免疫功能讲座.ppt

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1、免疫学实验诊断及其在 临床诊断中的应用 Laboratory Diagnosis and Clinical Application of Immunology第二军医大学附属长征医院全军医学免疫中心 高春芳,临床疾病与免疫的关系 免疫系统性疾病 免疫缺陷病、免疫增殖病 免疫相关性疾病 自身免疫性疾病、变态反应性疾病 感染性疾病 应用免疫学技术诊断、治疗性疾病,临床免疫自身免疫病 内分泌免疫学变态反应性疾病 皮肤病免疫学免疫缺陷性疾病 免疫增殖性疾病 心血管病免疫学 呼吸免疫学移植免疫学 生殖免疫学肿瘤免疫学 神经免疫学传染免疫学 消化免疫学风湿病学 血液免疫学创伤免疫学 免疫治疗学肾病免疫学

2、免疫预防学,免疫学诊断的定义：用抗原、抗体结合的技术对与免疫有关的疾病，如免疫增殖病、免疫缺陷病、变态反应、自身免疫、传染病、恶性肿瘤等作出辅助诊断或特异性诊断。应用意义：1.直接测定免疫功能 2.检查致病因子 3.参考作用,免疫功能(immune function)体液免疫(humoral immunity)细胞免疫(cellular immunity)免疫球蛋白(immunoglobulin)T细胞(T-cell)补体(complement)细胞因子(cytokines),两种T辅助细胞不同的细胞因子产生谱 及不同效应,体液免疫测定免疫球蛋白定量散射及浊度测定技术 原理是根据抗原和抗体形成

3、的复合物粒子对光的散射和吸收度来判断待测抗原的量。测定散射光强度的方法称为nephelometry，测定吸收光强度的方法称turbidimetry。两种方法均可采用速率法（rate assay）即反应开始第1分钟内的光散射或吸收度或终点法（end-point assay），即反应终止时（一般为30min）的光散射度或吸收总量。通过微电脑对数据进行处理，即可知道被检蛋白质（Ig）的含量参考值：IgG 815 g/L,IgA 0.93 g/L,IgM 0.52.5 g/L,免疫球蛋白测定的临床意义免疫球蛋白升高 非特异性多克隆升高 特异性单克隆升高免疫球蛋白减低 细胞免疫缺陷、体液免疫缺陷、联合免

4、疫缺陷 免疫球蛋白缺陷病：无球蛋白血症、选择性IgA 缺陷症、选择性IgM或IgE缺陷,Recombination&Expression of Ig genes,免疫球蛋白正常合成 免疫球蛋白轻链、重链不在同一条染色体上。(-2;-22;H-14)轻链、重链的基因不连续，必须经过基因重排分别连在一起。同样按照DNAmRNA蛋白质这一生物合成的中心法则合成。重链、轻链分别在不同的核糖体(polysomes)上合成。合成后的轻链和重链在光面内质网装配成完整的Ig分子(H2L2)。装配好的Ig分子进入高尔基氏体进行糖基化，通过分泌泡送至细胞膜表面,在释放前可在细胞膜表面停留几个小时。,H链和L链的氨

5、基酸数量差别很大,合成的速度也不同,一般合成一条重链约需18分钟,而合成一条轻链只需10分钟,组成一条完整的Ig(两条重链和两条轻链)则有一条以上轻链过剩。多余、过剩的轻链由细胞膜分泌到胞外,再转入肾脏,约10在肾小管内分解代谢,80回吸收,由体内巨噬细胞吞噬降解，10从尿排出。因此,正常人尿中始终有微量轻链排出。正常人尿约含510g/ml,最大20g/ml,每天约排25mg/d。因为是正常合成,/也是2:1。这个含量用一般方法是无法测出的。,非特异性免疫球蛋白增殖病 肝病 自身免疫病 慢性感染 恶性肿瘤 免疫母细胞淋巴结病 AIDS,免疫指标不是肝功能的直接指标，但由于肝脏承担了体内蛋白质的

6、及其它物质的合成与代谢，因此能直接或间接地影响与调节机体的免疫状态，通过对血清Ig及补体的检测，可在一定程度上反映受检者肝脏的疾病和损伤。,血清蛋白电泳,肝病是导致外周血免疫球蛋白非特异性升高的六大病种之一。急性肝炎多以IgM升高（310天）。慢性肝炎IgG、IgA皆升高，以IgG为主。肝硬化则IgG、IgA、IgM皆升高，但以 IgA升高为显著。肝癌则IgM降低、IgA升高最明显。当然以上这些变化是相对而言，并不是绝对的。,肝脏不是免疫球蛋白的合成场所，但对血清中免疫球蛋白含量起重要的调节作用，这种调节作用表现在：影响肠道内抗原物质的吸收及处理;通过Kupffer细胞对抗原呈现特殊递呈作用;

