基因工程大实验报告 .docx

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1、编号:分类号：Q78本科生基因工程实验论文纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达指导教师：X X X学 生：X X专 业： 生物科学年 级：20092012年8月24日目录摘要2绪论3材料与方法41材料41.1试剂及仪器41.2菌种51.3质粒51.4常用溶液的配制52方法62.1引物的设计62.2 NK基因的PCR扩增72.3 DH5a和BL21(DE3)感受态的制备72.4 pMD19-T-NK的构建及转化和鉴定82.5 pET-trx、pET-NK、pUC-Nk 的酶切与回收92.6 pET- trx-NK的构建及转化和检测112.7 pET-trx-NK 的诱导表达122.8

2、pET-trx-NK 表达的 SDS-PAGE 检测13结果151. NK基因的PCR扩增152. pMD19-T-trx的构建与鉴定163. pET-trx、pET-NK、pUC-Nk 的酶切与回收164. pET-trx-NK的构建与检测185. pET-trx-NK的诱导表达与SDS-PAGE检测19讨论20参考文献21致谢21感想22纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达摘要纳豆激酶是一种枯草杆菌蛋白激酶。经研究发现纳豆激酶具有纤溶活性和溶栓能力, 可治疗和预防血栓病。此外，纳豆激酶还具有降低血液黏度、降血脂、降胆固醇，改善 血液循环状况，维持血细胞的正常形态和功能等作用。本文

3、主要介绍利用基因工程实验 技术操作纳豆激酶基因，将已经连接在PMD18-T载体上的纳豆激酶酶源基因用PCR扩增 出837bp的纳豆激酶的基因片段，与T载体连接后导入感受态的DH5 a菌中筛选鉴定。用 双酶切切下纳豆激酶的成熟基因片段，插入带有6个组氨酸标签的原核表达载体pET-trx, 导入BL(21)DE3感受态菌中诱导表达纳豆激酶蛋白质，用SDS-PAGE鉴定。关键词：纳豆激酶，基因表达，载体，大肠杆菌Constructing Expression Vector and Expressingnattokinase in E.coliABSTRACTNattokinase is a kind

4、 of subtilopeptidase. The study found that Nattokinase has activity of fibrinoltic which can treat and prevent thrombosis. In addition, Nattokinase can also lower blood viscosity, blood fat, cholesterol, improve blood circulation and maintain normal blood cells form and function and so on. Main of t

5、his article describe the gene engineering operation in nottokinase gene which has already connected with pMD-18-T vector amplified by PCR in which can get 837bp nattokinase gene fragments ,then linking with T vector that transform it into DH5a bacteria whiche wereened after identification. The matur

6、e peptide can be cutted by double-digested and insert with six histidine-tagged prokaryotic expression vector pET-trx. At last, induced the protein expression of nattokinase in the expression of E.coli BL (21) DE3. Eventually , identify that by SDS-PAGE.KEY WORDS： nattokinase, gene expression, vecto

7、r， E. coli绪论:纳豆激酶（nattokinase简称NK）是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由 纳豆枯草杆菌（Bacillus subtilisl natto）产生的一种具有强烈纤溶活性的碱性丝氨酸 蛋白酶1。纳豆激酶是食品纳豆中提取或纳豆菌发酵生产的分子量小的单链蛋白质。由于纳豆激酶具有纤溶作用强，作用迅速，药效时间长；来源于食品，安全性能好， 更易被人体消化吸收。可通过静脉与口服两种途径给药以及不引起出血的副作用等第一 代溶栓药物所不具备的优点，使其具有开发成新一代溶栓药的潜力。纳豆激酶于1987年由日本学者sumi在纳豆中发现。其成熟肽含有275个氨基酸， 分子量约为2

