《重组DNA技术》课件.ppt

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1、第二十章,重组DNA技术,recombinant DNA technique,第一节 重组DNA技术的基本过程Basic Process of Recombinant DNA Technology,*,2,一、重组DNA技术相关概念,重组DNA技术（Recombinant DNA Technology）：,是在体外将不同来源的特异基因或 DNA片段插入载体分子，构建成重组 DNA分子；并将它导入到合适的受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，筛选出含有目的基因的转化子细胞；再进行扩增、获取大量同一DNA分子。,*,3,亦称DNA克隆(DNA cloning)，或基因克隆(gene cloning)。

2、,克隆化(cloning)：获取这类同一的DNA分子群体、细胞群体或个体群体的过程，即无性繁殖。,重组DNA(recombinant DNA,)：又称嵌合DNA（chimera DNA），采用克隆技术把来自不同生物的外源 DNA插入载体分子所形成的杂合DNA分子。,*,4,克隆(clone)：指从同一始祖经无性繁殖传代而来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体；,分,分离目的基因并进行必要的改造,切,限制酶切目的基因与载体,接,拼接目的基因与载体成重组载体,转,将重组载体转导入受体细胞,筛,筛选出含重组DNA的细胞等,二、DNA重组技术基本程序,*,5,思考题 1,重组DNA技术的基本过程（

3、1）,*,6,重组DNA技术的基本过程（2）,*,7,思考题 1,*,8,Common Enzymes Used in RecombinantDNA Technology,第二节重组DNA技术中常用工具酶,一、限制性核酸内切酶（restricton Endonuclease）,是一类能识别双链DNA中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶，又称为限制酶（restriction enzyme）。主要是从原核生物中分离纯化而来。,基因工程的手术刀-“切”,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,*,9,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；第

4、二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。,（一）限制酶的命名：,一、限制性核酸内切酶,*,10,和型限制酶通常是相对分子量较大的多亚基蛋白质复合物，同时具有内切酶和甲基化酶活性，反应过程中需有Mg2+和ATP参与。,、和型（基因工程技术中常用型）。,（二）限制酶的分类：,型限制酶通常以同源二聚体形式存在，只具有核酸内切酶活性而无甲基化酶活性，反应过程中只需有Mg2+参与而不需有ATP参与。,*,11,类酶识别序具有回文结构(palindrome)特点，即具有双重旋转对称结构的DNA反向重复双链序列。,（三）型限制酶的作用特点：,1.基本特性：大

5、部分型限制酶都能识别由48个核苷酸组成的特定序列。,*,12,思考题 2,*,13,图20-3 限制酶EcoR对双链DNA分子的切割作用,Bam H,Hind,平或钝末端（blunt end),粘性末端（sticky end),切口：平端切口、粘端切口,*,14,+,Bam H,+,Bst,2.同裂酶 来源不同但能识别相同序列，切割 DNA后产生相同的黏性末端的限制酶，又称同功异源酶。,*,15,Bam H,Bg l,+,+,3.同尾酶 识别序列不完全相同，但切割 DNA后，产生相同的黏性末端的限制酶称为同尾酶。这两个相同的黏性末端称为配伍未端(compatible end)。,*,16,4.

6、可变酶 识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过6个核苷酸。为型限制酶的特例。,如：Bstp GGTNACC CCANTGG,*,17,如：Bbl CGGN(N)4CCG;GCC(N)4NGGC,（四）限制酶的应用及影响因素,1.限制酶的应用 重组DNA技术、基因组DNA物理图谱绘制、基因组DNA同源性研究、切割基因组DNA或cDNA构建基因组文库或cDNA文库等。,2.影响限制酶作用的因素 DNA纯度、结构及甲基度程度；酶切反应的温度、时间及缓冲液体系等。,*,18,只能封闭DNA链上的缺口（nick）,而不能封闭裂口（gap）。,是一种能够催化在两条DNA链之间形成磷

