蛋白质的结构测定.ppt

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1、第一节蛋白质溶液的热力学第二节蛋白质折叠动理学第三节突变、稳定性和折叠,热运动与蛋白质构象热力学函数与热力学平衡热容量,vant Hoff焓折叠/退折叠转变量热法与折叠过程热力学,第十讲 蛋白质的物理化学性质分析,第一节蛋白质溶液的热力学第二节蛋白质折叠动理学第三节突变、稳定性和折叠,一、折叠动理研究技术二、两态动理三、过渡态折叠过程与过渡态对折叠过渡态的性质分析,四、折叠中间态熔球态快态与慢态二硫键引起的中间态多结构域蛋白的折叠,第十讲 蛋白质的物理化学性质分析,五、折叠的基本过程接触形成螺旋-链环转变-发卡形成,第一节蛋白质溶液的热力学第二节蛋白质折叠动理学第三节突变、稳定性和折叠,二、突

2、变与热稳定性疏水突变氢键突变适应极端条件的突变体,一、热力学参数在分子水平上的解释静电相互作用范德华相互作用氢键疏水效应二硫键,第十讲 蛋白质的物理化学性质分析,三、突变与折叠过程过渡态的突变分析突变对稳定性和折叠过程的影响,Nuclear Magnetic Resonance(NMR),X-ray Crystallography,Cryo-Electron Microscopy(cryo-EM),第十一讲 蛋白质的结构测定,Nuclear Magnetic Resonance(NMR),X-ray Crystallography,Cryo-Electron Microscopy(cryo-E

3、M),Does not need crystals.,More information about dynamics.,Limit to MW 40,000.,Less reliable.,+,+,-,-,Atomic resolution.,+,Unlimited size.,+,Time-resolved study can be performed.,+,Techniques very robust.,+,Need crystals.,-,Deal with very large complex.,+,Various sample forms can be studied.,+,Lowe

4、r sample purity.,+,Does not need crystals.,+,-,Complicated experimental procedures.,Lower resolution.,-,第十一讲 蛋白质的结构测定,X-ray Crystallography-1,Analogies Between Light Microscopy and X-ray Crystallography.,X-ray Crystallography-2,Why X-ray?,X-rays are needed to visualize atomic features.,X-rays wavele

5、ngths:CuKa=1.54,Synchrotron=0.52.5,Theoretical resolution limit:R l/2,Why Crystal?,No lens can focus X-ray.Crystals rather than single molecules are used merely to boost signal level.(Crystals are regular periodic arrays of molecules.),X-ray Crystallography-3,X-ray Crystallography-4,Key Steps of Mac

6、romolecular Structure Determination by X-ray Crystallography,Sample preparation.,Grow crystals.,Collect X-ray diffraction data.,Estimate phases for the diffraction pattern.,Calculate an electron density map.,Build an atomic model.,Refine the model.,Interpret the model according to available biochemi

7、cal/genetic data.,Design new structural/biochemical/mutagenic experiments.,X-ray Crystallography-5,A Typical Solubility Curve for a Protein,X-ray Crystallography-6,The Vapor Diffusion Method of Crystallization,X-ray Crystallography-7,A Standard Approach of Finding Initial Crystallization Condition,p

8、H,+precipitant,Crystals of Bio-Macromolecules,Protein crystals typically Contain 30%to 80%solvent.,Protein crystals usually contains large solvent channels.,Ligands(such as drugs,inhibitors,cofactors)can be soaked into their physiological binding sites.,How do you experimentally distinguish salt and

9、 protein crystals?,X-ray Crystallography-8,Data Collection,X-ray Crystallography-9,Data Collection,X-ray Crystallography-10,In-house setup,Synchrotron X-ray facility,-Fixed wavelength.,-Low photon flux.,-Affordable.,-White X-rays,tunable wavelength.,-High brilliance.,-Very very very expensive.,X-ray

10、 Crystallography-11,Synchrotron X-ray Sources,SRRC,Taiwan,-White X-rays,tunable wavelength.,-High brilliance.,-Very very very expensive.,Experimental Area,X-ray Crystallography-12,X-ray Diffraction Patterns,X-ray Crystallography-13,Electron density image and its interpretation(the so-called crystal

11、structure).,How do we judge the quality of a reported crystal structure in PDB?,X-ray Crystallography-16,Resolution greatly affects the quality of a crystal structure.,6.0,4.5,3.0,1.5,X 射线晶体结构分析是使用X 射线作为物理工具，以晶体作为研究对象，晶体结构作为研究结果的一种分析方法。所以，从使用的物理工具和研究对象的观点出发，它包含了X 射线和晶体这两方面内容。1.X 射线X 射线是德国物理学家伦琴在1895

