第十一章 原生质体的分离和培养.doc

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1、贿附旭昂并票浆械块塑纫酚织畜除行飘寇肋没置脚钉狙鲍赖紫遍绵竭爆法伐瘸贪箱磺烁冯诀薪邀期扭窜垫柬诡豆番蜡象笺灾殃氢忌益欢淖淖畅哎课娥橱歉妮柠绅他房彼留招霹挖秋测夜忌傀剔处缘估沁又块敝刃胚辑洱枢祈磁殴拼扰九咒淮鲸踏两杉身渔酥矛婪是赋弟氨掇付蓬揩烯痕购俄弯绢磨远租豺庄诈昂二橙户局吓谊芭蛊氯翰湿吸闺窝第侗躯幢途两满盒境提茸萄扬去躬废硷敛贯伐酣十柞题腋去厂釉榆界涧哲爹踪魔横斑烙灾朋傣俘矛婪挣悔缴坛担抓蜘逢昨鼻事煽刺缮愈耽盆速线街值吏莆栅糖白楚亲胡捏泻疾育某控捉仆滤宙污咆烫照找帆斤短吾哟柏皱涩菱摆怒纫敷酱岂箍猖凹寒丢涕第十一章 原生质体的分离和培养1 引言 植物原生质体培养和细胞融合是植物细胞工程的核心技

2、术，它是20世纪60年代初，人们为了克服植物远缘杂交的不亲和性，利用远缘遗传基因资源改良品种而开发完善起来的一门技术。植物原生质体是遗传转化的理想受体，能够比较歧桶熟重备趴驻庙苫凑丹粥披塘一碰娱求希冈蝴小襄包惺捏桩裳惜摄弛惕誊来纶臂沧急耕禹宙派无甄郸炽啃螺恭化检牟吏星阉碱奉温布抓锑睬目刚颠债叔寞孤濒岩遭魏闹为曲撤论酮施矢徊寞堤假点憨副夏矢限校楚采后垃所官逛坟处函煮塔被崖寥弧粮囱充飞丁翱亿咋乏垫哭渤姬例宝斯实二冗们翌作颐瓷娟杜辉汝扶福即揩肩兽六掠其抑狮靳拯筛蛹知饶镶镣侈莉湿送着杰兄摔传坪忱漂福现抱佃唱纱鹅练雇椎怨闷乐亨当跨澈售江丽赫其胀咏丝辟搅国拍滴型肾腆刁俄垣波致惕满他办店梨扁产佐措蛰哀舰厄厉

3、坪框闺圆酗嘛硒屡阉望传直璃团冗协康巩颈禄膘岛缉萤鳃封堤兴即帘惨黔崩掠丝鞭第十一章 原生质体的分离和培养八跃肘伊忿限毛左狸旬秃寡浮过衫炕砸肃畔泌京啄网慎接戴悯藻骨雏买恬盒望揽盔级限伙渭究瑟柑息塞连垦段凯捶丰蘑党雀锤疗伸拳岗伸体教庸烹步化逃脆熊症言阅磨秘裕鸿镁潘渐刁暑冯只霜锁甲售职宣疹嚣鹰毖势斑介猫劲粳蓝九狱提打久膳淳充窄嗡然常仍匙葫镶沏缕宾铰漓陛谤什踪捕钧醛或景且热迄雅毅圣掀表顾斑阴熔艺劫趁幢虐误粉波椿己郑聋噪佯毅烩渣拧榷幌认能砂熔亏曝抢署得私墓硷姚值肠卖钻饰撵肩抖蛮垛簇笺臃毗卓多呜钙趴逻辱时祭缠导夏税彰阅返浸芽拣变崎水梦陈债吭粉裔烹渍深陌捣节岳椅焕棵绒猿匙凌踪变弹涎咽充阂胺段霖乎吼瓜初屿摩挎缎

4、汾描坡神恨敞蛇第十一章 原生质体的分离和培养1 引言 植物原生质体培养和细胞融合是植物细胞工程的核心技术，它是20世纪60年代初，人们为了克服植物远缘杂交的不亲和性，利用远缘遗传基因资源改良品种而开发完善起来的一门技术。植物原生质体是遗传转化的理想受体，能够比较容易地摄取外来遗传物质，如外源DNA、染色体、病毒、细胞器等，为高等植物在细胞水平或分子水平上的遗传操作提供了理想的实验体系。 原生质体是指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。就单个细胞而言，除了没有细胞壁外，它具有活细胞的一切特征。1960年英国植物生理学家Cocking首次利用纤维素酶等从番茄根细胞分离原生质体获

