活性蛋白质的分离与应用.ppt

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1、活性蛋白质的分离与应用,概述,蛋白质是一类由多种氨基酸结合而成的长链含氮有机高分子化合物，是生物体细胞的重要组成物质之一，是生命活动的基础。活性蛋白质是一类具有特殊生理活性的蛋白质。,概述,活性蛋白质的存在范围：活性蛋白质广泛分布于各种生物体组织，如动植物组织、动物乳汁、植物种子等中。,蛋白质的分类,活性蛋白质的种类非常多，一般根据来源与特性可分为：活性多肽、活性乳蛋白、天花粉蛋白、谷物蛋白、豆类蛋白、花生蛋白等。蛋白质又可以根据蛋白质分子的化学组成和结构复杂程度分类，将其分为单纯蛋白质和结合蛋白质。单纯蛋白质是指结构比较简单，在组成上基本是单纯由氨基酸构成的那些蛋白质。结合蛋白质是指结构比较

2、复杂，由氨基酸和其他成分组成的那些蛋白质。单纯蛋白质又可以根据溶解度细分为清蛋白、球蛋白、谷蛋白、硬蛋白、组蛋白、精蛋白、醇溶谷蛋白等。,活性蛋白质的性质,活性蛋白质是蛋白质中一类具有生物活性的蛋白质，像蛋白质一样，也是一类由多种氨基酸结合而成的长链高分子化合物，它具有所有蛋白质的一般性质，包括：两性解离等电点胶体性质变性沉淀显色反应,活性蛋白质的性质,1.两性解离：蛋白质分子中含有多个可解离的酸性或碱性基团（酸性基团主要是C末端羧基及酸性氨基酸侧链的羧基，碱性基团有N末端的氨基及碱性氨基酸侧链的氨基、胍基及咪基）。可进行酸性解离或碱性解离，所以说它具有两性解离的特性。,活性蛋白质的性质,2.

3、蛋白质的等电点：在一定的介质中，某一蛋白质解离成阴、阳离子的趋势相等，成为两性离子（净电荷为零），此时介质的pH值为蛋白质的等电点。不同的蛋白质所含酸性或碱性氨基酸的比例不同，等电点也不相同。根据蛋白质等电点的不同可以通过电泳进行分离蛋白质。,活性蛋白质的性质,3.蛋白质的胶体性质：蛋白质属亲水胶体分子，如球状蛋白质相对分子质量在6000100万之间，直径在胶体颗粒的范围（1100nm），且球蛋白质溶于水，分子中的亲水氨基酸残基多位于颗粒表面，在水溶液中能与水起水合作用。所以蛋白质具有胶体性质，如丁达尔现象、布朗运动、不能透过半透膜等。,活性蛋白质的性质,4.蛋白质的变性：蛋白质在某些理化因素

4、作用下，特定的空间结构被破坏而导致其原有的理化性质改变及生物活性丧失，这种现象称为蛋白质的变性。,变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。,活性蛋白质的性质,5.蛋白质的沉淀：蛋白质沉淀是指蛋白质分子聚集，从溶液中析出的现象。蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。,5.蛋白质的沉淀：,可逆沉淀在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使

5、蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。,5.蛋白质的沉淀：,不可逆沉淀在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。,活性蛋白质的性质,6.蛋白质的显色反应：常用的显色反应有以下几种。（1）双缩脲反应 该反应知肽键

6、常用的反应，即在碱性铜溶液中，肽键与铜离子行程络合物，呈紫色（在540nm有最大光吸收峰）。（2）酚试剂法 该反应是比色法测定蛋白质的常用方法，即蛋白质以碱性铜溶液处理后，加用酚试剂，呈蓝色（在650nm有最大光吸收峰）。（3）考马斯亮蓝法 即蛋白质与一种蛋白质染料考马斯亮蓝G250反应形成复合物，该复合物在595nm有最大光吸收峰。显色反应可用于蛋白质的检测分析。,蛋白质分离纯化的一般原则,蛋白质在组织或细胞中都是以复杂的混合物形式存在的，每种类型的细胞都含有上千种不同类型的蛋白质。分离纯化的目的就是要从复杂的混合物中将所需要的某种蛋白质提取出来，并达到一定的纯度。因纯度是相对的，因此提纯的