7、酸二酯键的酶。,二、DNA连接酶(DNA ligase),基因工程的缝纫针-“接”,需要在一条DNA链的3末端具有游离的羟基、另一条DNA链的5末端有磷酸基团，而且反应过程需要由ATP提供能量。,*,19,1.T4 DNA连接酶,连接的底物可以是两个双链DNA分子的互补黏性末端或平末端。最早是从T4噬菌体感染的大肠埃希菌分离，易制备，应用广。,（一）DNA连接酶的类型：,2.大肠埃希菌DNA连接酶,只能连接具有互补黏性末端的两个双链DNA分子底物。需要NAD+作为辅助因子。,*,20,连接黏性末端作用模式图：,*,21,连接平末端作用模式图：,*,22,1.DNA连接酶应用,（二）DNA连接酶

8、的应用及影响因素：,催化两个具有黏性末端或平末端的DNA片段形成磷酸二酯键，形成新的重组DNA分子；接合由复制叉上不连续复制链上产生的缺口；缝合DNA损伤修复、遗传重组及DNA链剪接中缺口。,*,23,2.影响DNA连接酶作用的因素,对黏性末端的连接效率远高于对平末端的连接；,*,24,连接黏性末端的温度一般在415；,连接酶的用量，平末端连接用量高；,ATP浓度一般为0.011 mmol/L;,载体分子与插入片段的摩尔数比为1:101:3。,三、DNA聚合酶,能够催化以DNA或RNA为模板合成DNA的反应，把脱氧核糖核苷酸连续地添加到双链DNA分子或引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用

9、。,（一）大肠埃希菌DNA聚合酶,（二）Klenow片段,具有53聚合酶，53 及35核酸外切酶活性。,具有53聚合酶，35核酸外切酶活性。,*,25,（三）Taq DNA聚合酶,（四）反转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶。,具有53聚合酶，53 核酸外切酶活性，对Mg2+浓度非常敏感。,是第一个被发现的、耐热的、依赖DNA的DNA聚合酶，最佳反应温度为7075。,普遍使用的是来源于AMV(鸟类成髓细胞白血病病毒)及M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒)的反转录酶，具有53聚合酶。,*,26,（一）末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase）,四、

10、其它修饰酶,是一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3-OH末端上。,(1)底物是单链DNA或有3突出末端的双链 DNA。,*,27,(2)底物是3平端或3凹端的双链DNA。,用途：,（1）主要作用是在载体或目的基因 3末端加上同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于DNA重组。,（2）DNA 3末端的同位素标记。,*,28,（二）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）,能特异地切除DNA、RNA和dNTP上5-磷酸基团。,（三）多核苷酸激酶（polynuleotide kinase）,又称T4多核苷酸激酶，能催化ATP的-磷酸基团转移到DNA或

11、RNA片段的5-OH末端。,*,29,重组DNA技术中常用的工具酶,第三节重组DNA技术中常用载体 Common Vectors in Recombinant DNA Technology,*,31,载体（vector）的概念,克隆载体(cloning vector),表达载体(expression vector),可使插入的外源DNA片段被转录、翻译成多肽链的载体。,是在克隆载体的基础上，增添了与宿主细胞相适应的强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。,含有复制起始点oriC，可使插入的外源DNA序列被扩增或保存的载体。,指能携带外源DNA分子进入受体细胞进行扩增和表达的运载工具

12、。应具备的基本条件：,*,32,含有复制起始点，具有自主复制的能力；,具有较高的遗传稳定性。,拷贝数较多，易于与受体细胞的染色体DNA分开；,分子质量相对较小，以容纳较大的外源DNA；,具有一个以上的选择性遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定；,具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；,载体应具备的基本条件：,*,33,重组DNA技术中常用载体：,一、质粒载体：最常用的目的基因克隆载体,粘粒载体：用于克隆大片段DNA(自习),M13噬菌体载体：用于Sanger双脱氧DNA测序(自习),二、噬菌体载体：构建基因组DNA或cDNA文库(自习),四、病毒载体：包括人或哺乳动物病毒、昆虫及植物病 毒用于在真

