动物细胞培养的基本知识.ppt

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1、动物细胞培养的基本知识,一、培养细胞的生长类型,贴壁型细胞:附着在某一固相支持物表面才 能生长的细胞。悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而 在悬浮状态下即可生长的细胞。绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类型，如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长 兼性贴壁细胞,贴壁(粘附)型细胞,粘附:是大多数有机体细胞在体内 生存和生长发育的基本存在方式含义 两方面结果 基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须 粘附于一固相表面 才能生存和生长。,培养时：细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞。粘附(锚定或锚着)

2、依赖型(性)细胞：唯有粘附于固相表面才能生存的细胞,类型细胞在体内、外的粘附方式存在差异 体内：粘附是全方位，外形具有复杂的立体特征 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同 按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型,1、成纤维细胞型,胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。,小鼠成纤维细胞,皮肤成纤维细胞（100 倍）,体外培养的年轻和老的人成纤维细胞的显微形态 左边是只分裂了几代的年轻成纤维细

3、胞，呈现薄层、细长的形态；右边是分离了50次的老的成纤维细胞，开始衰退，并很快死亡。,2、上皮型细胞,细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。,3、游走细胞型,常具有胞质突起（伪足），呈散在生长，一般不连成片，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。单核巨噬细胞系统的细胞,4、多形细胞型,细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体为细长型，似丝状伪足。有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态

4、，可统归于此类。,（a）成纤维细胞型；（b）上皮细胞型；（c）游走细胞型；（d）多形性细胞型,细胞形态的影响因素,细胞种类血清成分培养液中的添加成分酸碱度气相环境温度条件,悬浮型,见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。,培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长 来自血，脾或骨髓 在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团 生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态 观察不方便,兼性贴壁细胞,既能贴壁生长又能悬浮生长 CHO细胞 小鼠L929细胞 贴附时：上皮或成纤维细胞

5、形态悬浮时：圆形,二、体外培养物的细胞生物学特点,总的：与体内仍有相似-体外培养的细胞仍存在细胞和细胞、细胞和基质的相互关系但有不同 相对孤立、相对单一 失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显,体外培养物的细胞生物学特点,体外培养 单个细胞也能生存和增殖 但单个细胞不是细胞永久存在的形式,培养的细胞之间仍有在形态和机能上的 相互依存关系,1.培养的细胞之间 仍有在形态和机能上的相互依存关系。在结构上，如：上皮细胞仍见有桥粒 在生理活动上，单个细胞虽能生长繁殖,但不如群体细胞能力强，当相邻细胞接触，便导致运动停止 细胞相互沟通生物信息的结果 2.培养的细胞和基质之间 对细胞外基质仍有依存性,

6、相互依存关系,但有不同 人工所模拟的条件与体内实际情况 仍不完全 相同 当细胞被置于体外培养后 久了,必然发生变化与体内主要不同 相对孤立、相对单一 缺乏体内的一些影响,主要表现 失去原有组织结构和细胞形 如：肌肉细胞纤维化 分化减弱或不显 出现类似“返祖”现象：细胞趋向单一化 或获得不死性 或变成具有恶性性状的细胞群 因此要正确认识体外培养细胞 是一种特定条件下生长的细胞群体,培养细胞的主要的生物学特点,培养细胞分化状态的变化：1、去分化（脱分化）2、不适应生长特点：1、贴附生长2、接触抑制3、密度依赖性,体外培养物的细胞生物学特点,体外培养生长生物学特征具有两重性 基本生物学特征 仍与体内

7、的细胞相似 培养物在体外条件下生长，许多生长生物学行为发生改变,培养细胞分化状态的变化,体内细胞-三方面的影响与调节:体外环境的影响 体内神经体液因素 的调节 细胞与局部微环境的相互作用 控制-维持着细胞的分化特征。体外培养时，失去了-分化特征逐渐减弱,去分化(脱分化):各种分化细胞，逐渐失去各自的形态与功能“个性”，表现出某种趋同性 如:培养的成纤维细胞 在适当刺激下，可分化为 其它结缔组织细胞和肌组织细胞，表现出类似未分化的间充质细胞的特性，返祖。,有2点1.但,去分化并不意味着完全返回胚胎时期的原始细胞状态如:高度分化的神经细胞和心肌细已经丧失的增生活性不可能恢复 但已经具备的生物电活动

8、特性不会完全失去,2.可重新表现出分化特点 如：把表皮细胞放在气液界面上培养，可分化成含大量角蛋白丝的角质细胞、内皮细胞，但，这种能力会随着培养时间延长 逐渐丧失总之，体外培养,使细胞结构与功能上的“可塑性”增大,防止去分化,提高细胞接种密度提高Ca2+浓度诱导分化的激素,贴附(粘附)和附着,粘附于固相表面是锚定依赖性细胞生命活动的基本要求，细胞被接种到培养器皿内以后首先要发生粘附(adherence)，是细胞培养以后能否成功的第一步.细胞悬液后耽搁得越久，越容易发生退化提供什么样的生长表面是细胞能否成功粘附的主要因素。,不同细胞的粘附能力不同 如巨噬细胞、成纤维细胞等粘附能力强能在数分钟至数