12、 年发现的。随后，人们发现了X 射线的波动本质，其波长范围大约在0.0110 nm 的范围。,一、概念基本原理,第一节 X 射线晶体结构分析,晶体结构分析所使用的X 射线波长大多在0.l nm 左右，与分子中原子的距离相当。X 射线的生成主要有两种完全不同的方式，一种是阳极靶材料受到高能电子的轰击，原子的内层电子跃迁到外层后又跳回内层发出的所谓特征X 射线。这种X 射线的波长严格和构成该材料的原子能级相匹配。比如铜的K辐射，是铜的K 壳层电子跃迁到L 层又返回K 层后所发出的辐射，其波长约为0.154 nm，这是X 射线晶体结构分析经常使用的X 射线波长。,一、概念基本原理,第一节 X 射线晶

13、体结构分析,一、概念基本原理,第一节 X 射线晶体结构分析,生成X 射线的另一种方式是同步加速器辐射。当接近光速的高能带电粒子在磁场中沿曲线轨道运行时，沿切线方向就辐射出电磁波，电磁波的波长和强度与电子能量相关联。它是使用同步加速器的高能物理研究实验室所提供的寄生辐射，其波长在0.01 nm1 m 之间（从紫外线到X 射线），见图5-20。同步辐射因其辐射强度高、波长连续可变、准直性能好等特点而在许多科学领域内获得了广泛的应用，其中包括X 射线晶体结构分析。,一、概念基本原理,第一节 X 射线晶体结构分析,一、概念基本原理,第一节 X 射线晶体结构分析,2.X 射线衍射X 射线晶体结构分析所依

14、赖的物理原理是X 射线的衍射现象，衍射现象的产生是X 射线与组成晶体的原子核外电子相互作用的结果。X 射线衍射是劳厄（Laue）等人在1912 年发现的。当不考虑衍射线强度时，X 射线衍射与可见光的衍射很相似，简单说来，都是光线通过光栅后改变了光线的传播方向的一种物理现象。当光线打到光栅上时，光栅上的每一个结点都变成了一个点光源，它们向四面八方发射出与入射线有相同波长的散射线，散射线在空间的叠加就会产生衍射现象。,一、概念基本原理,第一节 X 射线晶体结构分析,条件是光栅的尺寸要和射线的波长是同数量级的，这样光栅上不同结点上的散射线才能发生相干，即叠加。这是因为散射线的路径方向不同会产生一个光

15、程差，从而造成散射线叠加，其后果为，在空间的某处光波加强，在另一处则是减弱或相消。晶体中分子内原子间距在0.1 nm 范围左右，所以使用波长0.l nm 左右的X 射线可以使晶体产生衍射现象，这是因为核外电子散射X 射线的结果。,一、概念基本原理,第一节 X 射线晶体结构分析,著名的布拉格公式(2dhklsin=n)就是根据散射线叠加的原理推导出来的。它将入射线波长、衍射线方向以及光栅结构三者建立起了数学的定量关系，为X射线晶体结构分析奠定了基础。当然，光有布拉格公式还是不够的，因为它仅仅将光栅结构（晶体中晶胞的大小和形状，包括它的对称性）和衍射方向联系了起来，至于晶胞中的原子种类及其在晶胞中

16、的分布位置还要靠衍射线的强度信息才能推导出来。所以，还要介绍富里哀综合法在测定晶体结构中的应用。,一、概念基本原理,第一节 X 射线晶体结构分析,3 周期函数和富里哀定理周期函数就是一个自身重复的函数。富里哀理论表明，任何一个有理的周期函数都可以通过把足够数量的正（余）弦函数相叠加起来构成原来的那个周期函数。晶体中原子的核外电子在空间的分布是周期重复的，被称为电子密度。,一、概念基本原理,第一节 X 射线晶体结构分析,4 晶体晶体是衍射光栅，是X 射线晶体结构分析的研究对象。要想使用X 射线衍射来测定某物质的结构，就必须将该物质先制备成晶体。晶体的最基本特征是它的内部高度有序性。也就是说，组成

17、晶体的分子、原子在三维空间中是严格按着一定次序周期排布的，只有这样才能形成衍射光栅。,一、概念基本原理,第一节 X 射线晶体结构分析,晶体的最小结构单位叫晶胞，晶体就是通过晶胞在三维空间的周期重复（平移）而构成的。可以想象成晶体里面存在着无数个形状、体积完全相同的小平行六面体，这些平行六面体面靠面，边靠边，中间无缝隙。通常，一个中等大小的单晶体，边长23mm 的立方体内含有1020个左右这样的平行六面体。显然，仅根据物质在晶体中周期排布这一性质来选晶胞是不行的（选取方式太多），所以又增加了一些规则，如晶胞的三边尽量成直角等。于是，晶胞的选取只有7种类型，称为7种晶系。此外，通过深入的研究又发现