13、核细胞中表达目的蛋白(自习),三、人工染色体载体：用于更大DNA片段的克隆(自习),*,34,一、质粒(plasmid)载体,质粒存在于细菌染色质以外，具有自我复制能力的双链环状DNA。小的约23kb,大的数百kb。,严紧型质粒（stringent plaxmid）,松弛型质粒（relaxed plaxmid）,Ampr,ORI,Tetr,（一）pBR322质粒：一种克隆质粒,ORI：,Ampr,Tetr：,两个抗性基因，用于筛选阳性克隆。,Pst I,BamH I：,两个酶切位点，用于插入目的基因,复制起始点，保证高拷贝自我复制。,*,36,目的基因与 pBR322经BamH I酶切后重组如

14、何筛选得到阳性克隆？,克隆3,5,7,9,10 是阳性克隆,*,37,阳性克隆,*,38,Amp,Tet,DNA连接酶,重组质粒,目的基因,Ampr,Tetr,Pst I,目的基因与 pBR322经Pst I酶切后进行重组如何筛选得到阳性克隆？,课堂讨论,*,39,用Pst I酶切,（二）pUC质粒载体系列,Ori,分子量更小,拷贝数更高,*,40,pUC质粒载体插入了半乳糖苷酶N端肽片段的编码基因lac Z；产物肽也无活性，也不能分解培养基中的X-gal。,蓝白斑筛选,DH5a宿主菌染色体插入了半乳糖苷酶C端的肽片段的编码基因lacM15；产物肽无活性；不能分解培养基中的X-gal。,有活性

15、的半乳糖苷酶由肽和肽互补(互补)而成，可使培养基中的X-gal分解形成蓝色化合物而出现蓝色菌落。,*,41,*,42,-半乳糖苷酶（+）,白色,蓝白斑筛选：,蓝色菌落：阴性克隆;白色菌落：阳性克隆,*,43,蓝白斑筛选,思考题 3,（三）其它质粒载体,1.能在体外转录克隆基因的质粒载体,由pUC系列质粒载体派生而来，带有来自噬菌体T7、SP6的启动子，为RNA聚合酶的附着提供了特异性识别位点。如pGEM-3Z/4Z.,2.穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）,是一类人工构建的，具有两种不同复制起始点和选择标记，可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。,*,44,（

16、四）TA克隆载体,许多耐热的DNA聚合酶(如Taq、Tth等)扩增时，都在PCR产物3-末端加上了A碱基。,是专为克隆PCR产物而设计的，在其MCS两侧的3-末端携带有未配对的T碱基的载体。,*,45,在连接酶的作用下可直接将PCR产物克隆到TA载体中。,二、噬菌体载体（自习）,噬菌体(bacteriophage,phage),是一类细菌病毒，可用于克隆和扩增特定的DNA片段，是广泛使用的基因克隆载体。,野生噬菌体的基因组为线状双链 DNA，两端为12bp彼此完全互补，称之为 cos位点的5-单链突出黏性末端；进入宿主细胞后形成坏状双链结构，按方式及滚环方式进行复制。,感染细菌后，可进入溶菌生

17、命周期及溶源生命周期。,*,46,gt10/11系列(插入型，适用于cDNA克隆),EMBL3/4系列(置换型，适用于基因组DNA文库构建),可容纳7 kb以下的外源片段。gt10和gt11分别在阻遏剂CI基因和lacZ基因上，有供外源基因片段插入的单一内切酶位点。,可容纳923kb的外源片段。具有两个或两组内切酶位点，经酶切除去基因组中噬菌体正常生长非必需的序列，由外源基因片段取代。,（一）噬菌体载体,可插入的外源 DNA片段大，感染效率远高于质粒载体的转化效率。,*,47,EMBL3/4系列(置换型，适用于基因组DNA文库构建),gt10/11系列(插入型，适用于cDNA克隆),黏粒载体结