7、门体静脉侧枝循环可将肠道来源的抗原直接 暴露在全身免疫系统而诱导机体大量抗体的产 生等。,特异性免疫球蛋白增殖症(单克隆增殖和恶性Ig增殖症)单克隆增殖是一个细胞在某一分裂阶段发生突变,然后急剧分化、增殖,并大量表达某种单一的Ig,这种恶性增殖具有如下特点:均一型 含量大(达到数克也可高达10余克)正常成分减少(正常值以下)比例失调(/或2:1)出现相关临床表现(骨骼、肾脏、血液等系统),当Ig异常表达时,可出现以下三个现象:被激活、突变的B细胞转化为前B细胞或浆细胞活性极高,可快速合成Ig,合成一条H链大约需要2.5分钟,合成一条L链则只需1分钟。如此,每合成一分子Ig则会剩余3条轻链,多余

8、的轻链由尿中排出,可达1mg/ml以上。由于突变和激活的细胞是单一克隆,按一个细胞一种抗体的原则,所表达的Ig均为单一产物,亦即一个型、一个亚型、一个基因型。因此,尿中出现的过剩轻链均属一个型。同样,血中增殖的Ig,多属一个型。血和尿中/决不是2:1或大于此或小于此。由于同种抑制和反馈抑制,当某一克隆细胞大量、快速增殖时,其他克隆细胞则会被抑制,大量的均一产物(Ig)也会反馈地抑制正常克隆的增殖和表达。因此,除单一克隆产物大量增殖外,正常Ig则会明显减少。,多发性骨髓瘤:发病机率和Ig含量一样,IgG型最多,IgA型次之,IgM型少见(7S),IgD更少,IgE型罕见(至今发现不过20例)。巨

9、球蛋白血症:属于IgM型,由于大量增殖,IgM可发生各种聚合,正常为19S,患者可出现24S,32S等多钟聚合体。淋巴瘤:有时慢性淋巴细胞恶性病变,也可出现多克隆增殖。,轻链病 可分型和型,亦有双克隆型。由于尿中出现轻链可分多克隆型、单克隆型,并随型在诊断中要分析清楚。轻链病的诊断必须符合以下三条才能作出决定:各种Ig正常或减少;血中和尿中出现一条轻链带(电泳后)临床上符合一个多发性骨髓瘤的诊断重链病:Ig有5种重链则应有5种重链病,但目前只发现了4种,最多的是重链病,已发现200余例,重链病已报告,重链病只有19例,重链病只有一例报告,重链病至今未见报告。,7S IgM病:IgM是19S,7

10、S是小分子IgM报告不 多,我国尚未发现。半分子病:按机率5种Ig皆可出现半分子病,但至 今只发现IgG(3例)和IgA(5例)半分子病。除了免疫分析有特点之外,其他基本上如MM选择性或链缺乏症:本病报告极少,BMG(良性M蛋白血症)或MGUS(不明意义的M蛋白症):属于一种良性异常增殖、性质不良、/值轻度变化,M蛋白3g/dL,骨髓浆细胞10等。,补体检查和有关疾病总补体活性测定 CH50单个补体成分定量 C4经典途径 B因子旁路途径 C3经典和旁路途径临床意义：补体减少：肾病、自身免疫性疾病、肿瘤、补体缺陷病。补体增加：少见，如肿瘤。,Two TypicalPathway for Comp

11、lement Activation,Common Pathway for complement activation,补体与肝脏的关系较免疫球蛋白更为密切，部分补体及其抑制因子由肝脏合成，肝脏的感染和炎症反应可刺激机体免疫系统，导致血清总补体活性及其它补体成分的含量增加，这种现象可见于预后较好的急性病毒性肝炎早期。当肝实质受到严重损伤时，补体成分的合成相应减少，这种减少往往在肝病的晚期，同时伴有显著的肝功能受损。此外任何造成肝实质损伤与肝脏流动力学变化均可导致循环免疫复合物在外周血中的积聚，其结果导致对补体的过量激活，使血清中补体含量消耗性降低，急性降低多见于急性重症肝炎，慢性消耗性减低主要发

12、生在多种补体成分自身免疫性疾病、自身免疫性肝炎、肝硬化及其它原因导致的肝病晚期。,细胞免疫功能测定,抗原特异T细胞检测,细胞毒性T细胞检测,流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）是八十年代发展起来的一项利用流式细胞仪进行分析的新技术。流式细胞术集激光术、微电脑、单克隆抗体技术、细胞色素化学于一体，形成了快速、准确的分析和细胞分选技术方法。FCM在临床和基础研究中的价值主要体现于免疫表型分析、DNA含量分析和细胞分选三个方面。其中免疫表型分析在细胞免疫功能测定中起着重要作用。,FCM原理 用细胞表面特异性单克隆抗体与细胞作用，再利用荧光结合的第二抗体与之作用。通过抗原抗体反应，使阳性