18、，晶体中结构通过平移产生的重复部分又被划分成14种不同类型的点阵，这都是几何晶体学的内容。,一、概念基本原理,第一节 X 射线晶体结构分析,晶体的另一个重要性质就是对称性。晶胞存在的可能的230 个空间群，就是利用一定的对称操作将某物质的可重复部分在14 种晶体点阵上的安排加以总结的结果。因为晶胞有对称性，所以晶胞内部由对称元素相关的最小单位又称为不对称单位。不对称单位是晶体结构分析的单位，它虽然是分子结构的独立单位，但它不是晶体的重复单位，因为它不说明晶体的周期性质。显然，只有晶胞才是晶体的最小单位。它们之间的关系可由图5-6 所示。,一、概念基本原理,第一节 X 射线晶体结构分析,一、概念

19、基本原理,第一节 X 射线晶体结构分析,图5-6 晶体中晶胞和不对称单位的关系。(a)不对称单位中有一个或多个分子；(b)分子由空间群对称操作形成一组分子集合；(c)分子集合形成晶胞；(d)晶胞平移形成晶体。,5 天然和重组蛋白质X 射线晶体结构分析的特殊性早在1830 年就有了血红蛋白晶体，而且直到X射线晶体学问世(1930年前后)，蛋白质晶体已有很多，但直到1934 年，英国著名晶体学家伯纳尔（J.Bernal）和克萝芙特（D.Crowfoot,就是1956年解出维生素B12晶体结构的霍奇金教授，她因此而获得1964 年诺贝尔奖）才发现，研究蛋白质晶体应该和小分子晶体完全不同，后者往往是暴

20、露在空气中；而前者必须与母液一起密封在毛细管内，以免蛋白质晶体暴露在空气中因失水而破坏。经历了整整20年，第一张完美的蛋白质晶体 胃蛋白酶的X 射线衍射照片才出世。,一、概念基本原理,第一节 X 射线晶体结构分析,佩鲁茨（Perutz）曾于1937 年将血红蛋白的X 射线晶体结构分析作为他的博士论文，但他完成血红蛋白的0.55 nm 分辨率的晶体结构是1959 年，这是第二个问世的蛋白质晶体结构。第一个蛋白质晶体结构是肯德鲁（Kendrew）于1957 年完成的肌红蛋白的0.6 nm 分辨率结构。他们使用了相同的方法同晶置换法，并因此而获得了1962 年的诺贝尔奖金。,一、概念基本原理,第一节

21、 X 射线晶体结构分析,同晶置换法的大意是：要对所研究的蛋白质晶体中的分子做一点化学修饰，即在分子的特定位置上加入一些重原子。所谓重原子，就是元素周期表中碘原子以上的原子，相对于构成蛋白质的碳、氮、氧原子来说它们就是重原子。当然，这种化学修饰不能破坏晶体的周期排布性质。利用引进的重原子所造成的衍射线强度的差别，使用帕特森函数就有可能推出位相信息。,一、概念基本原理,第一节 X 射线晶体结构分析,数据精度不够就需要改进收集衍射数据的仪器设备。早期的X光机功率低，无论是封闭管式还是可拆式，X 光能量都很低。使用X 光胶片又引进了一系列误差。所以X 射线衍射仪、转靶X 光机、细聚焦X 光管、多丝面探

22、测器、图像板（image plate）、同步加速器辐射都应运而生了。另一方面，蛋白质晶体学总是率先使用当代运转最快速的电子计算机，这是因为它所需要的运算量极大，特别是对结构模型的精化，没有大容量、速度快的计算机是不行的。,一、概念基本原理,第一节 X 射线晶体结构分析,在蛋白质晶体结构分析方法没有突破以前，培养蛋白质晶体当然不是个主要问题。早期，人们乐观地看到在马脾上滴几滴硫酸镉溶液就可以获得一种蛋白质晶体，待到方法突破之后，人们才真正体会到蛋白质晶体的生长原来是结构分析的一个瓶颈。用于小分子晶体生长的简单蒸发过饱和法不适用于蛋白质晶体的生长。所以蛋白质晶体生长技术也成了蛋白质晶体学发展的一部

