《蛋白质结构》课件.ppt

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1、1,第三节 蛋白质的结构 Section 3 Structure of Proteins,2,蛋白质的结构指蛋白质分子所含的肽链数目，以及每条肽链中氨基酸的种类、数量和排列顺序，以及肽链中各个原子和基团在空间的排部。,3,蛋白质的一级结构,蛋白质的空间结构,肽键和肽,4,肽键（Peptide Bonds）是氨基酸连接的基本方式。1.肽键的结构,一、肽键和肽,5,Peptide bond,Single bond,Double bond,键长 0.145nm 0.133nm 0.125nm,6,Fig.The peptide bond is shown in its usual trans con

2、figuration of carbonyl O and amide H.,7,小结：肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。肽键是一个平面肽键平面（peptide plane）或酰胺平面（amide plane)。多数情况下，为反式构型。,8,2.肽的结构,氨基末端（N末端）,羧基末端（C末端）,结构通式,9,肽的命名(nomination)：,如：Val-Ala-Lys-Gly-Arg 缬氨酰丙氨酰赖氨酰甘氨酰精氨酸,丝氨酰甘氨酰酪氨酸,10,肽的分类（classification of peptide）,二肽(dipeptides)：三肽：3个氨基酸通过2个肽键相连。四肽：少于1

3、0AA成为寡肽(oligopeptides)多于10AA成为多肽(polypeptides)分子量小于10000Da称为多肽大于10000Da称为蛋白质,11,共价主链和侧链,12,小结：蛋白质分子中氨基酸连接的基本方式是肽键（peptide bond）。有的蛋白质分子还具有二硫键(disulfide bond），有链间二硫键 和链内二硫键两种形式。肽链中的氨基酸由于形成肽键而成为不完整的分子，称为氨基酸残基（amino acid residue）。肽链骨干 重复单位是：N C C,13,3.肽的物理和化学性质,短肽为晶体，熔点很高 在水溶液中以兼性离子形式存在 具旋光性,物理性质,（1）酸碱

4、性质：主要取决于游离末端的-NH2和-COOH及R基上可解离基团。,化学性质,14,（2）化学反应,茚三酮反应,双缩脲反应,15,4.天然存在的活性肽,激素：胰岛素 催产素（8肽）加压素（8肽）抗生素：短杆菌肽S（环状10肽）放线菌D（含2个环状5肽）毒素：-鹅膏蕈碱脑啡肽:,16,还原型谷胱甘肽,17,短杆菌肽和短杆菌酪肽,10肽抗生素。,18,脑啡肽（5肽）,已发现几十种.如 Met-脑啡肽（TyrGlyGlyPheMet）Leu-脑啡肽（TyrGlyGlyPheLeu）,19,二、蛋白质的一级结构,定义指蛋白质多肽链中aa的排列顺序，包括二硫键的位置。,20,1.蛋白质的一级结构举例,英

5、 Sanger 等，1953,Frederick Sanger,胰岛素（insulin）,Mr:5700D,21,Fig The amino acid sequence of the two chains of bovine insulin,which are joined by disulfide cross-linkages.,22,2.一级结构测定方法（Determining methods of Primary structure of a protein),测定蛋白质分子中多肽链的数目。拆分蛋白质分子的多肽链。断裂多肽链的二硫键。测定多肽链的氨基酸组成。分析多肽链的N末端和C末端残基

6、。将多肽链断裂成肽段，并分离。测定各个肽段的氨基酸顺序。确定肽段在多肽链中的次序。确定原多肽链中二硫键的位置。,一般原则,23,(1)一般要求:,a、样品必需纯（97%以上）b、已知蛋白质的分子量c、已知蛋白质由几个亚基组成,24,(2)测定步骤,A.测定蛋白质分子中多肽链的数目。,蛋白质一级结构的测定,25,(2)测定步骤,分析多肽链的N-末端和C-末端。多肽链N-端(amino-terminal),蛋白质一级结构的测定,26,氨基末端基氨基酸测定,二硝基氟苯（DNFB）法,27,氨基末端基氨基酸测定,丹磺酰氯法,28,Edman法。,氨基末端基氨基酸测定,苯异硫氰酸（PITC）法,29,氨