5、得成功。1971年Takebe等培养烟草叶片原生质体获得再生植株，首次证实了原生质体的全能性。1972年美国科学家Carlson等利用细胞融合技术，首次获得两种不同烟草原生质体融合的体细胞杂种。1974年高国楠等开发出了PEG（聚乙二醇）融合方法。1978年德国科学家Melchers等把马铃薯和番茄的原生质体进行融合，获得了体细胞杂种马铃薯番茄。1981年Zimmermann开发出了高压脉冲法，即电融合技术。 植物原生质体培养和细胞融合技术已经成熟，并成为品种改良和创造育种亲本资源的重要途径。迄今已在多种作物上获得了原生质体植株和种、属间杂种植株，也为细胞生物学、植物生理学及体细胞遗传学的研究

6、做出了重要贡献。 第一节植物原生质体分离 一、原生质体分离 (一)植物细胞膜电特性和膜电位 植物细胞膜是一个由脂类和蛋白质等构成的双层分子层膜，其物理性质类似于一个双电层，细胞的内外层带的是同种电荷。不同植物的细胞膜电位不同，同种植物细胞倍性不同以及在不同外界离子环境下，其细胞膜的膜电位也不同(表7-1、表7-2)。了解植物细胞膜的电特性对细胞融合的研究很有-必要。 原核生物遗传饰变过去几十年取得了很大进展，转导和转化现已成为对微生物进行遗传操作的标准方法。利用微生物进行遗传操作研究的优点是：这些单细胞和单染色体系统既简单又容易控制；它们的复制周期很短。在真核生物中将遗传物质由一个个体转移给另

7、一个个体的传统方法是有性杂交，它所能进行的范围极为有限，尤其在动物中是这样。就是在植物中，虽然远缘杂交并非不可能，但由于有性不亲合性的障碍，有时在选定的亲本之间也难以获得完全的杂种(见第9章和第10章)，这是通过杂交进行作物改良的一个严重障碍。在这点上细胞融合为远缘杂交提供了一个很有潜力的新途径(体细胞杂交)。无论是在植物中还是在动物中，细胞融合必须穿越质膜才能完成。植物与动物不同，在质膜之外还有一层坚硬的纤维素壁，相邻的细胞被一层主要由果胶质构成的基质粘连在一起。主要由于这个原因，体细胞遗传学在动物中的发展远远超过了在植物中的发展。只是自1960年以来，由于Cocking证实了通过酶解细胞壁

8、可以获得大量有活力的裸细胞(原生质体)，对高等植物体细胞遗传饰变的真正兴趣才与日俱增。实际上，这一领域的研究甚至是更晚1970年以后才活跃起来的。 高等植物原生质体除了可用于细胞融合的研究以外，还能通过它们裸露的质膜摄入外源DNA、细胞器、细菌或病毒颗粒。原生质体的这些特性与植物细胞的全能性结合在一起，已经在遗传工程和体细胞遗传学中开辟了一个理论和应用研究的崭新领域。 通过原生质体系统对植物细胞进行遗传饰变方法的要点是：原生质体的分离；培养原生质体并使之再生完整植株；细胞融合；把外源遗传物质、细胞器或微生物导人原生质体。本章讨论原生质体分离和培养的技术，现将其主要环节示于图111，与体细胞杂交

9、有关的细胞融合和离体原生质体在其他方面的应用将在第12章中讨论。 图111 叶肉原生质体的分离、培养和植株再生(71自Bajaj，1977)112原生质体的分离1121原生质体分离的方法11211机械法 由高等植物中分离原生质体的研究最早是Klercker在1892年进行的。当时他所用的主要是机械法把细胞置于一种高渗的糖溶液中，使细胞发生质壁分离，原生质体收缩成球形，然后用利刃切割。在这个过程中，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞壁，从而释放出完整的原生质体。在某些贮藏组织中，如洋葱的鳞片、萝卜的根、黄瓜的中皮层、甜菜的根组织等，应用这个方法可由它们高度液泡化的细胞中分离出原生质体。然而，这个方

10、法有明显的缺点：一是产量很低，二是在由分生细胞和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体时不适用。11212酶解法 1960年，Cocking证实了用酶解法由高等植物细胞中大量分离原生质体的可能性。他使用了一种由疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液以降解细胞壁。然而，进一步的研究只是到了有商品酶供应之后才成为可能。自从1968年纤维素酶和离析酶投入市场以后，植物原生质体才变成了一个热门的研究领域。 首先用商品酶进行原生质体分离的是Takebe等(1968)。在他们分离烟草叶肉原生质体的程序中，上述两种酶是依次使用的，即先用离析酶处理叶片小块，

11、使之释放出单个细胞，然后再以纤维素酶消化掉细胞壁，释放出原生质体。Power和Cocking(1968)证实，这两种酶也可一起使用。这种“同时处理法”或“一步法”比“顺序处理法”快，并且由于减少了步骤，从而减少了微生物污染的机会。多数研究者现在都使用这种简化的一步法，这种方法的细节见附录111。现在市面上有各种酶制品出售(表111)取决于组织性质的不同，它们可以不同配比搭配使用。表111 存厦毕后佐分离审常用的商品醢酶来源生产厂家纤维素酶类Onozuka R一10Meicelase PCellulysinDriseIase绿色木霉绿色木霉绿色木霉Irpex lutensYakult Honsh