8、8ku，等电点为8.60.3。从纳豆中分离和纯化出一种蛋白激酶L这种酶 具有很好的溶栓作用，是一种枯草杆菌的发酵产物，为丝氨酸蛋白酶类，称其为 （nattokinase） L由275个氨基酸组成分子量为27kD,等电点为8.160.13L这种酶与其 它溶栓药相比，除具有较强的溶栓作用外，还具有体内作用时间长，无毒无副作用等优点。 我们用PCR方法克隆纳豆激酶基因，并重组到表达载体上进行了初步表达及表达产物 的活性测定，为用基因工程菌生产纳豆激酶奠定基础。经研究，纳豆激酶具有水解纤维蛋白的作用，它具有严格的限制性酶切位点，可直 接作用于交联纤维蛋白，使其水解成可溶性的小分子，从而达到直接溶解血栓

9、的作用。 提取纯化纳豆激酶，与交联的纤维蛋白酶解，发现不同时间降解交联纤维蛋白片段大小 不同，出现1413kD、36kD、和41 kD不同大小的片段，从而白哦名纳豆激酶具有直接降 解血栓的作用。纳豆激酶活体内尿激酶原转化为尿激酶，从而增加纤维酶的活性，进一 步加强它的溶栓作用；纳豆激酶刺激血管内皮细胞产生内源t-PA，t-PA催化纤溶酶原转 变纤溶酶，以使积累的纤维蛋白或血栓溶解；纳豆激酶通过降解好识货纤溶酶原激活剂 的抑制剂（PAI-1）调控纤溶作用。4纳豆中含有100种以上的酶，碱性蛋白酶和A-淀粉酶易将纳豆中蛋白质分解便于人 体消化吸收，弹性蛋白酶（Elastase）和植酸酶（Phyta

10、se）目前已被从纳豆中提取生产 应用于食品及其它工业中。纳豆激酶具有防治心脑血管栓塞、抗致病菌、防癌、抗癌、 阻止动脉粥样硬化、抗氧化、延缓衰老等多重作用，因此，纳豆激酶成为现在一项热点 研究项目。据统计，目前美国每年有15万人死于中风，在我国，每年死于冠心病者约60万人， 死于脑梗塞，脑溢血者120万人，约有80%病例是由于血栓引起而导致突发性恶果。而 纳豆激酶因具有特殊的溶血栓活性，既能预防也能治疗血管栓性疾病，与其他溶栓药物 相比，具有安全性能好、无免疫原性、易被人体消化吸收、可静脉注射也可口服、半衰 期长、生产价格低廉等优点，极有可能成为新一代李晓你哥的预防和治疗栓塞的新型药 物，将为

11、解决莫倩血栓溶解药物口服性差、价格昂贵、并发症多等问题带来更多希望。综上所述，我国学者对纳豆激酶基因的克隆、表达及表达产物的活性方面进行了深 入系统的研究，已经初步能够利用基因工程菌生产纳豆激酶样品。但是对于基因工程菌 的发酵工艺、表达产物的分离纯化工艺、表达产物的产量及收率方面仅进行了一些探索 性研究，要想实现利用基因工程菌工业化生产纳豆激酶，还需更加深入的研究。材料与方法1. 材料1.1试剂、仪器及实验用具1.1.1仪器台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，气浴振荡摇床（不需加水），制冰机 （GRANT），超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司），微波炉和电磁炉，电泳仪 （北京市六一仪

12、器厂，DYY-11型电泳仪）和电泳槽，电子分析天平（德国Sartorius公 司），恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂出品，HSH型），紫外分光光度计， PCR仪（Biometra华粤企业公司），通风橱，三用紫外分析仪，恒温细菌培养箱，凝胶 成像仪，高压蒸汽灭菌锅（日本HIRAYAMAHVE-50高压灭菌锅）。1.1.2实验用具超净工作台，玻璃涂布棒，酒精灯，双面微量离心管架，试管架，记号笔,手表，摇 菌试管，1.5mL离心管，0.5mL微量离心管，枪头（010uL，20200uL，2001000uL）， 100mL三角瓶，250mL三角瓶，凝胶成像系统，一次性薄膜手套等,0.2mLP

13、CR微量管，泡 沫塑料保温盒，培养皿，琼脂糖凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，垂直电泳槽及配套的 玻璃板、夹子、密封条、梳子。1.1.3试剂LB培养基，氨苄青霉素储存液，无菌ddwater， 100mg/mL （M/V） IPTG， 20%葡 萄糖，1.0mol/LTrisHCl （pH8.8），0.5mol/L TrisHCK pH6.8），10%SDS，30% Acr/Bis， 10% Aps，2X上样缓冲液，TEMED，低分子量蛋白分子量Marker，考马斯亮蓝染色液， 5 X电泳缓冲液，20% （M/V） IPTG，2% （M/V） X-gal，50 X TAE电泳缓冲液，漠化乙锭 储存液

