要检测反应器尾气的组成，特别是尾气中CO2的含量，其主要目的就在于分析产物合成期间菌体的代谢途径，有利于指导生产。,三）氨的导入 有三种方式：酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸。GA产生菌有强烈的L谷氨酸脱氢酶活性 KGA+NH4+NADPH=GA+NADP由天冬氨酸或丙氨酸通过氨基转移作用将氨基转给酮戊二酸而生成GA。但是谷氨酸产生菌中天冬氨酸转氨酶(GOT)和丙氨酸转氨酶(GPT)活力很低，转氨途径并不重要。谷氨酸合成酶途径。谷氨

8、酸合成酶对NH4的亲和力比谷氨酸脱氢酶强得多，当环境中NH4浓度很低时，可由谷氨酸合成酶途径合成谷氨酸。细胞内谷氨酸浓度很高时，反馈抑制谷氨酸脱氢酶活性，但不抑制谷氨酸合成酶。,二 细胞膜通透性控制 细胞膜通透性的调节对于GA 发酵时非常重要的，当菌体进入产物合成期时，开始有GA的产生，这是如果能够大量的把产物及时的排泄到细胞膜外，可以解除GA对L谷氨酸脱氢酶活性的抑制作用，从而实现由Glucose 到 GA的高效率转化。可见，改善细胞膜通透性的重要性，如何进行呢？,通常谷氨酸发酵采用的菌种都是生物素缺陷型，而生物素又是菌体细胞膜合成的必须物质，生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰CoA的

9、辅酶。生物素缺陷型菌种因不能合成生物素，从而抑制了不饱和脂肪酸的合成。因此，可以通过控制生物素的浓度，来实现对菌体细胞膜通透性的调节。生物素对细胞膜合成的影响主要是通过对细胞膜的主要成分磷脂(结构见图5-8)中的脂肪酸的生物合成来实现的，当限制了菌体脂肪酸的合成时，细胞就会形成一个细胞膜不完整的菌体。生物体内脂肪酸的合成途径如下：,三、菌种选育模型与控制方法 控制磷脂的合成 使细胞膜受损（如表面活性剂）青霉素损伤细胞壁，间接影响细胞膜 通过油酸的合成 控制磷脂含量 通过甘油合成 直接控制磷脂合成,提高细胞膜的谷氨酸通透性,谷氨酸产生菌的选育：1.选育生物素缺陷型 生物素是脂肪酸生物合成中乙酰C

10、oA羧化酶的辅酶，生物素促进脂肪酸合成，再由脂肪酸合成磷脂。选育生物素缺陷型菌株，阻断生物素合成，最终导致磷脂合成不足，细胞膜结构不完整，提高细胞膜的谷氨酸通透性。因此，控制生物素的含量可以改变细胞膜的成分，进而改变膜的透性、谷氨酸的分泌和反馈调节。表面活性剂对生物素有拮抗作用，阻断不饱和脂肪酸的合成，使磷脂合成受阻。青霉素的直接作用在于抑制细胞壁的合成。细胞膜失去细胞壁的保护而发生继发性变化。,2.选育油酸缺陷型：不饱和脂肪酸是磷脂的组成部分。选育油酸缺陷型，阻断不饱和脂肪酸的合成，并限制外源供给量，就可限制磷脂的合成。3.选育甘油缺陷型：该菌株缺失磷酸甘油脱氢酶，由磷酸二羟丙酮合成磷酸甘油

11、的途径被阻断。4.选育温度敏感型突变株：找到高温下细胞膜合成有缺损的突变株。5.其他，如营养缺陷型；药物抗性突变株；敏感型突变株等。表5-5，表5-6,第三节 赖氨酸发酵机制,一、行业介绍：Lys是人体所必需的8种氨基酸之一，（Thr Val Leu ILe Phe Met Lys try，苏、颉、亮、异亮、苯丙、蛋、赖、色），Lys主要来自于动物蛋白质。发酵法赖氨酸的生产最早起源于日本，我国80年代中期相继有赖氨酸的发酵生产厂家。80年代赖氨酸食品曾经非常盛行。http:/,我国的Lys生产与国外的差距主要表现在：（1）菌种性能的差异，Lys 是菌体代谢过程中的中间性产物，但不是主链上的产物