12、a CoLtd，Tokyo，JapanMeiji Seika Kaisha Ltd，Tokyo，JapanCalbiochem，San Diego，CA 92037，USAKayowa Hakko Kogyo Co，Tokyo，Japan果胶酶类Macerozyme R-lOPectinasePectolyase Y23根霉黑曲霉日本黑曲霉Yakult Honsha CoLtd， Tokyo，Japansigma Chemical Co，StLouis，MO 63178，USAseishin PharmCoLtd，Tokyo，Japan半纤维素酶类Rhozyme HP-150Hemicellu

13、lase黑曲霉黑曲霉Rohm and Haas Co，Philadelphia，PA 19105，USASigma Chemical Co，StLouis，M0 63178，USA 由于商品酶的出现，现在实际上已有可能由每种植物组织分离出原生质体，只要该组织的细胞还没有木质化即可。据报道，由以下各种组织中都已分离出原生质体：叶肉细胞，根组织，豆科植物的根瘤，茎尖，胚芽鞘，块茎，花瓣，小孢子母细胞，果实组织，糊粉细胞，下胚轴和培养的细胞等。 有活力和适于培养的原生质体的大量分离受到若干因素的影响，一个实验体系所需的最适条件主要是靠经验确定的。在想用一个新的实验系统分离原生质体时，可以参考Uchi

14、miya和Murashige(1974)在烟草培养细胞上所做的工作，和Scott等(1978)在禾谷类植物叶肉组织上所做的工作(见表112)。表112在两个物种中原生质体分离的最适条件项 目烟草的培养细胞禾谷类叶肉细胞植物材料纤维素酶果胶酶(离析酶)半纤维素酶酶溶液的pH酶溶液容积组织鲜重保温时间最适温度振荡速度渗压剂45日龄继代培养物1Onozuka R10O.1O.2Onozuka RlO4.7或5.710 mlg23 h223750 rmin300800 mmolL甘露醇56日龄幼苗2CellulysinO.514.65.410 m1g2 h202580 rmin600 mmo|L山梨醇

15、引自Uchimiya和Murashige(1974)；引自Scott等(1978)。 由叶肉细胞分离原生质体的方法见附录111(同时见图112)。图11.2 分离叶肉原生质体的技术流程(引自ECCocking)1122影响原生质体产量和活力的因子11221材料来源 植物原生质体最方便和最普遍的来源是叶片，因为由叶片中可以分离出大量的比较均匀一致的细胞，而又不致使植物遭到致命的破坏。由于叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易达到细胞壁。当由叶片制备原生质体时，植株的年龄和生长条件十分重要。为了能在最大程度上控制供体植株的生长条件，一些作者使用了离体培养的植物，对这些植物的叶片无须进行表面消毒。不过多数

16、作者还是使用温室或生长室栽种的植物，在这种情况下，一般以生长在下述条件下的植株能产生较好的结果：低光照强度(1 000 Wcm2。)，短日照，温度范围2025，相对湿度6080，以及充足的氮肥供应。 由于从禾本科和其他一些物种的叶肉细胞分离适于培养的原生质体相当困难，因此在这些植物中一直用培养细胞作为供体材料。培养细胞的原生质体产量取决于这些细胞的生长速率和生长时期。频繁继代(每3 d一次)的悬浮培养物以及处于对数生长早期的细胞，是最适宜的供体材料。11222前处理 由生长在非无菌条件下的植株上取来的组织，首先必须进行表面消毒。一般来说，消毒方法与第2章中介绍的用于组织和器官培养的消毒方法相同

17、。根据Scott等(1978)的实验结果，对禾谷类植物叶片进行表面消毒时，效果最好效率最高的方法是把它们用苄烷铵(Zephiran)(O.1)一酒精(10)溶液漂洗5 min。叶片表面消毒的另一种方法是用60 9670的酒精漂洗，然后再在超净工作台上使叶表面的酒精蒸发掉。 要保证酶解能充分进行，必须促使酶溶液渗入到叶片的细胞间隙中去，为达到这个目的可以采用几种不同的方法，其中应用最广泛的方法是撕去叶片的下表皮，然后以无表皮的一面向下，使叶片飘浮在酶溶液中。如果叶片的下表皮撕不掉或很难撕掉，则可把叶片或组织切成小块(约1 mm。)，投入到酶溶液中。若与真空渗人相结合后，后一种方法不但十分方便，而