18、构特点：,分子小，可插入45 kb的外源DNA片段；,含质粒自主复制成分ORI，和耐药基因Ampr；,含带有一个或多个单一酶切位点的多聚物接头；,含噬菌体cos黏性末端及与包装有关的短序列；,（二）黏粒载体,粘粒又称柯斯质粒(cos site-carrying plasmid,cosmid),是由噬菌体的cos黏性末端和细菌的质粒构建而成。,接上在真核细胞生活的元件，如SV40复制区及启 动子，可作为穿梭载体。,*,50,*,51,（三）M13噬菌体载体,M13噬菌体基因组为闭环单链DNA，感染雄性大肠埃希菌后，在菌体内复制成相当于质粒的复制型（RF）M13双链DNA，可用作基因克隆载体。,M

19、13mp系列(携带有 含MCS序列的lacZ基因),外源DNA不宜大于1500 bp。,pBluescript KS（+/-）是一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体。,当RF型M13在细菌内达到100200个拷贝后，M13只合成单链DNA，并包装成噬菌体颗粒分泌到细胞外。可用于DNA测序、体外定点突变和核酸杂交。,*,52,pBluescript SK（+/-）噬菌粒载体的分子结构示意图。SK表示多克隆位点区的一种取向，即lacZ基因是按照SacIKpnI的方向转录；（+/-）表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的取向。,三、人工染色体载体（自习）,酵母人工染色体载体，简称YAC载体，由酵母染

20、色体、酵母2mDNA质粒的复制起始序列等元件衍生而成；可插入100kb2,000kb外源DNA片段，是人类基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体。,细菌人工染色体载体，简称BAC载体，以细菌F因子为基础构建而成；可插入100kb300kb外源DNA片段，是人类基因组计划中序列分析采用的主要载体。,*,54,YAC结构图及基因克隆过程,*,55,常用于构建载体的RNA病毒（整合型）：,逆转录病毒(retrovirus,RV)慢病毒(lentivirus):也属于RV家族,常用于构建载体的DNA病毒（游离型）：,腺病毒(adenovirus,Ad)腺相关病毒(adeno-associated vi

21、rus,AAV)单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus,EBV)痘苗病毒(vaccinia virus),四、病毒载体（自习）,*,56,第四节目的基因的获得和体外重组Target DNA Acquirement and Recombinant In Vitro,*,57,一、目的基因的获取分,（一）化学合成法 要求已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。,（二）PCR或RT-PCR 要求已知目的基因的全序列或基因片段两侧的DNA序列。,（三）从基因组文库中筛选 DNA文库(genomic DNA librar

22、y)cDNA文库(cDNA library),*,58,思考题 4,（一）化学合成法,*已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。,*,59,*避免使用稀缺密码子，及宿主细胞的密码偏好。,反转录,AAnA,TTnT 5,5,mRNA,反转录酶,mRNA,cDNA,3,TTnT,AAnA,核糖核酸酶H,TTnT,3,DNA poly I,cDNA,核酸酶S1,双链cDNA,3,5,3,5,5,加热变性,加入特异性引物,DNA聚合酶,重复上述步骤,扩增出大量的产物,聚合酶链式反应,退火,延伸,（二）PCR或RTPCR,组织或细胞染色体DNA,基因片段,克隆载体,重组DNA分子,含重组DNA分子的转化菌,

23、限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有gDNA的集合。,1.gDNA文库构建,（三）从基因文库中筛选,*,61,EMBL3/4系列噬菌体载体(置换型，适用于基因组DNA文库构建),EMBL3/4系列(置换型，适用于基因组DNA文库构建),*,62,mRNA,cDNA,双链cDNA,重组cDNA分子,反转录酶,载体,受体菌,复制,2.cDNA文库的构建,cDNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有cDNA的集合。,*,63,含重组cDNA分子的转化菌,gt10/11系列噬菌体载体(插入型，适用于cDNA文库构建),gt10/11系列(插入型，适用于cD