23、分。,一、概念基本原理,第一节 X 射线晶体结构分析,最后，对X射线晶体结构分析的基本原理和光学显微镜的成像原理作一个简单的类比。光学显微镜使人们能见到肉眼见不到的东西，这是因为和光波波长相当的样本距离（如细胞器等）可以作为光波的衍射光栅，衍射线经物镜的组合聚焦（叠加）给出了一个实体的虚像，然后经目镜放大，人们就可以见到细胞器了。这样说来，X射线衍射晶体结构分析和光学显微镜应该有大致类似的物理学原理，所不同的是人们找不到一个透镜来聚焦X射线，所以必须通过富里哀加和来重现电子密度。同时，在富里衰加和时又需要解决位相问题，这就使问题复杂化起来。,一、概念基本原理,第一节 X 射线晶体结构分析,科学

24、的发展正使人们发现一些更简单的方法最终可以直接看到复杂的蛋白质三维结构。比如，X光激光不断向短波方向延伸，就有可能发明X光激光显微镜，因为激光的位相已知，将会使问题大大简化。在现阶段，由于仪器技术和方法的不断改进，以前测定一个蛋白质的结构需要以年计算，而现在可能只需要以天计算了。第三代同步辐射的应用，使晶体小到2040nm的蛋白质复合物等结构得以测定并达到原子分辨率水平。这些复合物有上百纳米的大晶胞，使衍射数据量达到天文数字。同时，由于极强的同步辐射光源加上极细的聚焦，使蛋白质结构的动态研究成为可能，如大分子酶在晶体中的催化过程。目前，时间的分辨已可达到纳秒的水平。,一、概念基本原理,第一节

25、X 射线晶体结构分析,由于X射线衍射分析技术的发展，以及核磁共振、蛋白质结构预测等技术在蛋白质结构分析中的应用，使20 世纪末又诞生了一门新兴学科结构生物学。该学科是以生命物质的空间结构的运动性为基础来阐明生命活动本质的一门学科，特别是在人体基因组定位之后，又发展成为结构基因组学或称结构蛋白质学，其目的就是获得全部蛋白质的三维结构与功能的关系。显然，结构生物学在研究基因功能的战略任务上将起到关键性的作用。,一、概念基本原理,第一节 X 射线晶体结构分析,反过来，基因功能研究的需要，又要求快速、准确、系统地测定每一个基因所表达的蛋白质结构，目前人们也只是掌握了其中的12而已。这就要求发展快速批量

26、表达基因的方法，与蛋白质纯化、培养晶体、数据收集、分析结构形成“一条龙”，使用最先进的软件和技术使晶体结构分析达到全自动化。这样一来，就可使晶体结构分析的过程大大简化到犹如操作一台普通的光学显微镜，甚至达到使中学生也可以使用的程度。实现结构的全自动化分析（其中不仅是X射线晶体结构的全自动化分析，还包括NMR的全自动化分析），是结构基因组学的基本要求，否则很难想象实现工业化大批量“生产”蛋白质的三维结构，也就谈不上基因功能研究的现代化。,一、概念基本原理,第一节 X 射线晶体结构分析,蛋白质X 射线晶体结构测定的基本过程 经基因克隆、表达后所生成的蛋白质提纯。这一步原属于生物化学工作者的工作，在

27、结构基因组学时代，很多实验室已把这一步工作作为X 射线晶体学工作的第一步。晶体生长并经冷冻技术处理；重原子衍生物制备；衍射数据收集；衍射数据分析和改进；获得最后的结构模型（包括修正）。以上的步骤也是结构测定全自动化分析的几个基本环节。,一、概念基本原理,第一节 X 射线晶体结构分析,蛋白质结晶和晶体生长是影响结构分析速度的重要阶段。1 对原材料的要求 晶体的重要特征是其内部的高度有序性，所以要求能够生长晶体的原材料也应具有高度的均一性。构成原料的微观不均一性的某些方面对某些生物化学研究可能是不重要的，但直接影响到大的单晶的形成。要求在长晶体以前对其生物化学性质尽量有一个非常透彻的了解，样品的分

28、离提纯条件往往就是晶体生长的最佳条件之一。同时，还要对样品中的内含物做到心中有数，特别是金属离子，需要了解清楚。,二、蛋白质结晶和晶体生长,第一节 X 射线晶体结构分析,蛋白质结晶和晶体生长是影响结构分析速度的重要阶段。1 对原材料的要求 在拿到样品之后，最好是做一个等电聚焦，考察一下是否是一条带，若不是就要小心了。还要注意到样品在运输过程中的变化，样品一般应以冻干粉保存，否则就应该处于液氮保存状态之下。使用样品一般应在低温状态下操作，若发现有纯度问题就要小心鉴定，最后很可能不得不使用高压液相层析（HPLC）来分析，甚至分离。,二、蛋白质结晶和晶体生长,第一节 X 射线晶体结构分析,2 晶体生