9、十分钟内粘附到固相表面 如神经元细胞、羊水细胞，粘附能力弱需要数小时乃至更长的时间才能粘附到固相表面 粘附能力强的细胞-粘附能力弱的细胞-可利用此特点（粘附：快、牢；慢、弱）分离、纯化细胞,细胞形态因是否贴附于底物而不同悬浮的细胞:基本圆形粘附和贴壁的细胞:扁平圆形 相差显微镜“亮圈”很快过渡-,贴附过程：4步吸附-接触-贴壁-扩展,影响因素 各种细胞不同 如接种30后第二瓶30(附着最强)巨噬细胞一成纤维细胞 上皮细胞血细胞(最弱)生物因素 血清、培养液中的促附着因子 机械，物理等其他因素因素 离心：促进附着 流动：培养液流动可阻止细胞附着 低温：可抑制附着,措施（因素）1.包被对分化程度高

10、、生长能力差的细胞 可在培养瓶皿表面包被有利于细胞粘附和 生长的生物活性物质 如:-通过其所带电荷先吸附-,培养的细胞再与其结合。血清内含有多种能够 促进细胞粘附的成分 细胞本身也可能产生一些粘附分子,2.减少接种时细胞悬液的量待细胞粘附和贴壁之后，再补充足够的培养液3.减少培养液中血清的含量 使培养液黏度降低4.培养液中离子成分及其浓度 如，培养液中的Ca含量过低时不利于 细胞的粘附、贴壁和铺展5.培养液的温度 低温会减低细胞的活动，妨碍黏附和贴壁,附着的条件 底物 细胞能在很多固体表面附着最终铺展的程度，取决于底物的性质影响因素：活性物质(贴附、伸展因子):血清、培养液中或细胞分泌的生物活

11、性物质被底物吸附后可利于细胞的铺展 细胞借助这些分子,可附着于各种”非特异性”的底物上 如Fn，胶原，聚赖氨酸 机械，物理因素,接触抑制和密度依赖性生长仰制,运动的接触抑制,密度依赖性生长仰制,增殖的密度抑制实验方法：3T3细胞，接种105于6cm培养皿，5d细胞计数 于加入10、20、30牛血清的 培养液中，结果：,结果：10血清：20hr后铺满 以后至5d 细胞数不再增加(细胞 数约1066cm皿)30%血清：以后经常换液至5d，细胞密度继续增加(可达6xl066cm皿)说明:密度抑制-铺满后不再增殖(分裂停止)血清可降低密度抑制,只加入于3T3停止生 长的培养液中细胞不生长 当再加入血清

12、 细胞又生长说明血清可消除密度抑制,(2)转化细胞的密度抑制降低 用此培养液 3T3细胞不再分裂增殖 当再加入10血清，3T3细胞可再增殖 表示血清可消除密度抑制 但当用此培养液，于转化的3T3细胞(SV3T3)却生长良好表示转化细胞密度抑制降低(血清需要降低)说明：转化细胞的密度抑制降低.可生长至较高的密度,总的说明：细胞生长有密度抑制血清可降低密度抑制转化细胞可降低密度抑制,四、培养细胞的生长和增殖过程,（一）培养细胞生命期（Life Span of Culture Cells）培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。,1原代培养（Primary Culture）期：,也称初

13、代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。,细胞群是异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。细胞克隆形成率很低，即细胞独立生存性差。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。,2传代期,在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。,为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世

14、界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代1050次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。,3衰退期：,此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。,在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获

15、持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite Cell Line），也称连续细胞系（Continuous Cell Line）。,无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。,（二）组织培养细胞一代生存期,所有体外培养细胞，包括初代培养及各种细胞系，当生长达到一定密度后，都需做传代处理。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞数量和细胞增殖速度等有关。在细胞一代中，一般要经过以下三个阶段：,1潜伏期（Latent Pha

16、se）：,细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关,贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。细胞贴附于支持物后，除先经过前述延展过程变成极性细胞，还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相。细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。,初代培养细胞潜伏期长，约2496小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅624小时；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相

17、开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。,2指数增生期,这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂（Mitotic Index：MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。,指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续35天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。,恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细

18、胞标志之一。肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（Piled up）。,细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（Density Inhibition），导致细胞分裂停止。因此细胞接触抑制和密度抑制是两个不同的概念，不应混淆。,3衰退期,细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入衰退期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期（Plateau）。衰退期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。,此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传12两代，通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。结果反而耽误了时间，这是在实验中应特别注意的。,