放射免疫分析技术.ppt

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1、第七章 放射免疫技术,第一节放射免疫技术 一、原理及分类 二、常用的放射性核素 三、标记物制备及鉴定 四、抗血清鉴定,第二节放射免疫分析 一、基本原理 二、实验方法及测定第三节 免疫放射分析 一、基本原理 二、IRMA与RIA的比较,思考题小结,免疫技术：以抗原-抗体反应原理为基础，对样品中相应抗原或抗体进行检测。标记技术：将可被探测的示踪物质用化学方法与化合物连接。标记免疫分析：用可微量或超微量检测的示踪剂标记抗原、抗体，检测免疫反应结果并确定待检物。,标记免疫技术基本概念,常见标记免疫技术,放射免疫技术酶免疫技术荧光免疫技术,第一节 放射免疫技术,早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理

2、的放射免疫分析(RIA)，稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析(IRMA)。该类技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大地推动作用。,放射免疫RIA以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。,免疫放射IRMA以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。,放射受体分析RRA(标记受体检测抗原)放射配体结合分析RBA（标记配体研究受体）,其它,一、放射免疫技术原理及分类,

3、二、放射免疫技术常用的放射性核素,125I(最常用)131I 3H 14C射线（电离辐射弱，对标记物的免疫活性影响小）（电离辐射强）理化性 活 泼 差核素丰度 90%20%半衰期 约60天 8天 12.3年标记方法 简 单 复 杂标记设备 低 廉 昂 贵测量条件 简 单 复 杂（晶体闪烁计数仪）（液体闪烁计数仪）,常用标记核素,核素丰度：类似于纯度概念，代表了某示踪物中具有放射性部分的比例，丰度的高低直接或间接地影响标记产物的比放射性。,三、放射免疫技术标记物制备及鉴定,标记物：通过直接或间接的化学反应将示踪物质连接到被标记分子上所形成的化合物。制备高比放射性、高纯度和完整免疫活性的标记物是高

4、质量放免分析的重要条件。,125碘-标记物的制备标记,125I-,化学或酶促反应，将放射性负电碘离子氧化成碘原子或正电碘离子，通过取代反应置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。,125I或125I+,125I-标记物（混合物）,Ch-T、LPO氧化,取代反应,直接标记法,三、放射免疫技术标记物制备及鉴定,使用无还原剂的高比放射性碘源被标记物用量要少ch-T用量要低控制总反应体积200l反应时间1-2分钟弱碱性反应条件,乳过氧化物酶（LPO）标记法：LPO催化H2O2释放活泼的新生态氧，后者使125I-活化成125I2/125I+而取代被标记物分子中暴露的酪氨酸残基苯环上的氢

5、原子。该法反应温和，可减少对被标记物免疫活性的损伤；酶活性有效期不长，稀释后即可终止反应，易于控制被标记物上125I的数量。,间接标记法,联接标记(bolton-Hunter)预先将125I用ch-T法标记琥珀酰胺酯，制成的125I 化脂功能基团可与蛋白分子上的氨基酸残基反应，从而使待标记物被碘化。,bolton-Hunter,优点；不足之处是标记物的添加基团可能影响被标记物的免疫活性,125碘-标记物的制备纯化,凝胶过滤法离子交换层析法 聚丙烯酰胺凝胶电泳 高效液相色谱法,聚合、损伤物,标记蛋白,游离125I,如标记反应混合液过葡聚糖凝胶G50柱层析，定时/定量逐管收集层析洗脱液，合并标记物

6、峰洗脱液，加入蛋白稳定剂后，分装低温保存。由于脱I-及自身辐射造成蛋白破坏形成碎片等，贮存一定时间后需重新纯化。,125碘-标记物的制备鉴定,标记物质量高比放射性高纯度完整免疫活性,放射化学纯度单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率（AcCL3/ALB沉淀所有蛋白，沉淀物放射性占待测样品总放射线的百分率）应大于95%也是观察标记物脱碘程度的重要指标,免疫活性标记物与抗体结合的能力标记物与过量抗体反应，与抗体 结合的标记物的放射性与加入标 记物的总放射线的百分比该值越大,标记物免疫活性好，应大于80%反映被标记物免疫活性受损情况,比放射单位化学量标记物中所含的放射性强度，也可理解

7、为每分子被标记物所挂放射性原子数目单位：Ci/g mCi/mg Ci/mmol 比放射性过高，将影响标记物免疫活性，因为辐射自损伤大。,计算法：依据标记反应中放射性核素的利用率（标记率）来计算标记物的比放射性.自身置换法：比较标记抗原与标准抗原的免疫活性来测定标记物的比放射性,结果准，测定复杂,比放射性计算法,结果欠准，计算简便,自身置换曲线 反应系统：限量Ab和递增剂量(cpm)的标记抗原标记抗原的结合率(B/T%)随标记抗原总量的增加而减少 若标记抗原与标准品抗原具有相同的免疫活性，两条曲 线平行,标准曲线 反应系统:抗体（限量）、标记抗原（定量）和剂量递增的标准抗原组成 标记抗原与抗体的