14、，10X加样缓冲液，6X加样缓冲液，DNA分子量Marker，电泳级琼脂糖粉，3U/ uLTaqDNA 聚合酶，10XPCR 缓冲液（MgCl2free），25mMMgCl2, dNTP 混合液，10mg/mL RNase A，TE缓冲液，95%和70%乙醇，EcoR I和BamH I限制性内切酶，10X内切酶缓 冲液，0.1 mol/L CaCl2溶液，T4 DNA连接酶，连接酶缓冲液。1.2菌种带有pET-trx质粒载体DH5a菌，带有pMD18-T-NK载体的DH5a菌，E.coli DH5a, E.coli BL21 (DE3)。由基因工程实验室提供。1.3质粒1.3. 1目的基因所在

15、质粒:pMD-18T-NK1.3.2 表达载体：pET-trxP3.C o_ll FitzFT； | | TRXgs-8心 | CTC GAJk GTT CTG l -ll CAGCCA OCA GOAUQi JUxe-GiJuPro琏wIWTOC GCA C3AA TTCA.GC LXT AC；C： TAA CJT 援由.侦由此:由.TAA M ：丁丁4EcroRisjqx*yiujUXLri1.4 常用溶液的配制 1.4.1氨苄青霉素储存液：无菌水配制100mg/mL，分装后-20 C保存。1.4.2 LB培养基：胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g, NaCl 10g,加200mL ddwa

16、ter 搅拌完全溶解，用约NaOH调pH至7.0,加dd water至1L,分装4个200ml 和2个100ml,121C 20min灭菌。使用时可加入氨苄青霉素，终浓度100ug/mL。1.4.3 溶液II(NaOH/SDS 溶液)：0.2mol/L NaOH, 1%SDS,现用现配。1.4.4 50 X TAE 电泳缓冲液（pH 约 8.5）： Tris 碱 242g,57.1ml 冰乙酸，37.2g Na2EDTA 2H2O, dd water定容至1L。使用时稀释成IX。1.4.5琼脂糖凝胶：称取0.25g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入25ml 1XTAE电泳缓冲液 （注意原液是50X，按

17、照1:49的比例稀释），用保鲜膜盖住，放入微波炉里烧开 （30 s），取出观察，若无颗粒则置于桌面上冷却至不烫手即可灌胶，若仍然有颗 粒状物，需要再继续加热，直至无颗粒后冷却灌胶。1.4.6 1.0mol/L Tris HCl pH8.8：称取 12.1g Tris 碱，加 50mL 蒸馏水，缓慢地加浓 盐酸至pH8.8（约加8mL）。让溶液冷却至室温，pH将会升高，然后再调至pH8.8， 加蒸馏水至100mL。高温高压灭菌后4C保存。1.4.7 0.5mol/L Tris HCl pH6.8：称取 6.05g Tris 碱溶于 40mL 蒸馏水中，加约 48mL 1mol/L HCl，让溶液

18、冷却至室温，再用HCl调至pH6.8,加水稀释到100mL终 体积。高温高压灭菌后4C保存。1.4.8 30% Acr （丙烯酰胺）/Bis （N,N -亚甲基双丙烯酰胺）：30g Acr+0.8g Bis， 用dd water定容至100mL，4 C棕色瓶避光保存（现用现配）。1.4.9 10% Aps （过硫酸铵）：蒸馏水配制，-20C保存。过硫酸铵会缓慢分解，一周内 使用完。1.4.10 上样缓冲液：0.5mol/L Tris HCl pH6.8 2mL，甘油 2mL，20% SDS 2mL，0.1% 漠酚蓝0.5mL，B -2-巯基乙醇1.0mL，dd water 2.5mL，室温存放