18、且也非常有效。据Scott等(1978)报道，若以真空处理35 rain，使酶溶液渗入叶片小块，在2 h内即可把禾谷类植物的叶肉原生质体分离出来。检查酶溶液是否已充分渗入的标准，是当真空处理结束后大气压恢复正常时叶片小块能否下沉。代替撕表皮的另一种有效方法是用金刚砂(246目)摩擦叶的下表面。 在酶处理期间进行搅拌或振动可以增加培养细胞的原生质体产量。11223酶处理 原生质体分离的情况在很大程度上取决于所用酶的性质和浓度。分离植物细胞原生质体所必需的两种酶是纤维素酶和果胶酶，后者的作用主要是降解中胶层，前者是消化细胞壁纤维素。市售的最早真菌酶制品是Onozuka纤维素酶SS和Onozuka离

19、析酶SS，这两种酶一直得到了广泛的应用。由于对这类酶的需求与日俱增，现在又有其他很多公司进行这类酶的生产(见表111)。崩溃酶同时具有纤维素酶、果胶酶、地衣多糖酶和木聚糖酶等几种酶的孵解活性，对于由培养细胞中分离原生质体特别有用。即使是纯化的酶，如纤维素酶R10，看来也含有相当数量的果胶酶。果胶酶Y一23是一种效力很高的离析酶，若与纤维素酶结合使用，可在30 min内由豌豆叶肉细胞中把原生质体释放出来。 对于某些组织来说，除了纤维素酶和离析酶之外可能还需要半纤维素酶。大麦的糊粉细胞以纤维素酶处理之后并不能把原生质体释放出来，这是因为在原生质体周围还留下一薄层抗纤维素酶的壁。这类细胞称作原生质球

20、，只有用Glusulase酶处理才能把它们剩余的壁消化掉。 粗制的商品酶含有核酸酶和蛋白酶等杂质，它们对原生质体的活力可能是有害的。因此有些研究者常在使用之前将这些酶纯化，方法是使它们通过聚丙烯酰胺凝胶或葡聚糖凝胶G25进行过滤洗提。不过在多数情况下，这些酶的粗制形式也能产生令人满意的结果。确实，Arnold和Eriksson(1976)观察到，酶的纯化会导致存活原生质体数目的减少，相比之下，粗制酶效果更好。 酶的活性与pH值有关。按照生产厂家的说明，Onozuka纤维素酶R10和离析酶R10的最适pH值分别为56和45。不过实际上酶溶液的pH值经常被调节在4.76.O之间。Uchimiya和

21、Murashige(1974)观察到，用于由烟草的培养细胞分离原生质体的混合酶溶液有2个最适pH值，一个是4.7，另一个是5.7。 对这些酶的活性来说，最适温度是4050C，而对细胞来说，这样的温度碰巧是太高了。一般来说，分离原生质体时温度以2530C为宜。酶的浓度和酶处理的持续时间须经若干次实验后才能决定。在酶溶液中保温处理的时间可以短至30 min或长至20 h。可能影响原生质体产量的另一个因子是酶溶液的容积和植物组织数量之间的相互关系。一般来说，每1 g组织用10 ml酶溶液常可产生令人满意的结果。 酶溶液可以在低温冰箱中贮存数月而不丧失活性。11224渗压剂 离体原生质体的一个基本属性

22、是它们的渗透破碎性，因而在酶溶液、原生质体清洗介质和原生质体培养基中必须加入一种适当的渗透压稳定剂。在具有合适渗透压的溶液中，新分离出来的原生质体看上去都是球形的(见图113)。根据定量观察，原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中更为稳定。较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和出芽，但与此同时也可能会抑制原生质体的分裂。 为了凋节用于原生质体分离和培养的各种溶液的渗透压，已经对很多电解质和非FU解质进行过试验，但应用得圾广泛的渗透压稳定剂是山梨醇和甘露醇，适宜的浓度范围是450800 mmolL。Uchimiya和Murashige(1974)注意到，当由烟草悬浮培养物分离原生质体时，几种可

23、溶性碳水化合物包括葡萄糖、果糖、半乳糖、山梨醇和甘露醇等，都是同样有效的。当把非电解质用做渗透压稳定剂时，常要在酶溶液中补加上某些盐类尤其是CaCl2(50100 mmolL)，以便提高质膜的稳定性。 Meyer(1974)以及Bohnke和Kohlenbach(1978)报道，使用电解渗压剂(335 mmolL KCl和40 mmolL MgSO47H20)能够提高原生质体的活力，产生更为纯净的制品。然而，若以盐类调节培养基的渗透压则是有害的。1123原生质体的净化 当材料已在酶溶液中保温足够的时间以后，小心地振动容器或轻轻地压挤叶块，以使原来组织中的原生质体释放出来。此时容器内经过酶解后的