7、目标是尽量提高蛋白质的纯度或比活性（即增加单位重量中所需蛋白质的含量或生物活性），设法除去变性的和不需要的蛋白，并尽可能提高蛋白质的产量。分离提纯某一特定的蛋白质，首先要使蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原有的天然状态（不失去生物活性）。为此，动物组织的细胞膜可用电动捣碎机或匀浆器破碎，细菌和植物的细胞壁可用超声波或加沙研磨等机械方法破碎，但更常用的是低温冰冻、化学试剂及溶菌酶处理。破壁后再用适当溶剂提取。,蛋白质分离纯化的一般原则,获得蛋白质溶液后，再用适当的分离方法将所需要的蛋白质和其他蛋白质分开。一般采用等电点沉淀法、盐析和有机溶剂分级分离，然后再用离子交换、凝胶过

8、滤等层析方法进行纯化。如果有必要和可能的话，还可用亲和层析以及各种电泳等方法进行高度纯化。蛋白质分离提纯的最终目标往往是制成晶体，尽管结晶并不能保证蛋白质的均一性，但是对蛋白质的纯化而言，结晶毕竟还是一个重要的步骤。因为结晶往往要经过反复多次的分级分离与提纯，直到某种蛋白质组分在数量上占优势时才能形成。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又是除去少量杂蛋白的有效措施。同时，由于变性蛋白不会结晶出来，因此蛋白质的结晶也是判断制品是否处于天然状态的有力依据之一。,蛋白质分离纯化的一般原则,蛋白质纯度越高，溶液越浓就越容易结晶。结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态。这可利用控制温度、加盐盐

9、析、加有机溶剂或调节pH等方法来实现。在制备具有生物活性的蛋白质（如酶制剂）时，需注意上述个步骤中蛋白质的变性、蛋白酶的作用以及微生物的污染等。,活性蛋白质的分离步骤,(1)生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等。(2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。(3)粗提:离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。(4)精制：可用层析法、电泳法等进行精制。(5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。,蛋白质分离纯化的方法,对于蛋白质分离与纯化的方法

10、，可以根据蛋白质的不同性质而加以选择。蛋白质的性质是指分子大小、溶解度、电荷、吸附性质及对其他分子的生物学亲和力等。,蛋白质分离纯化的方法,蛋白质分子都是大分子，在提取过程中，与混合物中的其他“杂质”相对分子质量相差较大，而且不同的蛋白质其大小也不同。根据这种性质而采用的分离方法有：,1.根据分子大小不同的分离方法,（1）透析和超过滤：是根据蛋白质分子不能通过半透膜的性质使蛋白质和其他小分子物质（如无机盐、单糖等）分开。常用的半透膜是玻璃纸、火棉纸等合成材料。透析是将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里放在蒸馏水或流水中，蛋白质溶液中的无机盐等小分子通过透析袋扩散入纯水中以除去小分子。超过滤

11、是利用外加压力或离心力使水和其他小分子通过半透膜，而蛋白质留在膜内。这两种方法只能将蛋白质和小分子物质分开，而不能将不同的蛋白质分离开。,（2）密度梯度离心：蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。如果蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，则质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，而每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时，即停滞不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区带。分成区带的蛋白质可以在管底刺小孔逐滴放出，分部收集，然后再对每个组分进行小样分析以确定区带位置。常用的密度梯度为蔗糖梯度，在管底的密度最大，向上逐渐减少。密度梯度离心时对蛋白质有一

12、种稳定作用，即可清除由于温度变化或机械振动引起的区带界面的扰乱。,（3）凝胶过滤：凝胶过滤又称分子筛层析。这是根据分子大小分离蛋白质混合物有效的方法之一。凝胶过滤是一种柱层析，柱中的填充物是大分子的惰性聚合物，最常用的有葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶等。葡聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物，它的“网孔”大小可以通过控制交联剂与葡聚糖的比例来达到。不同型号的葡聚糖凝胶装在层析柱中，不同分子的蛋白质混合物借助重力通过层析柱时，比“网孔”大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒的网格内，而被排阻在凝胶粒之外，随着洗脱剂通过凝胶粒外围而流出；比“网孔”小的分子则扩散进入凝胶粒内部，然后再可逆地扩散出来通过下层凝胶。这