24、NA克隆),*,64,gDNA文库：g-文库,cDNA文库：c-文库,方法：,用目的基因上的一段DNA做成探针与文库中的DNA作核酸杂交，从基因文库中“钓出”有目的基因的克隆。,3.从基因文库中筛选目的基因,*,65,Screening a genomic library by colony hybridization.,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶，15C,二、目的基因的体外重组接,（一）黏性末端连接,1.同一限制酶切位点连,Eco R切割位点,Bg l切割位点,2.不同限制酶切位点连,*,68,（二）平末端连接,*,69,Eco R,由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性

25、末端，而进行粘端连接。,(三）人工接头(linker)连接,*,70,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,-核酸外切酶,-核酸外切酶,末端转移酶+dATP,末端转移酶+dTTP,（四）同聚物加尾连接,*,71,PCR扩增,+,连接,转化,蓝白筛选,Taq酶,(五）T-A克隆,*,72,*,73,Inporting,Screening and Verification of Recombinant DNA,第五节重组DNA分子的导入和筛选与鉴定,一、重组DNA分子的导入 转,宿主细胞应具备的特征：,处于感受态,对载体无严格限制,限制酶和重组酶缺陷,不对外源DNA进行修饰,能表达重组体

26、所提供表型特征,将体外构建的重组DNA分子导入用于复制、扩增和表达的原核或真核受体细胞。,*,74,（一）转化(transformation)指将质粒DNA或以质粒为载体构建的重组DNA导入细菌（原核细胞）的过程。如大肠杆菌K12突变株低渗CaCl2,0处理进入感受态。,（二）转染(transfection)指将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的重组DNA 分子导入真核细胞的过程。,（三）感染(infection)指以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重组DNA，经体外包装成具有感染性的噬菌体或病毒颗粒后，通过感染宿主细胞而借助外壳蛋白将重组DNA注入到细菌或真核细胞内复制扩增的过程。,*,75

27、,1.磷酸钙介导的转染2.DEAE-葡聚糖介导的转染3.电穿孔转染4.脂质体转染5.显微注射,（二）转染(transfection),*,76,思考题 5,非转化子(不能生长）,1.根据载体的耐药性标记（初步）筛选,（一）根据重组载体的遗传表型进行筛选,二、重组DNA分子的筛选与鉴定 筛,*,77,2.根据载体的耐药性标记插入失活选择,例：载体中的Tetr基因被目的基因插入而失去活性，不能表达抗Tet蛋白，故细菌不能在含Tet的培养基中存活。,*,78,A typical bacterial transformation experiment.,互补的检测,3.根据-半乳糖苷酶显色反应筛选,标

28、志补救,4.根据筛选插入的外源基因的性状进行筛选,*,81,-核酸外切酶,(二)限制性内切酶酶切电泳鉴定,(四)PCR,(三)核酸分子杂交法,是从基因文库中挑选含有目的基因的阳性克隆的常用方法。,根据MCS两侧的保守序列设计引物，对提取的重组载体进行PCR扩增鉴定，并可直接进行测序。,*,82,(五)免疫化学检测法,利用特异性抗体与目的基因表达的蛋白质相互结合通过放射免疫、化学发光来筛选转化菌。,用插入点的限制酶酶切重组DNA，行琼脂糖凝胶电泳，根据是不有目的基因和载体的泳带来判断重组成功与否。,重组DNA技术操作的主要步骤,载体,目的基因（外源基因）,*,83,*,84,Exogenous

29、Gene Expression,第六节外源基因的表达,表达体系的建立包括：,外源基因表达涉及目的基因的克隆、扩增，转录、翻译，蛋白质产物的加工修饰，以及分离、纯化等过程，需要在适合的表达系统中完成。,表达系统可根据受体细胞的不同分为原核表达系统和真核表达系统。,*,85,思考题 6,表达载体的构建；受体细胞的建立；表达产物的分离、纯化等技术和策略。,重组DNA医药产品,一、外源基因在原核系统中的表达,-大肠杆菌（E.coli）表达体系最常用,优点:,*,87,（一）优缺点,培养简单、迅速、经济而又适合大规模生产。,只适于表达克隆的cDNA，不适于真核基因组DNA；,真核蛋白常不能形成正确的折叠