19、。1.4.11 电泳缓冲液：Tris 7.5g，甘氨酸 36g，SDS2.5g，加 ddwater 至 500mL。使用 时稀释5倍。1.4.12 考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R250 0.25g + 45mL甲醇+10mL冰醋酸，用 ddwater 定容至 100mL。1.4.13 LB平板培养基：LB培养基中含1.2 % （1.2g/100ml）琼脂，高压灭菌后加入 氨苄青霉素至100Ug/mL，每个培养皿中约20mL倒制平板。2. 方法2.1设计引物PCR引物：上游引物（PDU，5端带BamHI酶切位点）：5-GGATCC ATG GCC TCC TCC GAG AAC-3下游引物（PD

20、L，5端带EcoRI酶切位点）：5-GAATTC TAC AGG AAC AGG TGG TG -32.2 NK基因的PCR扩增2.2.1 由老师提供pMD-18-T-NK质粒进行PCR扩增。2.2.2 在0.2mL PCR微量离心管中按下列剂量配制50uL的PCR反应体系。PCR体系50 UL （总）PCR Supermix45 uL模板质粒1 UL （稀释2050倍）Primerl1 U LPrimer21 U Ldd water2uL2.2.3 设置PCR仪的循环程序：94C5min 94C30s 60C30s 72C1min 72C10minPCR总时间需要1h50min。PCR结束后

21、，取5ul产物进行琼脂糖凝胶泳。观察是否有预计分子量的主要产物带。 注：退火温度NK： 60C 红色荧光蛋白：51C 绿色荧光蛋白：61C2.3 DH5 a和BL21(DE3)感受态的制备2.3.1 取2个1.5mL预冷10 min的无菌微量离心管，做上相应标记。2.3.2 其中一管加入1. 0mLBL21(DE3)菌液，另外一管加1.0mL DH5a菌液，然后在冰 上放置10min，5000r/min 4C 离心10min，弃上清。2.3.3 加入1ml冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中 静置30min。2.3.3 4C，5000r/min 离心 10

22、min。弃上清液后，用 1mL 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液重悬菌体，插入冰中放置30min。2.3.4 4C，5000r/min 离心 10min。弃上清液后，用 200uL 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液重悬菌体。2.3.5 在超净工作台内将两种菌按50ul/管分装在1.5ml管内，放于4C冰箱待用。2.4 pMD19-T-NK的构建及转化和检测2.4.1 PCR 产物（NK）与 pMD-19-T （PCR 2.1）载体直接连接阳性PCR产物与pMD-19-T载体（PCR 2.1）连接。在离心管中加入：pMD-19-T连接反应体系10uL （总）10xlink

23、 buffer1 u LPCR 2.1vector2uLPCR Product2uLT4 DNA Ligase1 u LDd water4uL在干式恒温气浴中14C，连接3 h。2.4.2感受态细菌的转化2.4.2.1 将恒温水浴的温度调节到42C。2.4.2.2 从4C冰箱中取出感受态菌，冰浴7min。2.4.2.3 取5 uL连接好的质粒与感受态细菌DH5a混匀，在冰上放置20min。2.4.2.4 于42C水浴中90S进行热休克，然后在冰中放置4 min，在超净台上加入300uL LB培养基（不含氨苄青霉素），37C振荡培养45 min。2.4.2.5 超净台上取上述转化的混合液150

24、u L、200 u L于新的1.5ml的离心管中，加 入 40uL 20% x-gal，7uL 20% IPTG 混匀。2.4.2.6 将上述菌液用涂布棒均匀的涂布在Amp+LB的固体培养基上，37C恒温培养过 夜。2.4.3 pMD-19-T-NK的鉴定（提取质粒使用Axygen试剂盒）2.4.3.1 观察菌落生长状态，用10uL枪头挑取3个白菌落分别置于含1.7mL LB培养 基中，37C摇菌培养8h。2.4.3.2 分别取1.4mL的菌液于1.5mL离心管中，10000r/min离心1min，弃上清。2.4.3.3 加250ul Buffer S1悬浮细胞沉淀。2.4.3.4 加 250