13、样，由于不同大小的分子所经过路程不同而得以分离，大分子先洗下来，小分子后洗下来。,凝胶过滤层析原理,蛋白质分离纯化的方法,各种蛋白质的溶解度大小在相同的外界条件下，主要取决于它们的结构特点，例如分子中极性的亲水基团与非极性的疏水基团的比例，它们在蛋白质分子表面的排布等。因此，根据各种蛋白质的不同溶解度，选择适当的外部条件，即能加以分离。,2.利用溶解度差别的分离方法,（1）等电点沉淀法,由于蛋白质分子在等电点时净电荷为零，减少了分子间的静电斥力，因而容易聚集而沉淀，此时溶解度最小。由于不同蛋白质的等电点不同，所以调节pH达到某蛋白质的等电点时，则该蛋白质首先沉淀。这种方法分离出的蛋白质保持着天

14、然构象，改变pH又可以重新溶解。,（2）盐溶与盐析,中性盐对蛋白质的溶解度有显著的影响，这种影响具有双重性。低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，称为盐溶；高浓度的中性盐则可以降低蛋白质的溶解度，使蛋白质发生沉淀，这种由于在蛋白质溶液中加入大量中性盐，使蛋白质沉淀析出的作用称为盐析。对于难溶于水的蛋白质（如植物球蛋白），由于盐离子的加入增加了水溶液的极性，减弱了蛋白质分子间的作用力，从而促进其溶解；但当加入的盐溶液浓度达到一定程度后，再继续加盐，蛋白质的溶解度反而降低，自溶液中析出。这是因为高浓度的盐与水结合后降低了水的相对浓度，争夺了蛋白质分子水膜层的水分子；而且中性盐都是强电解质，完全解离

15、，离子浓度的增高大量地中和了蛋白质的表面电荷。换而言之，由于大量加入中性盐，破坏了蛋白质的稳定因素，因而发生沉淀。,不同蛋白质由于所带电荷不同以及水化程度不同，因而盐析时所需盐的浓度也不同。在蛋白质溶液中逐渐增大盐（常用硫酸铵）的浓度，不同蛋白质就会先后析出，这种方法称为分段盐析。血清中加入0.5饱和度的硫酸铵可使所有球蛋白沉淀下来，留在清液中的蛋白质可以再用饱和硫酸铵使之沉淀。临床上可用此方法来测定血清中清蛋白与球蛋白的比例，作为诊断的一个指标。,（3）有机溶剂沉淀法,在蛋白质溶液中，加入一定量的与水相溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力大，能夺取蛋白质颗粒上的水膜，使蛋白质的溶解度降低而

16、沉淀。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮等。由于有机溶剂往往能使蛋白质变性失活，因此宜用稀浓度有机溶剂，并在低温（04）下操作。,3.根据电荷不同的分离方法,根据蛋白质所带电荷不同进行分离的方法主要是电泳与离子交换法。电泳的原理与氨基酸的电泳相同。各种蛋白质在电场中的运动速度取决于缓冲液的pH值及蛋白质分子的大小。缓冲液的pH与蛋白质的等电点相差愈大，蛋白质带电荷愈多，在电场中的移动速度就愈快。各种蛋白质的等电点不同，在某一pH时，所带电荷不同，加之，分子大小也不完全相同，因而就可以通过电泳将它们分离。（1）毛细管区带电泳：最常见的模式，用以分析带电溶质。样品中各个组分因为迁移率不同而分成不同的区带。

17、为了降低电渗流和吸附现象，可将毛细管内壁做化学修饰。CZE分离多肽类物质主要是由不同组分中的化合物所带电性决定的，比传统凝胶电泳更准确。,蛋白质分离纯化的方法,3.根据电荷不同的分离方法,（2）毛细管等电聚焦电泳毛细管等电聚焦电泳，是通过内壁涂层使电渗流减到最小，再将样品和两性电解质混合进样，两个电极槽中分别为酸和碱，加高电压后，在毛细管内建立了pH梯度，溶质在毛细管中迁移至各自的等电点，形成明显区带，聚焦后用压力或改变检测器末端电极槽储液的pH值使溶质通过检测器。CIEF由于不同的蛋白、多肽的等电点不同，因此在具有不同pH值梯度的电泳槽中，其可在等电点pH值条件下聚集沉淀下来，而与其他肽类分