7、肽酶(amino peptidases)是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。,氨基末端基氨基酸测定,氨肽酶法,30,羧基末端基氨基酸测定,羧基末端-肼解法,31,羧肽酶(carboxypeptidase)是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解AA。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y.,羧基末端基氨基酸测定,羧基末端-羧肽酶法,32,用LiBH4使C末端氨基酸还原成氨基醇，然后水解，测定氨基酸，即可知C末端氨基酸。,羧基末端基氨基酸测定,羧基末端-硼氢化锂还原法,-,H2N-CH-CO-NH-CH-COOH,H2N-CH-CO-NH-CH-CH2OH,|R1,|R

8、2,|R1,|R2,33,（2）测定步骤,B.多肽链的拆分。,蛋白质一级结构的测定,34,(2)测定步骤,B.多肽链的拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).,蛋白质一级结构的测定,35,(2)测定步骤,C.二硫键的断裂 还原法:-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基.,SH-CH2-CH2-OH,蛋白质一级结构的测定,36,(2)测定步骤,氧化法:应用过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键。,蛋白质一级结构的测定,37,（2）测定步骤,D.测定每条肽链的氨基酸组成 根

9、据蛋白质水解,蛋白质一级结构的测定,水解产物是aa 混合物水解产物是各种大小不同的肽段和aa,38,Table1-2,39,（2）测定步骤,E.多肽链断裂,蛋白质一级结构的测定,多肽链断裂法：酶解法和化学法,40,酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶,多肽链的选择性降解,（2）测定步骤,41,Trypsin：R1=Lys和Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。R2=Pro 水解受抑。,胰蛋白酶,42,或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=Phe,Trp,Tyr时水解快;R1=Leu，Met和His水解稍慢。R2=Pro 水解受抑。,糜蛋白酶,43,Pe

10、psin：R1和R2Phe,Trp,Tyr;Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。R1=Pro 水解受抑。,肽链,水解位点,胃蛋白酶,44,thermolysin：R2=Phe,Trp,Tyr;Leu，Ile,Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。R2=Pro或Gly 水解受抑。R1或R3=Pro 水解受抑。,肽链,水解位点,嗜热菌蛋白酶,45,谷氨酸蛋白酶：R1=Glu、Asp(磷酸缓冲液);R1=Glu(碳酸氢铵缓冲液或醋酸缓冲液)精氨酸蛋白酶：R1=Arg,肽链,水解位点,谷氨酸蛋白酶和精氨酸蛋白酶,46,化学法：可获得较大的肽段溴化氰(Cyanogen bromide)水解法。

11、羟胺（NH2OH）：,多肽链的选择性降解,（2）测定步骤,47,（2）测定步骤,F.分离肽段测定每个肽段的氨基酸顺序。,蛋白质一级结构的测定,48,Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法。,Edman氨基酸顺序分析法,苯氨基硫甲酰氨基酸,（2）测定步骤,49,（2）测定步骤,H.确定原多肽链中二硫键的位置 对角线法,蛋白质一级结构的测定,50,对角线电泳（diagonal eletrophoresis）（Brown 和 Hartly）,51,52,+,-,+,-,第二向,第一向,ab,Brown和Hartlay对角线电泳图解,pH6.5图中a、b两个斑点是由一个二硫键断裂产生的肽段,53

12、,（2）测定步骤,蛋白质一级结构的测定,I.肽段在多肽链中的次序利用重叠肽，推出肽链的氨基酸顺序。,54,三、蛋白质的空间结构 three-dimensional structure,55,构型（configuration）是指在一个不对称性的化合物中不对称中心上的几个原子或基团的空间排布方式。这种排列方式的改变会牵涉到共价键的形成或破坏，而与氢键无关，是一种两维的变化。例如单糖的-、-型，氨基酸的L-、D-型都是构型。构象（conformation）是表示一个分子结构中一切原子沿共价键（单键）转动时而产生的不同空间排列，它通常与分子的不对称性无关。这种排列的变化会涉及到氢键等次级键的形成和破

13、坏，而不改变共价键，这是三维空间的变化，如多肽及蛋白质的高级结构即属于构象。,56,（一）多肽链折叠的空间限制,Fig.Limited rotation can occur around two of the three types of bonds in a polypeptide chain.,1.肽平面（酰胺平面、肽单位、肽基）,57,多肽链的构象可用肽基间的两面角来描述。绕C N 键旋转的角度称（角），绕C C 键旋转的角度称（角）。多肽链的所有构象都可以用、两个构象角来描述。这两个角（和）决定了相邻两个肽平面的相对位置。,2.C的二面角（dihedral angle）,58,Fig1