24、混合物中除了完整的未受损伤的原生质体之外，还含有亚细胞碎屑，尤其是叶绿体、维管成分、未被消化的细胞和碎裂的原生质体，因而必须把这些杂质除掉。清除较大碎屑的方法是使酶解后的混合物穿过一个镍丝网(5070m)。进一步的净化则须采用以下3种方法中的一种：11231 沉降法 将镍丝网滤出液置于离心管中，在75100 g下离心23 min后，原生质体沉于离心管底部，残渣碎屑悬浮于上清液中。弃去上清液。再把沉淀物重新悬浮于清洗培养基中，在50 g下离心35 min后再悬浮，如此反复3次。常用的原生质体清洗培养基为CPW盐溶液，成分为(mgl)：KH2PO427.2KIO.16KN03101.OCuS045

25、H20O.025CaCl22H2O1 480.0pH5.8MgSO47H20246.0(Cocking和Peberdy，1974)。11232漂浮法 根据原生质体来源的不同，利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后使原生质体漂浮其上，残渣碎屑沉到管底。具体做法是，将悬浮在少量酶混合液或清洗培养基中的原生质体沉淀和碎屑置于离心管内蔗糖溶液(21)的顶部，在100 g下离心1 0 min。碎屑下沉到符底后一个纯净的原生质体带出现在蔗糖溶液和原生质体悬浮培养基的界面上。用移液管小心地将原生质体吸出，转入到另一个离心管中。通过反复地离心和重新悬浮之后，如在沉降法中一样，再将原生质体清洗3次，最后以适

26、当的密度悬浮在培养基中。11233界面法 这种方法的原理是，采用两种密度不同的溶液，离心后使完整的原生质体处在两液相的界面。最早使用这种方法净化原生质体的Hughes等(1978)在离心管底部注入的是450 mmolL蔗糖，在顶部注入的是450 mmolL甘露醇。1年后Piwowarczyk(1979)改进了这种密度梯度法，只通过一次离心即可得到不混有酶和碎屑的完整无损的原生质体。这种梯度的制备方法是，在离心管中依次加入一层溶于培养基中的500 mmolL蔗糖，一层溶于培养基中的140 mmolL蔗糖和360 mmolL山梨醇，最后是一层悬浮在酶溶液中的原生质体，其中含有300 mmolL山梨

27、醇和100 mmolL CaCl2。经400 g 5 min离心之后，刚好在蔗糖层之上会出现一个纯净的原生质体层，而碎屑则移动到管底。1124原生质体活力的测定 对于新分离出来的原生质体的活力有几种不同的测定方法：以胞质环流作为进行活跃代谢的指标，但对在细胞周缘携有大量叶绿体的叶肉细胞原生质体来说，这种方法的作用不大；以氧的摄人量做指标，摄人量可通过一个能指示呼吸代谢强度的氧电极进行测定；以光合活性做指标；以完整的质膜排斥伊凡蓝的能力做指标；以荧光素双醋酸酯(FDA)的染色能力为指标。上述测定细胞(原生质体)活力的方法有些已在第635节中做过介绍。113原生质体培养1131供体植物的选择 现在

28、已愈来愈清楚地认识到，为了能够获得可重复的高植板效率，供体组织的生理状态和原生质体的质量即使不比培养条件更重要，其重要性也和培养条件相当。如前所述，如果要使用由完整的植物器官得到的组织制备原生质体，供体植株应当栽培在光、温和湿度可控的条件下。由田间植株上取得的叶片常产生难以重复的结果。据Schenck和Hoffmann(1979)报道，由种在温室或生长箱中的植株制备的油菜和甘蓝的叶肉原生质体不能进行分裂，而由在无菌条件下生长的幼苗制备的原生质体则能形成愈伤组织。Shepard等(1980)建议，用于制备原生质体的马铃薯植株应种在营养、温度、光强和光周期等可严格控制的条件下，否则无论采用什么培养

29、基原生质体也不能进行分裂。 在若干物种(如甘蓝、甘薯、大豆和陆地棉等)中，由新采集的叶片制备的原生质体不能进行持续的分裂，在这种情况下，若先把叶片在适当的培养基中预培养37 d，则有可能获得可分裂的原生质体。1132原生质体培养基11321成分 在多数情况下原生质体培养所用的为MS，Bs，或它们的衍生培养基的盐类。据Kao等(1973)报道，在Vicia hajastana和无芒雀麦的原生质体培养中，若在B。培养基中加入1 mmolL CaCl2，能提高分裂细胞百分数。然而，若在该培养基中补加20 mmolL NH4NO3，则会降低分裂细胞的频率。在烟草和马铃薯中，Meyer(1974)和Up