18、离开来。,3.根据电荷不同的分离方法,（3）毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳，在毛细管中装入单体，引发聚合形成凝胶，主要用于测定蛋白质、DNA等大分子化合物。另有将聚合物溶液等具有筛分作用的物质，如葡聚糖、聚环氧乙烷，装入毛细管中进行分析，称毛细管无胶筛分电泳，故有时将此种模式总称为毛细管筛分电泳，下分为凝胶和无胶筛分两类。CGE是基于分子筛原理，经十二烷基磺酸钠（SDS）处理的蛋白或多肽在电泳过程中因分子形状、相对分子质量不同而分离。,3.根据电荷不同的分离方法,（4）胶束电动毛细管层析胶束电动毛细管色谱，在缓冲液中加入离子型表面活性剂如十二烷基硫酸钠，形成胶束，被分离物质在水相和胶束相(准固定

19、相)之间发生分配并随电渗流在毛细管内迁移，达到分离。本模式能用于中性物质的分离。MECC的原理是在电泳液中加入表面活性剂，如SDS，使一些中性分子、带相同电荷分子得以分离。特别是对一些小分子肽，阴离子、阳离子表面活性剂的应用都可以使之形成带有一定电荷的胶束，从而得到很好的分离效果。有文献报道在电解液中加入环糊精等物质，可使含疏水结构组分的多肽选择与环糊精的环孔作用，从而利用疏水作用食多肽得到分离。,3.根据电荷不同的分离方法,用离子交换层析分离蛋白质也是根据其带电荷的情况。常用于蛋白质分离的离子交换剂有弱酸性的羟甲基纤维素和弱碱性的二乙基氨基乙基纤维素，前者为阳离子交换剂，后者为阴离子交换剂。

20、若将离子交换与凝胶过滤相结合，效果更佳。蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此间相反电荷的静电吸引，这与溶液的pH有关，因为pH决定离子交换剂与蛋白质的电离程度。盐类的存在可以降低离子交换剂的离子基团和蛋白质的相反电荷基团之间的静电吸引。因此，蛋白质混合物的分离可用改变溶液中盐类离子强度（加盐梯度洗脱）和pH来完成。对离子交换剂结合力最小的蛋白质，首先由层析柱中洗脱出来。,4.蛋白质的选择吸附,某些物质，例如极性的硅胶和氧化铝以及非极性的活性炭等粉末具有吸附能力，能够将其他种类的分子吸附在其粉末颗粒的表面，而吸附力又因被吸附的物质性质不同而异，吸附层析法就是利用这种吸附力的强弱不同达到分离的目的

21、。对蛋白质分子与各种吸附剂结合的真实性知道得还很少，但认为与非极性吸附剂作用可能主要是靠范德华力和疏水作用；而与极性吸附剂作用的主要作用力，可能是离子吸引和氢键连接的力。蛋白质提纯中使用最广泛和最有效的吸附剂是结晶磷酸钙，即羟基磷灰石。据推测，蛋白质分子中带负电荷的基团是与羟基磷灰石晶体的钙离子结合。蛋白质可用磷酸缓冲液从羟基磷灰石柱上洗脱下来。,蛋白质分离纯化的方法,5.根据配体特异性的分离亲和层析,亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法。它通常只需经过一步的处理，即可使某种待提纯的蛋白质从复杂的蛋白质混合物中分离出来，并且纯度很高。这种方法根据的是某些蛋白质所具有的生物学性质，即它们与

22、另一种称为配体的分子能特异而非共价地结合。例如，某些酶可以通过非共价键与其特异的辅酶牢固结合。,蛋白质分离纯化的方法,5.根据配体特异性的分离亲和层析,亲和层析的基本原理是：先把提纯的某一蛋白质的配体通过适当的化学反应共价地连接到像琼脂糖一类的多糖颗粒表面的官能团上，这种多糖材料在其他性能方面允许蛋白质自由通过；当含有待提纯的蛋白质的混合样品加到这种多糖材料的层析柱上时，待提纯的蛋白质则与其特异的配体结合，因而吸留在配体的载体琼脂糖颗粒的表面上，而其他的蛋白质，因对这个配体不具有特异的结合位点，将通过柱子而流出；被特异地结合在柱子上的蛋白质，可用自由配体的溶液洗脱下来。,蛋白质分离纯化的方法,超滤法生产分离大豆蛋白工艺流程,梯度分离溶提法分离小麦的蛋白的工艺流程,面粉磷酸盐缓冲液,离心分离,上清液（清蛋白、球蛋白）,沉淀,2mol/L尿素离心分离,上清液（醇溶蛋白）,沉淀,6mol/L尿素离心分离,上清液（谷蛋白）,沉淀,谢谢观赏！,