29、长的生物化学条件 小分子晶体生长的自由能、相平衡理论，溶质、溶剂分散以及排斥和相互作用的学说等很难应用于蛋白质的晶体生长，由于蛋白质构象固有的复杂性，目前尚无法对溶液中的自由能、固态中可能形成的键数以及键能等因素进行精确的理论计算和预测，所以，蛋白质的晶体生长仍以经验总结为主。蛋白质晶体生长的生化条件主要是指pH 值、离子强度、沉淀剂和添加剂（如有机溶剂、盐或去垢剂）的浓度等因素。,二、蛋白质结晶和晶体生长,第一节 X 射线晶体结构分析,首先要注意到，生物化学的分离、提纯过程就是蛋白质不断均一浓缩的过程。在纯化的最后阶段，一旦溶液中的蛋白质达到了溶解度最小的条件,同时蛋白质溶液达到过饱和的时候

30、，蛋白质在溶液中是处于亚稳态，蛋白质就能成核并形成晶体，从溶液中析出。关键是要使这个过程足够缓慢，使蛋白质有机会形成规则的周期排布，才能形成大晶体。如果这个过程发展得太快，尽管晶体生长的条件已经满足，蛋白质还是完全有可能以无定形状态或微晶从溶液中析出。所以，要了解蛋白质分离、纯化的条件，注意蛋白质的稳定性、溶解度的信息，注意纯度、浓度和活力等有关信息。,二、蛋白质结晶和晶体生长,第一节 X 射线晶体结构分析,在摸索晶体生长的过程中，首先是缓冲液的选取，其次是沉淀剂，然后是蛋白质浓度，对有些蛋白质来说，还要考虑到使用特殊的金属离子、防氧化剂、防腐剂，甚至底物和辅酶等，余下的就是经验了。比如，应该

31、了解离子强度对蛋白质的影响，必要时做实验曲线了解“盐析”或“盐溶”的范围。比如，是配制蛋白质的过饱和清液还是使沉淀的蛋白质缓慢溶于饱和蛋白质溶液中？比如，蛋白质无定形沉淀的回收和再使用都是值得探讨的问题。,二、蛋白质结晶和晶体生长,第一节 X 射线晶体结构分析,3 晶体生长的物理条件这里所说的物理条件是指温度、震动、溶剂的清洁度、试剂的纯度、重力等因素。在生物化学条件合适的情况下，往往就可以得到微晶，物理条件掌握得好，才可以获得大的单晶，因为物理条件控制了晶核形成的速度和晶体生长的速度。,二、蛋白质结晶和晶体生长,第一节 X 射线晶体结构分析,温度是首先应该注意到的问题。一般情况下，蛋白质皆不

32、能耐受高温，大多数蛋白质在6070下要变性，有些蛋白质只有在低温下才能保持其活力。对不同蛋白质选择一个合适的温度并将温度保持恒定是晶体生长的基本要求。温度的变化会造成蛋白质溶液过饱和的扰动，改变蛋白质的溶解度，这都是对大晶体生长非常不利的。反过来说，基于同样的理由，有一种晶体生长方法是专门利用温度来调节蛋白质溶解度的，其先决条件是温度必须是单向缓慢地变化，即由高温到低温的缓慢变化，使蛋白质溶解度缓慢降低而达到过饱和，这就是有名的热盒子法。,二、蛋白质结晶和晶体生长,第一节 X 射线晶体结构分析,震动因素也是一个需要考虑的重耍问题。震动往往也会造成蛋白质溶液的局部扰动，加速晶核的形成，所以晶体生

33、长需要防震。一般要在水泥台上进行实验，同时不要因为性急而常常观察。在失重情况下进行蛋白质晶体的生长已有很多实验报道，没有地心引力会使蛋白质溶液更趋于均匀状态，减少晶核的形成，因此在外太空长晶体成功的例子不少。但是震动问题不易控制，因此失败的例子也不少，这也说明了防震的重要性。,二、蛋白质结晶和晶体生长,第一节 X 射线晶体结构分析,4 技术和方法X射线衍射晶体结构分析用的大晶体生长的技术和方法也在不断地发展之中，整个的趋势是微量化和自动化，这主要是基于原材料少、难于分离提纯的缘故，晶体生长实验由毫升数量级降到微升数量级再降到纳升数量级。,二、蛋白质结晶和晶体生长,第一节 X 射线晶体结构分析,