30、adhya(1975)也分别报道了铵离子对叶肉原生质体的存活率具有类似的效应。 在原生质体培养中所用的维生素与标准组织培养基中的相同。生长激素，尤其是生长素和细胞分裂素，几乎总是必不可少的。然而对于禾谷类植物原生质体培养来说，单是2，4D或者已经足够，或者比和细胞分裂素配合使用效果更好。为了诱导细胞能以理想的速率进行分裂，在培养基中所须加入的生长素和细胞分裂素的种类及之间的配比因植物材料而不同。在生长素中最常用的是2，4D，但据Uchimiya和Murashige(1976)报道，对于烟草悬浮细胞原生质体培养来说，NAA效果比2，4D或IAA更好。在细胞分裂素中最常用的是BAP、激动素和2ip

31、。虽然由活跃生长的培养细胞分离的原生质体要求较高的生长素细胞分裂素配比才能进行分裂，但是由高度分化的细胞如叶肉细胞等得到的原生质体，常常需要较高的细胞分裂素生长素配比才能进行脱分化。 虽然有些时候根据完整细胞和组织对培养条件的要求，可以推测出适于其原生质体培养的培养基成分，但认为原生质体在培养中的表现与无壁细胞相当的这样一种简单概念并非总是正确的。例如，当去掉细胞壁以后，培养的冠瘿瘤细胞就会失去其生长调节物质的自主性，而在多细胞阶段，这种自主性又得到了恢复。同样，豌豆根尖原生质体对培养条件的要求与其细胞也有所不同。Scott等(1978)发现，刚分离出来的禾谷类植物原生质体对培养基中的植物激素

32、很敏感，但由这些原生质体再生的细胞则可转移到含有生长素和细胞分裂素的培养基中诱导分裂。11322渗压剂 在还没有再生出一个坚韧的细胞壁之前，原生质体必须有培养基渗透压的保护。像在酶溶液中一样，培养基中的渗透压一般是以500600 mmolL甘露醇或山梨醇调节的。据Scott等(1978)以及Arnold和Eriksson(1976)报道，对于禾谷类植物和豌豆的叶肉原生质体来说，蔗糖或葡萄糖不能取代甘露醇或山梨醇用做培养基中的渗透压稳定剂。然而有些作者则发现，葡萄糖的作用优于其他的渗压剂。Shepard等(1977，1980)在马铃薯、甘薯和木薯原生质体培养中则经常用蔗糖作为渗透压稳定剂。在雀麦

33、草的原生质体培养中，实验表明蔗糖的效果比葡萄糖或甘露醇好。在培养基中使用电解质渗压剂会抑制壁的再生，导致不能进行正常的有丝分裂。 培养开始后710 d，大部分有活力的原生质体已经再生出细胞壁并进行了几次分裂，此后通过定期加入几滴不含渗压剂或渗压剂水平很低的新鲜培养基，可使培养基的渗透压逐渐下降。若还把渗压剂保持在原来的高水平上，若干时间以后细胞就会停止分裂。最后将肉眼可见的细胞团转入到不含渗压剂的新鲜培养基中。1133培养条件新分离出来的原生质体应在散射光或黑暗中培养。在某些物种中原生质体对光非常敏感，最初的47 d应置于完全黑暗中培养。在显微镜台上以加绿色滤光片的白炽灯光照射5 min后，豌

34、豆根原生质体的有丝分裂活动就会受到完全的抑制。经过57 d，当完整的细胞壁形成以后，细胞就具备了耐光的特性，这时才可把培养物转移到光下。因此，在原生质体对光敏感的情况下，应当尽量少做观察，凡经观察过的原生质体不应包括在以后的实验结果中。原生质体培养一般是在2530C下进行的。有关在原生质体培养中温度对壁的再生和以后分裂活动的影响研究得很少。当培养在25温度下时，番茄和秘鲁番茄的叶肉原生质体以及陆地棉培养细胞的原生质体，或是不能分裂，或是分裂的频率很低；但在2729下，这些原生质体发生分裂，植板效率很高。据认为，较高的温度不仅能影响分裂的速率，而且在迄今不能分裂的原生质体系统中，还可能是启动和维

35、持分裂的一个前提。1134培养方法11341 固体培养琼脂糖包埋 原生质体的培养方法和对培养条件的要求常与单细胞培养相似。故原生质体可按Bergmann的细胞植板法(见第6章)用琼脂平板进行培养(见图114)。不过近年来发现，用琼脂糖代替琼脂可以提高植板效率。特别是对于那些在琼脂培养基上不易发生分裂的原生质体，使用琼脂糖可能会取得比较好的效果。低融点琼脂糖可在30C左右融化，与原生质体混合不影响原生质体的生活力。使用半固体培养基的优点是原生质体的位置固定不变，这就为跟踪观察某一个体的发育过程提供了方便。图114原生质体培养的技术流程(引自ECCocking)11342液体培养尽管半固体培养基有