12、，其生成机制很复杂，对菌种的要求很高，国内菌种的产酸水平为：3555g/L，转化率为：2025%，远低于国外的生产水平；（2）提取率较低；（3）生产规模较小。,二、赖氨酸生物合成途径,目前已知的赖氨酸生物合成途径有两条，一条以细菌类为主、另一条以酵母菌为主。由于酵母菌体内的赖氨酸的生物合成产率要低于细菌类的，因此，目前的赖氨酸发酵生产都是采用细菌为生产菌种。,细菌类发酵与酵母菌发酵的比较：优点：（1）菌体体积较小，相对增殖所用的底物较少，产率高。（2）细菌的繁殖速度快，在合适的生长条件下，其繁殖速度只有十几分钟，而酵母的增殖速度最少在一个小时以上，这就为细菌发酵缩短发酵周期创造了条件。（3）细

13、菌的细胞膜的通透性易于调节，对于胞外产品，可以通过其细胞膜的通透性控制来促进产物的分泌，例如，GA的发酵；对于胞内产物，其细胞壁比酵母的细胞壁易于破碎。,缺点：1）细菌菌体较小，当需要从发酵液中把菌体分离出来（有利于产物的结晶提出，或产物就是菌体或菌体内的胞内物），细菌比酵母菌难以分离。2）细菌发酵过程中的无菌程度要求非常严格，发酵过程中大部分的细菌对于溶氧的要求也很高，这就增加了细菌发酵的生产成本。3）细菌发酵易感染噬菌体。,大肠杆菌中的Lys的生物合成与代谢调控,大肠杆菌赖氨酸代谢特点：关键酶：天冬氨酸激酶是一个同功酶，分别受三个代谢产物的抑制，这三个终产物分别是：Lys、Met和Thr，

14、只有当这三个代谢产物同时过量时，Asp激酶的活性才能完全被抑制。同功酶：天冬氨酸激酶1，天冬氨酸激酶2，天冬氨酸激酶3，三个酶催化同一反应，但其活性受不同代谢产物体调节的酶。,根据上述代谢特点，要使菌体合成并积累Lys，可以选育高丝氨酸脱氢酶缺陷型Hos-，这样的话，既可以解除天冬氨酸的代谢支路，使代谢流向Lys的方向进行，提高了从底物葡萄糖到产物的转化率；更重要的是由于Hos-，使得代谢过程中不可能产生过量的Met、Thr，尽管产生了大量的Lys，Lys可以抑制关键酶天冬氨酸激酶3，但是天冬氨酸激酶1、2的活性由于Met、Thr的限量，并没有受到抑制，也就是说，天冬氨酸半醛，仍可以大量的生成

15、，这就保证了Lys的生物合成途径的畅通无阻。,三、赖氨酸生产菌的育种途径首先，选择出发菌株。不同微生物的赖氨酸生物合成的调节机制不同，应该选择代谢调节机制比较简单的细菌作为出发菌株，如黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌和乳糖发酵短杆菌等。其次，根据菌株特性选育赖氨酸产生菌。方法有：优先合成的转换选育渗漏缺陷型选育高丝氨酸脱氢酶渗漏缺陷型，此突变株的高丝氨酸脱氢酶活性仅为野生株的1/30，于是合成的苏氨酸少，不足以与赖氨酸共同对天冬氨酸激酶活性产生协同反馈抑制作用，就可以过量积累赖氨酸。需要注意，活性很低的高丝氨酸脱氢酶容易受苏氨酸抑制和蛋氨酸阻遏，相应地造成苏氨酸或蛋氨酸缺乏，而抑制生长。,切断支路代谢

16、选育营养缺陷型诱变选育高丝氨酸缺陷型（高丝氨酸脱氢酶缺失），切断通向苏氨酸、蛋氨酸的代谢流，同时控制培养液中高丝氨酸（或苏氨酸蛋氨酸）量，降低苏氨酸浓度，解除赖氨酸苏氨酸对天冬氨酸激酶的协同反馈抑制作用，从而过量积累赖氨酸。,选育抗结构类似物突变株通过诱变使编码天冬氨酸激酶的结构基因发生突变，使天冬氨酸激酶对赖氨酸及其结构类似物（S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸，AEC）不敏感，即使在过量苏氨酸存在时，该酶也不与赖氨酸或其结构类似物结合，但酶的活性中心不变。这种突变株遗传性地解除了终产物对自身合成途径的酶的调节控制，不受培养基中所要求的物质浓度影响。只有抗性的菌株其赖氨酸产量不高，而具有抗性兼有