34、最简单的方法是分批静置法（batch method）。将蛋白质的过饱和溶液配好，根据体积大小分装在大小不同的试管中并密封，然后置于培养箱中控制各项物理因素(温度、防震）。晶体将从预先配置好的过饱和溶液中缓慢生长。用这种方法可以使溶液体积小到几微升，这种简单的方法虽然很有效，但用来摸索晶休生长的条件时有一个致命的弱点：很难改变晶体生长的化学条件。,二、蛋白质结晶和晶体生长,第一节 X 射线晶体结构分析,最常用的方法当属悬滴法。将溶液分成两部分，含有蛋白质的悬滴滴在盖玻片上，不含蛋白质但含有某种盐类的相同溶液放于贮液槽中。由于盐浓度不同，造成悬滴和贮液槽之间的水蒸气压力的不同，从而发生水蒸气的交换

35、，使悬滴中蛋白质浓度逐步变浓，从而达到蛋白质缓慢的过饱和。可想而知，这个过程是缓慢的，而且缓慢的程度还可以随盐浓度的改变而变化。贮液槽中的溶液在实验过程中可调，悬滴的量又可以很小，这些都是这个方法的优点，所以该方法是晶体生长的最常用方法。同时，因为它的上述优点，也使它非常适合于晶体生长的条件摸索实验。,二、蛋白质结晶和晶体生长,第一节 X 射线晶体结构分析,5 蛋白质晶体的鉴定在某些情况下，在蛋白质晶体生长过程中，会长出盐或某些沉淀剂的晶体，这需要小心加以鉴别，特别是在微晶状态下。晶体已达到一定线度就可以进行X 射线衍射实验，蛋白质分子量大、晶胞大，所以衍射点密集、分辨率低，而小分子正好相反，

36、并不难辨别。以下提到的一些方法对鉴别蛋白质微晶或许会有帮助。,二、蛋白质结晶和晶体生长,第一节 X 射线晶体结构分析,蛋白质晶体往往长得没有小分子晶体漂亮，边界常常不完整，很容易形成多晶。在低倍光学显微镜下使用针来触碰微晶，可以感到小分子晶体偏硬，容易碎成两半或几瓣；蛋白质晶体偏软，容易碎成粉。如果溶液变干，蛋白质晶体由于脱水而变坏；小分子晶体则不变化。用湿滤纸触碰，蛋白质粉末会很决溶解；而小分子晶体则溶解很慢。小分子晶体的偏光性强于蛋白质晶体，但使用偏光多用来鉴定晶体或其他非晶态物质，如玻璃碎片、玻璃壁上的小气泡、无定形沉淀等。还可以使用染料甲基蓝等鉴别，因为蛋白质晶体吸收染料的能力极强。蛋

37、白质晶体的密度与母液相当，小心轻放可使其晶体浮于母液表面，小分子晶体则下沉。,二、蛋白质结晶和晶体生长,第一节 X 射线晶体结构分析,首先要充分了解到，一套好的衍射数据是晶体结构分析的基础，衍射数据的好坏直接涉及结果的精度。一套好的衍射数据又与晶体的好坏、X 射线源的强度以及收集数据的仪器和方法有关。所以，层层把关是必要的。数据收集有几大环节，如晶体的收集、选择X射线源和选择数据收集仪器等。,三、衍射数据收集,第一节 X 射线晶体结构分析,1 晶体的收集和处理蛋白质晶体暴露于空气中将解体，这是因为蛋白质晶体中含水量相当高（2070%）。水分子和蛋白质中的解离基团或酰胺基团形成氢键，构成蛋白质结

38、构的一个组成部分，因而，失水的晶体会破坏蛋白质的结构。这也是为什么蛋白质晶体在收集数据前要首先密封于一种特殊的毛细管中的原因。这种毛细管专用于X 射线衍射实验，玻璃的材料是特选的，毛细管壁薄如纸，为的是尽量减少对X 射线的吸收。蛋白质晶体的收集有一整套手工操作的程序，需要经过一定的训练方可掌握。,三、衍射数据收集,第一节 X 射线晶体结构分析,现在使用低温冷冻晶体的方法来收集数据已成常规，蛋白质晶体决速冷冻于液氮中，蛋白质结构不受影响，在收集数据的过程中，使晶体处于液氮气体的冷却中，由于低温，蛋白质分子的热运动降低，从而提高了衍射分辨率。收集低温冷冻的晶体不使用毛细管而是使用特殊的小圆环，将晶

39、体连同母液用这个小圆环取出来，然后迅速置于液氮中冷冻。,三、衍射数据收集,第一节 X 射线晶体结构分析,2.X 射线源的选择无论是阳极靶式（包括封闭管式和旋转阳极靶式），还是同步加速器辐射X 射线辐射光源，都要求X 射线源的辐射流密度要尽量大，即单位面积的光强大。对同一晶体来说，只要蛋白质对辐射有一定的耐受力（否则在收数据的实验过程中需要更换晶体）,X 射线源的强度越高，晶体的衍射线强度也就越大，衍射线强度越大，数据误差就越小。,三、衍射数据收集,第一节 X 射线晶体结构分析,2.X 射线源的选择无论是哪种辐射源，还要求射线的发散度尽量小，这又是同步加速器辐射的一大特点。它的辐射功率集中于电子