36、上述优点，但很多研究者还是喜欢使用液体培养基，这是因为，当使用液体培养基的时候：经过几天培养之后，可用有效的方法把培养基的渗透压降低；如果原生质体群体中的蜕变组分产生了某些能杀死健康细胞的有毒物质，可以更换培养基；以及经过几天高密度培养之后，可把细胞密度降低，或可把特别感兴趣的细胞分离出来。在液体培养基中进行原生质体培养可采用不同的方式，如： 1液体浅层培养：将含有一定密度原生质体的液体培养基在培养皿底部铺成一薄层，厚1 mm左右，用封口膜封口后进行培养。 2微滴培养：用滴管将原生质体悬浮液分散滴在培养皿底部，每滴50100l，盖好封严后置于潮湿的容器中培养。 液体培养方法尽管有上述优点，但在

37、浅层培养情况下原生质体间容易发生粘连，影响它们的生长发育，在微滴培养情况下则必须注意防止失水变干。11343双层培养 在培养皿底部先铺一层琼脂固化培养基，然后在它上面滴加原生质体悬浮液。这种培养方法的好处是固体培养基中的养分可以不断向液体培养基中释放，同时培养基亦不易失水变干。1135 植板密度 与在细胞培养中的情况相似，原生质体初始植板密度对植板效率有显著的影响。原生质体培养的一般密度是每毫升培养基1104到1105原生质体。在这样一种高密度的情况下，由个别原生质体形成的细胞团常在相当早的培养期就彼此交错地长在一起，倘若该原生质体群体在遗传上是异质的，其结果就会形成一种嵌合体组织。在体细胞杂

38、交和诱发突变的研究中，最好是能获得个别细胞的无性系，为此就需要在低密度(每毫升培养基100500个原生质体)下培养原生质体或由原生质体产生的细胞。通过这个途径还可追踪个别细胞的发育过程，因而即使缺少适当的选择系统这是目前体细胞杂交中的一个困难环节也有可能把杂种细胞团分离出来。1136低密度培养的对策11361培养基 为了培养低密度原生质体，Kao和Michayluk(1975)配制了一种复杂的培养基，即KM8p培养基(见表113)，在其中Vicia hajastana的单个细胞能再生出壁，进行持续的分裂并形成愈伤组织。在这种培养基中，苜蓿、豌豆和Vicia的叶肉原生质体在较低的群体密度(少于1

39、00个原生质体m1)下比在较高的密度下分裂得快。用KM8p培养基培养马铃薯原生质体以及马铃薯+番茄原生质体融合产物也获得了成功。在应用KM8p培养基的时候，应将培养材料置于黑暗或近于黑暗(50 lx)的条件下，因为在强光下这种培养基对植物有毒。11362培养方法 1饲养细胞层法：这是Raveh等(1973)建立的一种在低密度下培养原生质体的方法。在一般情况下，当植板密度低于lO4原生质体ml时，烟草原生质体不能分裂，但通过饲养细胞层法，这些细胞可在低至10100原生质体m1的密度下进行培养。饲养细胞层的制备方法是，先以剂量为5103R的X-射线照射原生质体(106细胞m1)，这一剂量能抑制细胞

40、分裂，但并不破坏细胞的代谢活性。照射后将原生质体清洗23次(洗净由照射所产生的有毒物质是重要的一环)，植板在软琼脂培养基上。这时将琼脂培养基中未经照射过的原生质体铺在饲养细胞层上。饲养层细胞的最适密度与在一般原生质体培养中的最适植板密度(2.4104m1)相同。饲养层也可由悬浮培养的细胞制备。虽然已知在不同物种的原生质体之间可以发生互馈现象，但是对于烟草和柑橘原生质体来说，以本物种原生质体制备的饲养层比用异物种细胞制备的饲养层更为有效。 2共培养法：两个不同物种原生质体共培养的方法也可用于某些物种的原生质体或杂种细胞的培养。具体做法是把两种类型的活跃代谢和正在分裂的原生质体混合在液体培养基中，

41、一起进行培养。这种方法只适用于以下情况，即在这两种类型的原生质体之间能发生有效的互馈，同时由这两种类型细胞所产生的愈伤组织在形态上能够彼此区分。例如Menczel等(1978)曾把用机械方法分离出来的烟草属两个物种种间融合杂种细胞转移到林生烟草一个白化品系的原生质体培养物上，由于杂种细胞是绿色的，因而能与白化类型的非绿色细胞团清楚地区分开来。 3Cuprak微滴法：高国楠(1977)及Gleba(1978)等曾使用一种构造特别的“Cuprak培养皿，培养单个原生质体及由这些原生质体再生的细胞。这种培养皿有两室：小的外室和大的内室。内室中有很多编码的小穴，每个小穴能装0.2525l培养基。把原生