14、-29.The peptide bond planes are joined by the tetrahedral bonds of the-carbon.The conformation shown corresponds to=+180，=+180.,59,3.可允许的角和 角,拉氏构象图(Ramachandran plot)：根据非键合原子之间的最小接触距离确定二面角（，）的允许范围。,60,（二）蛋白质的二级结构（Protein Secondary structure),概念：蛋白质分子中主链折叠产生的、由氢 键维系的、有规则的构象。二级结构的类型：-螺旋、-折叠、-转角、无规卷曲几种

15、形式。维持蛋白质二级结构的主要化学键是氢键。,61,1.-螺旋（-helix）,=-57，=-47；,Fig Four different graphic representations of the-helix.,结构要点,62,影响-螺旋形成的因素,极大的侧链基团（存在空间位阻）；连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸残基（同种电荷的互斥效应）；有Pro存在时，（不能形成氢键），因此将中断螺旋。有Gly，因为侧链过于简单，而导致构象太“柔顺”。,63,其他类型的螺旋：,310-螺旋:-螺旋（4.416螺旋）:,64,2-折叠(-sheet):,两条或多条几乎完全伸展的多肽链，侧向聚集，相邻肽链

16、上的C=O与NH形成有规则的氢键，所有肽键都参与氢键形成，方向与肽链长轴垂直。有平行（所有参与-折叠的肽链的N端在同一方向）；反平行（肽链的极性一顺一倒，N端间隔相同）。,65,Fig“A pleated sheet”of paper with an antiparallel-sheet drawn on it.,-折叠股,66,3-转角(Turn),多肽链180回折部分所形成的一种二级结构，常由个氨基酸残基组成，第二个残基常为脯氨酸。第一个aa残基的羰基氧与第四个aa残基的酰胺氢之间形成氢键。,67,R在同一侧,R在相对侧,第5次课结束,68,4无规卷曲（Random coil),无规卷曲：

17、,无规卷曲在球状蛋白中含量较高，对外界理化因子敏感，与生物活性有关。,69,70,（三）蛋白质的超二级结构 Super secondary structure,在球状蛋白质中，若干相邻的二级结构单元组和在一起，彼此相互作用，形成有规则、在空间上能辨认的二级结构组合体，充当三级结构的构件。是蛋白质二级结构至三级结构层次的一种过渡态构象层次。有三种基本形式：，和。,71,（四）蛋白质的结构域(domain),结构域 是球状蛋白质的折叠单位。多肽链在二级结构和超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球状的结构，具有部分生物功能。通常都是几个超二级结构单元的组合。对于较小的蛋白质分子或亚基，结构域

18、和三级结构意思相同，即这类蛋白质是单结构域（single domain)；较大的蛋白质含多个结构域(multidomain).,72,两个结构域彼此很不相同,73,（五）蛋白质的三级结构 Tertiary structure,蛋白质的三级结构是指在二级结构基础上，肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构,是球状分子特有的结构。指多肽链中所有的原子或基团的空间排列。,74,S-S bond,S-S bond,Active site,虾红素(Astacin),75,维持三级结构的作用力：,主要有氢键、疏水相互作用、离子键(盐键)、范德华力等。

19、尤其是疏水相互作用。,76,这些弱的相互作用（或称非共价键，或次级键），是蛋白质分子的主链和侧链上的极性、非极性、离子基团相互作用形成的。,77,1氢键（Hydrogen Bond）,两个重要的特征：方向性 饱和性,78,2范德华力 van der Waals Forces,包括三种弱的作用力：定向效应 诱导效应 分散效应,79,3疏水作用(Hydrophobic interaction),80,4离子键(inoic interaction),81,二硫键,5二硫键(disulfide bond),82,维持蛋白质三维结构的各种化学键,疏水键,二硫键,侧链氢键,氢键,盐键,范德华力,83,维持

20、蛋白质空间构象的化学键,84,（六）蛋白质的四级结构（quaternary structure),指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式。最小的单位通常称为亚基或亚单位Subunit；四级结构包括亚基的种类、数量以及在整个分子中的空间排布。维持亚基之间的化学键主要是疏水作用。由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白。,85,86,在四级结构中，一般亚基数目为偶数，且对称排列。对称性是四级结构蛋白质最重要的性质之一。以线性对称排列为主。,87,四级缔合在结构上和功能上的优越性,稳定性 遗传上的经济性和高效率 使催化位点汇集在一起 协同效应和别构效应,88,蛋白质的四个结构水平,