40、轨道平面附近在沿电子前进方向两侧半张角的一毫弧内，这个范围内集中了辐射功率的85%，因此，它可以在几十米外得到高通量的光源。再加上特殊的弧形晶体镜面的垂直与水平聚焦，射线的准直性就更好了。阳极靶式X 光机没有这个优点。,三、衍射数据收集,第一节 X 射线晶体结构分析,3 衍射线记录装置及其使用方法按记录衍射线的方式可将收集数据的装置分为两大类，一类是使用对X 射线敏感的照相底片或图像板（image plate)；另一类是计数管或面探测器。按记录装置的运动方式分，又有外森堡相机、徘循相机、回摆相机、四圆衍射仪等之分。,三、衍射数据收集,第一节 X 射线晶体结构分析,3 衍射线记录装置及其使用方法

41、X 射线用底片是一个比较好的波松探头，是十几年前用于记录X 射线衍射的主要工具之一，近年来由于面探测器和图像板的使用，底片已经越来越少见。这是20 世纪80 年代以前主要用来收集蛋白质数据的方法。早期使用的外森堡相机和徘循相机是专门设计成使用X 射线底片的相机。这两种相机都要使用层线屏将外层衍射线挡住，只收取一层内的衍射数据，所以效率低。目前这两种相机可能已进入历史博物馆了。,三、衍射数据收集,第一节 X 射线晶体结构分析,使用计数管记录衍射线强度的装置主要是四圆衍射仪。计数管多为正比计数管或闪烁计数管，它将X 射线光子强度转换成电信号，信号放大后再转换成数字存入计算机随时调用。四圆中的3 个

42、圆是调节晶体方位的，另一个圆在水平平面上调节计数管方位。4 个圆配合，可在某一特定时刻将某一衍射方向调到与小计数管接收方向一致。因此，四圆衍射仪是采用逐点收集数据方式的全自动衍射数据收集仪器，它的优缺点正好和底片相反。,三、衍射数据收集,第一节 X 射线晶体结构分析,四圆衍射仪数据精确，数据重复误差只有2 左右，但因为是逐点收集，所以收集一套数据很费时，这对大晶胞晶体收集数据时间之长是难以忍受的。同时，晶体耐受辐射的时间有限，为了收集一套完整的数据就需要多次更换晶体，从而引入误差降低数据的精度。,三、衍射数据收集,第一节 X 射线晶体结构分析,面探测器是由金属丝构成的面板，同样可以将X 射线光

43、子强度转换成电信号，因为它呈面板状，所以构成了一组面探测器，可同时收集到多个衍射点，相当于一张底片，从而使它集计数管记录数据精确和底片同时收集多点的效率两者优点于一身，是不久前实验室内经常用于一般数据收集的仪器。无论四圆衍射仪还是多丝面探侧器都可以在程序带动下完成对一个未知晶体的空间群等初步晶体学参数的鉴定，并随后收集到它的全部衍射强度数据，是自动化很高的数据收集仪。,三、衍射数据收集,第一节 X 射线晶体结构分析,近几年开发出的图像板又是在面探测器基础上的一个改进，增加了底片那种非常高的距离分辨的优点，它是集底片和面探测器两者优点于一身的理想的收集数据的方法，目前已被广泛地应用于X 射线晶体

44、结构分析中。记录装置的运动方式中最重要的一种方式为回摆法。回摆相机（使用底片）、面探测器和图像板等都是使用这种运动方式来收集数据的。回摆法又称无层线屏周转法，其特点是同时收集衍射空间的三维数据。,三、衍射数据收集,第一节 X 射线晶体结构分析,为了不使衍射斑点重叠，必须使晶体每次仅回摆一个很小范围，通常是13角，依晶胞大小而定。为了给衍射方向指标化，使用了部分反射点的信息，即一个衍射斑点被分成两半，分别落在相邻的两个图像的相应位置上。利用部分反射点的信息可以计算出晶体方位与机械坐标之间的偏离（misorientation)，从而可以进一步根据晶胞参数算出衍射线的排布，进而对衍射斑点进行扫描并记