17、营养缺陷型的菌株，赖氨酸产量大为提高。,解除代谢互锁在乳糖发酵短杆菌中，赖氨酸的生物合成与亮氨酸的生物合成之间存在代谢互锁。赖氨酸生物合成分支途径的第一个酶二氢吡啶二羧酸（DDP）合成酶的合成受亮氨酸阻遏，使丙酮酸通向赖氨酸的代谢受阻，而流向丙氨酸、缬氨酸。解除这种代谢互锁的方法有：选育亮氨酸缺陷型菌株；选育抗亮氨酸结构类似物（2噻唑丙氨酸）突变株；选育对苯醌或喹啉衍生物敏感株（即亮氨酸渗漏缺陷型菌株）。,增加前体物的合成和截断副产物生成：增加天冬氨酸浓度，天冬氨酸激酶与底物的亲和力协同性增大，能够抵消变构抑制剂的影响，使前体物（丙酮酸、草酰乙酸、天冬氨酸等）充分地用于合成赖氨酸。增加前体物合

18、成可采用的方法有：A.选育丙氨酸缺陷型；B.选育抗天冬氨酸结构类似物（天冬氨酸氧亏酸，ASPHX）突变株；C.选育适宜的CO2固定酶TCA循环酶活性比突变株。改善细胞膜的透过机理,选育温度敏感突变株：如果突变位置发生在为亮氨酸合成酶系编码的基因中，使翻译出来的酶对温度敏感，则高温时就不能合成亮氨酸，即成为亮氨酸缺陷型，可解除代谢互锁。有实用价值的赖氨酸高产菌株多为营养缺陷、敏感性、结构类似物抗性等性状的双重、三重或多重标记的突变株。应用细胞工程和遗传工程育种把依靠诱变技术取得的优良特性通过重组DNA技术加以组合和应用。,防止高产菌株回复突变防止菌株回复突变至关重要。其方法除了经常进行菌种纯化、

19、检查遗传标记、减少传代次数、不用发酵液作为种子外，还可采用以下方法：A.选育遗传性稳定的菌株；B.定向赋加生产菌多个遗传标记。对抗性菌株，尽量育成多重抗性，增加抗回复突变，使生产性能稳定；C.菌种培养和保藏时，培养基要丰富，尤其有足够的要求营养物。对抗性菌株，应添加所耐的类似物；D.在培养突变株时添加抗生素（如红霉素、氯霉素），抑制恢复突变株生长，使其达到分离纯化的目的。,第四节 芳香族氨基酸发酵机制,芳香族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的分子中都含有苯环结构，所以称作芳香族氨基酸。这三种氨基酸在结构上的另一个共同点，是其直链都是丙氨酸。,人体的酪氨酸是由苯丙氨酸转化而得。苯丙氨酸、色氨酸是

20、必需氨基酸，用作氨基酸输液。因为色氨酸是玉米中所缺乏的氨基酸，故又用于饲料添加剂，另外，苯丙氨酸是二肽甜味剂的原料。,DAHP合成酶（DS）,分支酸变位酶（CM）,芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成的调节机制：1、DAHP合成酶（DS）：有三种同功酶，DS1受苯丙氨酸反馈控制，DS2受色氨酸反馈控制，DS3受酪氨酸反馈控制。图5-21酶1。2、分支酸变位酶（CM）：有两种同功酶，CM1受苯丙氨酸反馈控制，CM2受酪氨酸反馈控制。图5-21酶13。,第四节 分枝氨基酸,分枝链氨基酸（异亮氨酸，亮氨酸，缬氨酸）：有甲基侧链。图525分支链氨基酸的生物合成途径P94,第四节 精氨酸的发酵机

21、制,精氨酸族氨基酸（鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸）：以谷氨酸为前体。,鸟氨酸,瓜氨酸,精氨酸是具有胍基的碱性氨基酸，它和组氨酸一起，称为半必需氨基酸，在幼小动物的营养上，有重要价值。瓜氨酸是西瓜和柿子中的游离氨基酸。鸟氨酸以肽的形式，存在于细菌中。在医药上，除作试剂和输液以外，通常，精氨酸和鸟氨酸一起，用作保肝、强身、解毒剂之类药剂的原料。瓜氨酸有利尿作用。,*天冬氨酸,精氨酸代琥珀酸,精氨酸的合成,精氨酸,氨基酸发酵机制小结,1、掌握谷氨酸的生物合成途径及调节机制。2、了解赖氨酸的生物合成途径及调节机制。3、了解芳香氨基酸、分支氨基酸及精氨酸的生物合成途径。,思考题,1、柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点，如何控制？2、简述二氧化碳固定反映对于提高柠檬酸产率的意义。3、写出谷氨酸发酵的最理想途径，说明CO2固定化反应的重要性。4、谷氨酸产生菌之所以能够合成、积累并分泌大量的GA，其菌种内在的原因有哪些？5、谷氨酸发酵过程中，生物素（VH）作用表现在那几个方面？,