25、ul Buffer S2 温和上下翻转 6-8 次，12000r/min 离心 10min。2.4.3.5 吸取上步中离心上清液并转移到制备管，12000r/min离心1min，弃滤液。2.4.3.6 将制备管置回离心管，加500ul Buffer W1， 12000r/min离心1min，弃滤液。2.4.3.7 将制备管置回离心管，加700ul Buffer W2，12000r/min离心1min，弃滤液。2.4.3.8 方法同上制备离心管，加700ul Buffer W2， 12000r/min离心1min，弃滤液。2.4.3.9 将制备管置回2ml离心管，12000r/min离心1min

26、。2.4.3.10将制备管移入新的1.5ml离心管中，在制备管中加60-80ul Eluent，加热至 65C后，室温静置 1min， 12000r/min 离心 1min。2.4.3.11电泳检测：以蓝菌落作对照，电泳检测T4-NK是否连接并转化成功。2.5 pET-trx、pET-NK、pUC-Nk 的酶切与回收2.5.1提取pET-trx、pET-NK及pUC -NK的质粒（小提质粒Axygen试剂盒）2.5.1.1 取菌液10000r/min 1mim离心，弃上清。2.5.1.2 向吸附柱cp3中加入500 U 1的平衡液BL，12000r/min 1 min，弃废液。2.5.1.3

27、将菌体沉淀的离心管中加入250 u L的溶液P1进行悬浮。2.5.1.4 离心观众加入250 uL的P2,将离心管温和上下翻转6-8次，混匀，使菌液达 到清亮粘稠。（此步不超过5min）。2.5.1.5 离心管中加入350 u L的P3，温和翻转6-8次，混匀，12000r/min 10min。2.5.1.6 将上清转移到吸附柱cp3中，12000r/min 60s，弃废液。2.5.1.7 cp3中加入600u L漂洗液pw （无水乙醇），12000r/min 60s。弃废液。2.5.1.8 重复上步。后12000r/min 2min离心。弃废液。2.5.1.9 将吸附柱在新的离心管中，向膜中

28、心滴加100UL洗脱buffer EB，放置2min 后，12000r/min 2min 离心。2.5.1.10琼脂糖凝胶电泳检测提取质粒的质量。点样顺序1-7孔分别为张婷组酶切产 物、pET-NK （广）、pUC-NK （广）、pET-trx （广）、pET-NK （田）、pUC-NK （田）、pET-trx （田）。2.5.2 pET-trx、pET-NK、pUC-NK 双酶切2.5.2.1 pET-trx质粒DNA双酶切体系：pET-trx质粒DNA双酶切体系：40 UL （总）pET-trx 质粒20 uL（更具所提质粒浓度确定）EcoR I1.5 uLBamH I1.5 uL10xK

29、 Buffer4 uLDd water13uL2.5.2.2 pET-NK质粒DNA双酶切体系:pET-NK质粒DNA双酶切体系40 UL （总）pET-NK质粒20 uL（更具所提质粒浓度确定）EcoR I1.5 ULBamH I1.5 UL10xK Buffer4 ULDd water13uL2.5.2.2 pUC-NK质粒DNA双酶切体系：pUC-NK质粒DNA双酶切体系40 UL （总）pUC-NK质粒20 UL（更具所提质粒浓度确定）EcoR I1.5 uLBamH I1.5 uL10xK Buffer4 uLDd water13uL2.5.3 pET-trx、pET-NK、pUC-

30、NK 胶回收2.5.3.1用1XTAE和琼脂糖配制1%回收胶。2.5.3.2从恒温水浴锅中取出酶切产物，分别加入4uL的10X Loading Buffer终止反 应，并混匀。2.5.3.3选择13个相邻的点样孔，按顺序分别加入pET-trx空质粒，pET-trx大片段（小 样），pET-trx大片段（大样-广），pET-trx大片段（大样-田），苗落质粒，PCR 产物，pET-NK （小样）、pUC-NK （小样），空泳道，pET-NK （大样-广），pET-NK （大样-田），pUC-NK （大样-广），pUC-NK （大样-田）2.5.3.4电泳结束后用电话卡将含有大量酶切产物的泳道切下