45、录它的强度。回摆运动实际上是晶体在测角头上进行旋转的运动，探测器面板垂于入射线在晶体的后方，与晶体的距离可调。,三、衍射数据收集,第一节 X 射线晶体结构分析,4 衍射数据收集的全自动化考虑尽管像图像板、衍射仪这样的收集数据的装置自动化程度已经相当高，但为了满足结构基因组学研究的要求，衍射数据收集的全自动化装置还有进一步考虑的必要。,三、衍射数据收集,第一节 X 射线晶体结构分析,4 衍射数据收集的全自动化考虑用于结构基因组学研究的晶体量很大，它们无一例外地要送到同步加速器辐射实验室去。晶体的收集、贮存、标识和运输就是一个大问题。晶体到达同步辐射实验室，又需要将晶体安装到测角头上并调试到衍射仪

46、上。最后还要对晶体衍射质量加以分析，考虑数据收集方法等。这些步骤目前仍处于手工劳动阶段，大大影响了实验进度，完全不符合批量生产结构的要求。幸运的是，已经有些实验室在摸索这方面的全自动化问题。,三、衍射数据收集,第一节 X 射线晶体结构分析,X 射线晶体结构分析的核心问题是位相问题。位相不能直接由实验技术探测到，因而只能通过一些间接的方法推导出来。最基本的方法，也是用于一个未知结构的最有效方法是同晶置换法。在已知结构的基础上，解决不同种属不同来源的突变蛋白或它的复合物结构还可以使用分子置换法和差值电子密度法。由于同步加速器辐射光源的改进，目前多波长的反常散射法（MAD）已趋成熟，大有取代同晶置换

47、法的可能，使解决位相问题大大简化，这对结构基因组学的研究至关重要。,四、确定位相,第一节 X 射线晶体结构分析,晶胞的大小和形状（包括对称性）决定了晶体的衍射方向；反过来，通过衍射点的位置可以推算出晶胞参数和空间群，这叫做初步晶体学参数的测定。但晶胞中的原子种类以及它在晶胞中的分布位置决定了衍射线强度；反过来，通过衍射线强度和一些方法，可以了解位相信息，从而通过富里衰加和获得电子密度函数，从而获得原子在晶胞中的分布位置，这就是晶体结构测定的目的和结果。在收集数据后，还需对多套数据进行统一、还原才可正式用于结构分析。,四、确定位相,第一节 X 射线晶体结构分析,1 数据的统一和还原为了解出一个晶

48、体结构，往往需要使用许多晶体收集到该蛋白质的多套数据，其中包括母体数据以及一个以上的重原子衍生物的数据。这些数据的强度需要校正极化因子和劳伦兹因子（LP 校正）、校正吸收因子、校正温度因子，最后再将所有数据统一在一个水平上，才可进行下一步的运算。,四、确定位相,第一节 X 射线晶体结构分析,2 同晶置换法 同晶置换法是由Peruz于20 世纪50 年代发现的可以用于解决位相信息的方法。当蛋白质晶体中引进了适当的重原子后，就造成该晶体衍射线强度的差别，从衍射强度的差别就有可能推出位相信息。下面按顺序介绍重原子衍生物的制备、帕特逊分析、同晶置换法的基本原理。,四、确定位相,第一节 X 射线晶体结构

49、分析,(l）制备重原子衍生物 使用同晶置换法测定蛋白质结构，原则上需要制备一个以上的同晶重原子衍全物，同晶重原子衍生物越多，越有可能消除位相双解和实验误差。如果重原子有较强的反常散射，一个重原子衍生物加上反常散射信息也可解决位相的双解问题。最近发展起来的多波长反常散射（MAD）法解晶体结构，应该看做是同晶置换法的特例。,四、确定位相,第一节 X 射线晶体结构分析,所谓重原子衍生物是指在蛋白质晶体中通过某种方式引入原子序数远大于碳、氮、氧的重原子而构成的晶体。视蛋白质分子量的大小，周期表中原子序数高于碘的元素及其化合物在引入晶体后都有可能提供位相信息。这些重原子对X 射线的散射强，有可能改变由碳

50、、氮、氧组成的蛋白质晶体的X 射线衍射斑点的强度。,四、确定位相,第一节 X 射线晶体结构分析,根据衍射强度的变化，首先可以借助于帕特逊分析算出重原子的位置，从而获得重原子的结构振幅和位相的信息，因为根据实验可以直接测得重原子衍生物和母体的结构振幅（从强度），所以可以建立矢量三角形（圆）来推出母体的位相。所引进的重原子必须对晶体没有大的破坏，即不改变原来晶体中蛋白质分子的结构和周期排列。与此同时，重原子必须在晶胞中占有一个或几个固定的位置，而且和蛋白质分子有相同的周期排列。这种不改变蛋白质周期排布而又在固定位置引入重原子的方法就叫做“同晶置换”，这种晶体又称为同晶置换重原子衍生物。,四、确定位