8、结合率(B/T%)随标准抗 原的增加而竞争抑制性减少,标准曲线与自身置换曲线平行表明在相同的放射性结合水平上，与抗体结合的标准抗原和 标记抗原的物质浓度完全相同计算置换曲线平行段某结合率的放射性强度(cpm/ml换算为nCi/ml)计算标准曲线平行段相应结合率对应的标准抗原化学量(ng/ml)以平行段多点结合率对应的放射强度和标准抗原量进行直线回归，其斜率即为比放射性(nCi/ng),比放射性自身置换法,四、放射免疫技术抗血清鉴定,抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定簇之间的结合强度用亲和常数Ka表示。单位为稀度单位（LM-1）Ka值高（10912L/mol）有助于提高灵敏度、精确度和准

9、确度,亲和性,亲合力高,亲合力低,放射免疫技术抗血清鉴定,特异性:指一种抗体识别相应抗原决定簇的能力交叉反应率：将反应的最大结合率抑制下降50%时特异性抗原与类似物的剂量（ED50）之比（例：胰岛素与胰岛素前体）抗体交叉反应程度直接影响测定结果的准确性,特异性,效价,结合50%标记抗原时，抗血清的稀释度,五、方法学评价,除了常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性之外，应注意以下指标：可靠性（validity）剂量-反应曲线(dose dependent curve)高剂量钩状效应（HOOK effect）,第二节 放射免疫分析,一、放射免疫分析基本原理,竞争性结合反应的经典标记抗原（Ag

10、*）和非标记抗原（Ag）与限量抗体(Ab)竞争性结合Ag*和Ag具有等同的与Ab结合能力,Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab结合位点，二者通过竞争方式与Ab结合；随着Ag增加，Ag*与Ab结合形成Ag*Ab复合物的放射量降低,二者变化成函数关系。,以未结合的Ag*为F，Ag*Ab复合物为B，则B/F或B/(BF)与Ag的量变存在着函数关系剂量反应曲线,注：T即是B与F的总和,二、放射免疫分析实验方法及测定,抗原抗体反应,Ag*,Ag,反应条件体积温度时间pH,Ab,(标准Ag/样品Ag),平衡/一步法非平衡/二步法,分离结合（B）、游离(F)标记物,二抗沉淀法,PEG 沉淀法,PR

11、(二抗+PEG)试剂法,活性炭吸附法,分离彻底，迅速分离试剂和过程不影响反应平衡效果不受反应介质影响 操作应简单、重复性好经济,测量、数据处理,晶体闪烁计数器 包括了NaI闪烁晶 体、光电倍增管 以及计数器测量的放射性信 号是仪器输出的 电脉冲数：每分 钟计数(cpm),计算,参数cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%),拟合,注：T即是B与F的总和,第三节 免疫放射分析,一、免疫放射分析基本原理,以过量125I标记抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应,用固相免疫吸附剂对B或F进行分离，其灵敏度和可测范围均优于RIA操作也较RIA简单。,单位点 IRMA,先用过量标记抗体与待

12、测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物；用固相抗原结合未结合标记抗体并将其分离,测定上清液的放射量,双位点 IRMA,先用固相抗体与抗原结合，再用过量的标记抗体与抗原的另一决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗弃剩余标记抗体，测固相上放射性。,二、IRMA与RIA比较,放射免疫分析技术的灵敏度高、特异性强、精密度好,常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长等诸多不足,RIA将逐渐被取代。,放射免疫分析技术的应用,1.放射免疫技术的核心是什么？2.制备放射性125I标记物的基本原理是什么？有哪些方法？3.评价1

13、25I标记物质量的指标有哪些？4.用于放射免疫技术的抗体应满足哪些质量标准？5.放免分析中标记/未标记抗原、抗体的用量特点及与免疫复合物的量变关系？6.反应结束后，如何将免疫复合物与游离标记物分离开？7.放射免疫分析实验中，如何确定待测抗原的含量？8.免疫放射分析与放射免疫分析的反应原理有何不同？9.闪烁计数器记录的信号即是放射核素的衰变吗？10.灵敏度、特异性和测定范围，免疫放射分析与放射免疫分析有何区别？,思考题,放射免疫技术的基本原理是放射性核素可探测的灵敏性、精确性与抗原抗体反应的特异性相结合，主要包括RIA和IRMA。RIA所用的标记物应具备高比活度、高纯度和完整的免疫活性；抗血清应具有较高的抗体亲和力、高度的特异性和适宜的工作滴度；标准品浓度需按标准进行标定；结合与游离反应物的分离（二抗法、PEG法、PR试剂法和固相法）应彻底、迅速、不影响反应平衡、非特异性低和操作简便。拟合标准曲线需根据不同检测项目和不同的要求选用恰当的反应参数。,小 结,