31、，EB染色含小样的胶块。 在紫外灯下找到目的DNA带，用刀片在目的DNA带的下上下边缘各切一个小 口作为标记。2.5.3.5将做好切口标记的凝胶与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的切口标记估 计未染色的胶块上大样的DNA酶切产物的位置。2.5.3.6用刀片切下大胶中DNA产物所在的凝胶（尽量不要多余的凝胶），分别转移至 一个事先称量过的、灭活的1.5mL微量离心管中。再称量后计算出其中胶块 的重量。2.5.3.7再用EB染色切除DNA以后的大胶，与小胶条并在一起在紫外灯下检查是否 已把DNA带切走。2.5.3.8按照DNA凝胶回收试剂盒的说明书操作，回收DNA酶切产物。2.5.3.8.1 向

32、吸附柱CA2中加入500 UL的BL, 12000r/min 1min离心，弃废液，将吸 附柱从新回收到收集管中。2.5.3.8.2将单一的目的DNA条带胶块的离心管中加入600 u L的溶胶剂。2.5.3.8.3在60C水浴锅中放置10 min，中间隔2-3 min轻晃几次，确保胶体完全融 化，没有胶体颗粒剩余。2.5.3.8.4在溶胶过程中，平衡柱子，取6个有膜的ep管，加入500 uL的平衡液BL， 12000r/min 1min 离心。2.5.3.8.5待溶胶好后，静止2min （由于温度过高，平衡柱结合DNA能力较弱）， 12000r/min,离心 60s。2.5.3.8.6上柱，离

33、心后，弃废液。想cp柱中加入600 u L，漂洗液pw，12000r/min 60s。 弃废液。2.5.3.8.7重复上步。弃废液，12000r/min，2min，弃废液。开盖放置，彻底晾干。2.5.3.8.8将CA2，加入新的ep管中，先加入洗脱缓冲液EB 350 uL，放置2min。 12000r/min 2min。收集 DNA 洗脱液。2.5.3.9 pET-trx NK gene胶回收电泳验证点样孔1234567样品pET-trx 大片pET-trx 大片pET-trx 质粒段（广）段（田）pET-NK （广）pET-NK （田）pUC-NK （广）pUC-NK （田）2.6 pET-

34、trx-NK的构建及转化和检测2.6.1 pET- trx -NK 的构建（1）提前将干式恒温仪（或泡沫塑料保温盒里的水）温度调整到14C。（2）取一个高压灭活的0.5mL微量离心管，加入如下连接体系：畛野内蒙古大学生命科学学院生物系2012年本科生基因工程大实验论文pET-trx-NK连接体系10uL （总）pET-trx 回收 ProductNK 回收 Product10x Ligation BufferT4 LigaseDd water1 u L(根据所提质粒浓度确定)3uL1 u L1 u L4uL将上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于16C水中保温过夜连接。2.6.2 pET-t

35、rx-NK 转化 BL21 (DE3)2.6.2.1将恒温水浴的温度调到42C。2.6.2.2 从4C冰箱中取出一管BL21(DE3)感受态菌，插入冰上。2.6.2.3加入5uL连接好的pET-trx-NK质粒混合液，轻轻震荡后放置冰上25min。2.6.2.4轻轻摇匀后插入42C水浴中90s进行热休克，然后迅速放回冰中，静置5 min。2.6.2.5在超净工作台中向上述管中加入300uL LB (不含氨苄青霉素)培养基轻轻混 匀，然后固定到摇床的弹簧架上37C震荡45min。2.6.2.6在超净工作台中取上述转化混合液300ul，混匀后滴到含合适抗菌素(Amp+)的 固体LB平板培养皿中。从

36、酒精中取出玻璃涂布棒，在火上点燃，熄灭后稍等 片刻，待其冷却后轻轻涂布均匀。选两组不同条件进行对照对照1100uL37C恒温培养箱对照2200 u L室温2.6.2.7在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37C恒温培养箱中约30min直到表面 的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37C恒温培养箱中培养过夜。2.7 pET-trx-NK的诱导表达2.7.1 观察平板上菌落生长状态，发现少数，不明显的菌落散布，由于菌落的数量过 少，故用其他小组的菌落进行扩培。2.7.2 将LB培养基分装到100ml的三角瓶中，后加入氨苄青霉素(100mL/100 u L)。2.7.3 将加好(Amp+ )的LB