30、和修饰；,真核蛋白常以无生物活性的包含体形式存在；,难以实现大量分泌性蛋白的表达；,真核蛋白不稳定，易被细菌蛋白酶降解；,原核细胞周质中常含有种类繁多的内毒素。,缺点:,（二）对外源目的基因的要求,外源真核基因不能带有5端非编码区和内含子结 构，必须用cDNA或化学合成基因；,外源基因必须置于原核细胞的强启动子和SD序列 等元件控制下；,重组载体必须形成正确的开放阅读框架；,外源基因转录生成的mRNA必须相对稳定并能被有 效翻译，所表达的蛋白质产物稳定且对宿主菌不 能有毒害作用。,*,88,（三）对原核表达载体的要求,具有强启动子及其两侧的调控序列，能调控基 因的转录，产生大量mRNA；,含有

31、SD序列，而且SD序列与起始密码子AUG之间 的距离要有合适,带有转录终止序列：如在下游加入不依赖因 子的转录终止区,含多接头克隆位点PCS，以利于外源基因插入。,*,89,（四）外源基因在原核细胞中的表达方式,融合型表达蛋白：将外源目的基因与另一基因拼 接成融合基因，表达融合蛋白(fusion protein)。,非融合型表达:外源目的基因不与其他基因融合，直接从起始密码AUG开始在原核调控元件控制下 表达蛋白质。,分泌型表达：将外源目的基因与信号肽编码序列 拼接成融合基因的表达方式。,*包含体(inclusion body)：高效表达时蛋白质致密地集聚在细胞内形成的一种水不溶性结构。,*,

32、90,二、外源基因在真核细胞中的表达,真核表达系统是指在真核细胞中表达外源基因的体系。,*,91,主要有酵母表达系统、哺乳动物系统、昆虫细胞（杆状病毒）和高等植物系统。,（一）真核表达系统的优缺点,优点：,可表达克隆的cDNA或真核基因组DNA；,可进行糖基化、磷酸化、乙酰化等修饰，使表达蛋白形成正确的天然构象；,某些真核细胞可将外源基因表达产物直接 分泌至细胞培养基中。,缺点：,操作技术难、费时、费钱。,*,92,含有原核克隆载体的复制子、抗性筛选基因和 MCS等序列；,含有真核细胞的启动子、增强子、剪接信号、转录终止信号和PolyA化信号及遗传选择标记 等组件。,*,93,（三）外源基因导

33、入和转染细胞的筛选,1.导入真核细胞的方法 病毒感染（天然方法）载体转染（化学或物理方法）,2.常用的筛选方法有 新霉素抗性选择系统 胸苷激酶基因HAT选择系统 二氢叶酸还原酶基因选择系统,*,94,（四）外源基因在真核细胞中的表达,瞬时表达（不与宿主染色体整合）常用的瞬时表达宿主是来源于非洲绿猴肾CV-1细胞的COS细胞。,稳定表达（整合至宿主染色体中）常用的稳定表达宿主细胞是来源于中国仓鼠卵巢的CHO细胞。,*,95,*,96,第七节重组DNA技术的应用,Application of recombinant DNA technique,自习,重组DNA技术的主要应用,(1)克隆目的基因，研

34、究疾病相关基因的结构与功能，表达具有生物学活性的蛋白质；,(2)利用定点突变技术，研究蛋白质的结构与功能，或对蛋白质进行结构改造；,(4)开发基因工程药物与疫苗用于疾病治疗；,(3)利用转基因技术和基因剔除技术研究基因功能，建立转基因动物模型；,(5)建立基因诊断、鉴定与基因治疗的新方法。,学习要求,1.掌握重组 DNA 技术的相关概念、基本原理和主要步骤。(ppt3),5.熟悉重组体导入受体细胞及筛选方法。(ppt74),2.掌握限制性内切酶概念及作用特点。(ppt9),3.熟悉常用载体及特点。(ppt35),4.熟悉目的基因获取及与载体连接的方法。(ppt57),6.了解基因克隆表达技术，原核、真核表达系统的优缺点。(ppt86),