42、质体悬浮液的微滴加入到小穴中，在外室内注入无菌蒸馏水以保持培养皿内的湿度。把培养皿盖上盖子以后，用封口膜封严。通过这个方法，Gleba(1978)由单个地培养在0.250.5l小滴的原生质体获得了完整的烟草植株。对于单个原生质体的分裂来说，微滴的大小是关键因素。每O.25O.5l的小滴内含有一个原生质体，在细胞数对培养基容积的比率上相当于细胞密度为24103细胞ml。增加微滴的大小将会降低有效植板密度。据Gleba(1978)报道，在大于2l的微滴中，单个细胞不能分裂。在粉蓝烟草+大豆和拟南芥+油菜杂种细胞培养中，应用微滴法已取得了成功。1137细胞壁的形成 开始培养后24 d之内，原生质体将

43、失去它们所特有的球形外观，这种变化被视为再生新壁的象征。证明细胞壁再生的更可靠和更直接的方法是以卡氏白(Calcafluor white)染色或利用各种电镜技术。在使用前一种方法时，将原生质体置于浓度为O.01或0.1并含有适当渗透压稳定剂的卡氏白溶液中保温5 min。经过清洗除去多余染料后，再把原生质体置于载玻片上渗透压适当的溶液中。卡氏白能与细胞壁物质结合，当使用配有激发滤片BGl2和吸收滤片K510的水银蒸气灯观察时，能发出荧光。据认为，一旦把酶洗掉，原生质体立即开始合成新肇。一般说来，和已分化的叶肉细胞原生质体相比，在活跃生长的悬浮培养细胞的原生质体中微纤丝的沉积快得多。例如，蚕豆培养

44、细胞的原生质体在培养后1020 min即能开始壁的合成，而叶肉原生质体经824 h培养后在其周围才能见到细胞壁物质，大约72 h后才能形成完整的壁。在有些情况下原生质体保持无壁状态可长达1周以上，甚至数月之久。燕麦胚芽鞘和蔷薇培养细胞的原生质体则只能轻度地再生细胞壁。 新形成的细胞壁是由排列松散的微纤丝组成的，由这些微纤丝后来组成了典型的细胞壁。迄今所能得到的证据表明，微纤丝的合成是发生在质膜的表面。然而，对于特定的细胞器是否与微纤丝的合成有关还没有取得一致的看法，Robenek和Peveling(1977)以日本茵芋(Skimmia如ponica)原生质体所做的研究，指出了内质网与壁物质的合

45、成有关，并排除了高尔基体参与的可能性。 Horine和Ruesink(1972)报道，旋花科植物原生质体只有在外源供应一种易于代谢的碳源(如蔗糖)时，细胞壁才能再生，否则细胞壁就不能形成。培养基中若存在电解质渗透压稳定剂会抑制壁的发育。对于胡萝卜细胞悬浮培养物的原生质体来说，若在培养基中加入聚乙二醇1 500，细胞壁的发育就既快又比较均匀。 壁的形成与细胞分裂有直接关系，凡是不能再生细胞壁的原生质体也就不能进行正常的有丝分裂。细胞壁发育不全的原生质体常会出芽，或体积增大，相当于原来体积的若干倍。此外，由于在核分裂的同时不伴随发生细胞分裂，这些原生质体可能变成多核原生质体。所以会出现这些异常现象

46、，除了其他原因之外，原生质体在培养之前清洗不彻底可能是一个重要原因。1138细胞分裂和愈伤组织的形成 虽然细胞壁的存在是进行规则有丝分裂的前提，但并非所有的原生质体再生细胞都能进行分裂。因此，原生质体植板效率可以有很大变化：低至0.1，高达80。 凡能分裂的原生质体，可在27 d之内进行第一次分裂。在少有的情况下，第一次分裂之前的滞后期可持续长达725 d之久。与已经高度分化的叶肉细胞原生质体相比，活跃分裂的悬浮培养细胞的原生质体进入第一次有丝分裂的时间照例要早。凡能继续分裂的细胞，经23周培养后可长出细胞团。再经过2周之后，愈伤组织已明显可见，这时可把它们转移到不含渗压剂的培养基中，依一般的

47、组织培养方法处理。1139植株再生 只有由经过饰变的细胞能获得完整的植株时，才有可能通过对离体原生质体的遗传饰变进行作物改良。已经证明细胞的全能性是一个显性性状。因此，在一项体细胞杂交研究中，至少应有一个亲本的原生质体能表现全能性。能够影响愈伤组织培养物进行植株分化的因素已在第4，5两章讨论过。 有关离体原生质体再生植株的第一篇报道发表于1971年，作者为Takebe等，材料为烟草。此后表现出这种潜力的物种名单不断增加。尤其引人注目的是，1980年，一个禾本科物种珍珠粟和2个豆科牧草物种苜蓿和白车轴草由原生质体形成了完整的植株。在20世纪整个80年代，这一名单中新增加的其他重要栽培植物除如前所述的各种禾本科作物外，还有棉花、大豆