37、培养基分装到灭菌的试管中1.6mL/管2.7.4 挑菌，37.4C摇床中，进行摇菌扩培。2.7.5 质粒提取使用Axygen试剂盒，步骤与2.5.1小提质粒相同。2.7.6 提质粒后进行电泳检测。2.7.7 将LB培养基配制成含0.2%的LB-葡萄糖培养基(Amp+浓度为120 u g/ml,即 100ml/120 u l 的比例加入 Amp+)2.7.8 将正确的质粒对应的菌液加入6山1的LB-葡萄糖培养基培养基30C,慢摇过夜。2.8 SDS-PAGE 检测 pET-trx-NK 的表达2.8.1 电泳槽的组装及配胶2.8.1.1组装电泳玻璃并用细橡胶管密封底部和侧面，然后用夹子夹住玻璃两

38、侧的中央 部位。插入梳子后在玻璃上距离梳子齿底部1cm处做一个标记。拔掉梳子，倒 入自来水检验是否漏水。如不漏水，弃掉自来水后在卫生纸上倒置片刻，尽可 能流尽水份。2.8.1.2配制10%分离胶：按顺序和量取下列溶液混在一个50mL的小烧杯中： Acrylamide-Bis3.96ml1M Tris(pH8.8)4.38mldd water3.432ml10% SDS118.8uLTEMED9.9uL10%APS118.8uL2.8.1.3加完TEMED后拿起烧杯轻轻转动几下底部，将溶液混匀后，立刻缓缓倒入玻璃 夹缝中，直到液面与所作的标记齐平。剩下的胶液留在小烧杯中，倾斜放置。2.8.1.4

39、在胶液面上部用1000uL微量移液器轻轻地沿玻璃壁来回移动加满dd water。 静置约30min。直到烧杯中剩余的胶液凝固。倒出蒸馏水。2.8.1.5配支持胶：按顺序和量取下列溶液混在一个50mL的小烧杯中：Acrylamide-Bis0.675ml0.5M Tris(pH6.8)0.563mldd water3.165ml10% SDS45uLTEMED7.5uL10%APS45uL2.8.1.6加完TEMED后拿起烧杯轻轻转动几下底部，将溶液混匀后，立刻倒入玻璃夹缝 中，液面与玻璃上边缘齐平。然后再慢慢插入梳子，静置约20min。烧杯中剩 下的胶液倾斜放置，直到其中的溶液凝固。2.8.1

40、.7去掉橡胶管，将装有胶的玻璃和梳子翻转，贴在电泳槽侧面，用夹子把玻璃两边 的中部与电泳槽中部夹在一起。2.8.1.8在上面的槽中加满自来水试验一下是否漏水，然后倒掉自来水。2.8.1.9配制1X加样缓冲液400mL，从上面的电泳槽倒入，若不从下面的电泳槽漏水，则加满缓冲液，在将下面的电泳槽也加满电泳缓冲液，小心缓慢地拔出梳子。2.8.2 外源基因的诱导表达2.8.2.1 超净台中接种 pET-trx-NK的BL21(DE3)菌 空 pET-trx 转化 BL21(DE3 )菌 BL21 (DE3 )空菌。37C摇菌。2.8.2.2 IPTG (测 OD600 =0.4 - 0.6 即能诱导表

41、达)编号稀释前OD600稀释后OD 600IPTG0.7280.481100 u g/mL (0.5 u L/mL)0.7720.5100.6670.480不添加IPTG2.8.2.3150-170r/min摇菌，设置浓度梯度和时间梯度对比。编号加ITPG量1.5 uL2 uL2uL-11.5 h摇菌时间2.5 h2.5 h2.5 h-22.0 h-33.0 h注：其中、菌形成等时间的浓度梯度对照，-1、-2、-3菌形成等浓度的时间梯度对照。2.8.3 各取1.5ml菌液及未加IPTG诱导的菌液4000rpm离心15min，弃上清，收获菌 体。将表达后的菌体与2X上样缓冲液按1:1混匀于微量离

42、心管中，用20uldd water重悬菌体，加入20ul的2X加样缓冲液，煮沸5min。2.8.4 电泳泳道设计1-10泳道加样顺序依次为：marker、无IPTG空菌BL21 (DE3)、 IPTG 空菌 BL21 (DE3)、-1、-2、-3、无 IPTG pET-trx-NK。2.8.5 电泳时，10 mA恒流,120V电压电泳。直至到条带到支持胶处，改为20 mA 点流，120V电压电泳。2.8.6 染色考马斯亮蓝染色30min，流水冲掉染料后脱色液脱色1h，去离子水浸泡过 夜。实验结果与分析1. NK基因的PCR扩增将实验室提供的pMD-18-T-NK质粒进行PCR扩增，在30个PC

43、R循环中，得到NK基 因的扩增片段，进行琼脂糖凝胶电泳得到图1的电泳图。20001000750 500250100M 12345 M图1： pMD19-T-NK基因的PCR扩增产物电泳检测注：m： DL2,000TMDNA Maker 1-5： NK 的 PCR 产物1.1 点样孔2-5中，点样的顺序依次为刘杭州组的NK PCR Product、我组的NK PCR Product、我组的NK PCR Product阴性对照，田文嘉组的NK PCR Product、田文 嘉组NK PCR Product阴性对照。1.2 分析：其中我组没有NK PCR Product。1.2.1在加PCR体系的过

44、程中，由于许多小组一起混用Primer1和Primer2，不能避免 有污染的可能性。1.2.2 PCR体系加样过程中，在离心管上所做的标记已经模糊，不能排除体系加混乱的 可能性。2. pMD19-T-NK的构建及转化和检测2.1 用已经扩增好的PCR产物(NK)与pMD-19-T (PCR 2.1)载体直接连接。并将连接 好的pMD19-T-NK质粒导入DH5 a感受态菌中，进行诱导鉴定。将转化的DH5 a感 受态菌，摇菌培养后涂平板。涂到LB(Amp+)的固体培养基中，过夜培养，进行蓝 白斑鉴定。2.2 分析：整个大组都没有培养出菌落2.2.1 pMD-19-T载体是有实验室提供，而且全部试

45、验小组菌未有蓝白菌落的出现。所 以不能排除，pMD-19-T载体质粒出现了问题。2.2.2在加ALB培养基，进行摇菌培养时，LB培养基出现问题，即在摇菌时使用的是 LB (Amp+)的培养基。由于pMD-19-T-NK刚导入DH5 a感受态菌中，导入量很小， 能够抗Amp+的菌中很少，所以用LB (Amp+ )的培养基，摇菌会使大量的菌体死亡 而导致涂平板时，没有菌落生成。3. pET-trx、pET-NK、pUC-Nk 的酶切与回收3.1 pET-trx、pET-NK、pUC-Nk质粒提取电泳鉴定上一步中，整体大组没有转化得到所需要细菌，无法直接提取质粒，老师提供之 前实验室保存的菌种pET

46、-trx、pET-NK、pUC-NK进行质粒的提取，然后电泳鉴定。pET-NKpET-trxpUC-NK, 人、人、, 人 、( ( 1234567图2： pET-trx、pET-NK、pUC-Nk质粒提取电泳鉴定注：本次电泳未用Marker对照。1泳道：其他组提取物；2-7泳道：为提取的质粒。根据 pUC-NK、pET-trx、pET-NK 的 DNA 链的长度分别为 3.6Kb、3.3Kb、 行组内对比，分析三种质粒电泳条带所处的位置，可得出三种质粒提取物，3.2 pET-trx、pET-NK、pUC-NK 胶回收4.1Kb，进是正确的。对所提取的三种质粒进行双酶切，过夜后进行电泳胶回收，质粒DNA。13123456789101112图 3： pET-trx、pET-NK、pUC-NK 胶回收电泳图注：1-2泳道：pET-trx质粒、pET-trx大片段（小样）；3-4泳道：pET-trx大片段（大样-广），pET-trx大片段（大样-田）；5-8泳道：菌落质粒，PCR产物，pET-NK （小样）、pUC