13、细胞标上荧光，此为间接标记法或将特异性单抗先标记上荧光再直接与细胞结合发光，此为直接标记法，当细胞流经流式细胞仪，激光束（488nm）对高速通过的细胞流照射，使荧光染料产生不同波长的散射光，光信号收集后经由PMT（光电倍增管）放大并加以分析处理，在短时可获取细胞大小、核质比、荧光强度和阳性百分比等数据。,流式细胞术的几个重要特点 标本只要是单细胞即可用于分析 极短时间内可分析大量细胞 可同时分析单个细胞的多种特征 定性或定量分析,FCM对细胞免疫功能的检测主要用于1、细胞分群和细胞亚群的分析 利用CD45/CD14可以分出外周血中的白细胞和单核细胞，在白细胞内利用CD3、CD19、CD20、C

14、D3/(CD16+56)+等标记进一步可分出T、B淋巴细胞和NK细胞等。在T细胞内又有CD4/CD8标志的T辅助/诱导和T抑制/杀伤亚群利用CD4/CD29、CD8/CD28标志可以将T4、T8进一步分出各亚群。2、检测淋巴细胞的活化 CD3/HLA-DR、CD3/CD25、CD69等都是活化T淋巴细胞的特异性标记，另有C17单抗是活化的细胞毒T淋巴细胞的标志物。其比值的改变对病情监测，疗效判断有重要的指导意义。3、一些特殊的标志如CD4/CD8比值是AIDS、自身免疫性疾病病程监测的重要指标。,当前流式细胞分析的发展趋势(1)从相对细胞计数到绝对细胞计数 淋巴细胞亚群、造血干细胞、网织红细胞

15、、血小板等从相对定量到绝对定量 定量抗体微球法 定量荧光素分子微球法从单色到多色荧光分析 特别适用于淋巴细胞亚群分析、白血病免疫表型分析、细胞功能评价,当前流式细胞分析的发展趋势(2)从细胞膜成分到细胞内成分分析 胞浆酶、细胞因子等多种成分分析 液体中可溶性成分的流式细胞术分析 流式微球分析 流式分子表型分析 Molecular phenotyping 用流式细胞计数检测细胞中特异性核酸序列或 特异性基因异常。分析表型与免疫表型分析技术相结合，对于分析特定细胞群的功能和特性提供广阔应用前景。,常用外周血表型分析值*CD分类 意 义 正常值（）X2S CD3 总T淋巴细胞 65.869.60 C

16、D2 花环形成细胞 77.469.27 CD4 T辅助/T诱导亚群 37.538.91 CD4+/CD29-辅助性T细胞 21.228.98 CD4+/CD29+辅助细胞诱导亚群 16.865.30 CD29 辅助和抑制细胞诱导亚群 59.4512.49 CD8 T抑制/T杀伤亚群 28.0110.13 CD8+/CD28-T抑制细胞亚群 16.969.35 CD8+/CD28+T杀伤细胞亚群 11.733.44 CD3-/CD(16+56+)自然杀伤细胞 16.278.50 CD19 总B细胞 11.743.37 CD25 IL2R链 14.340.41 CD4/CD8比值 1.530.71

17、,免疫学相关疾病的常用免疫学检测指标 变态反应性疾病 I、II、III、IV型变态反应性疾病 自身免疫性疾病 病毒性肝炎 肿瘤免疫,变态反应性疾患免疫学诊断一、型变态反应的检查（一）血清总IgE测定（二）过敏原特异性IgE测定（三）嗜碱粒细胞脱颗粒试验（四）嗜碱粒细胞组织胺释放试验（五）皮肤试验（六）过敏原鼻腔激发试验(七)多种过敏原测定,二、型变态反应的检查 型变态反应又称为溶细胞型，多引起血细胞减少。如溶血性贫血、粒细胞减少症、血小板减少性紫癜等。因而免疫诊断也以这方面最多。（一）Coombs试验 专门用来检查患者红细胞表面的结合抗体（直接Coombs试验）和血浆中的游离抗体（间接Coom

18、bs试验）。长期输血、病毒感染、药物或胶原病皆会出现抗白细胞抗体，这种抗体有的属于HLA不合造成，有的则属于细胞膜变性引起。检查的方法可用白细胞凝集试验或荧光抗体技术，有直接法（用患者白细胞）和间接法（用患者血清）两种。（二）血小板抗体的检查 多采用酶标记抗体（抗人IgG）与患者血小板作用，如在血小板表面有抗体存在，则结合成复合物，如底物显色则可根据显色的程度判定含量。其他还有血小板凝集试验、血小板抗体补体结合反应皆可应用。血小板抗体的检查对于判定血小板减少性紫癜极有价值。,三、型变态反应的检查 本型变态反应由免疫复合物沉积于组织局部，激活补体系统引起。检查的目的是在组织局部和循环中发现免疫复

19、合物。（一）循环免疫复合物（CIC）的检查 CIC的组成包含了抗原（内源或外源性）、抗体（多为IgG，亦有IgA、IgM，少量IgD）和补体（多为C3）三种成分.1、C1q结合法 2、胶固素放免法 3、聚乙二醇（PEG）沉淀法（二）局部免疫复合物检查法,四、型变态反应的检查 型变态反应又名迟发型变态反应，主要由T细胞参与发生。结核、麻风病、甲状腺炎及一些皮炎均可由此型变态反应引起。检测的方法有体内试验如OT试验，体外试验如淋巴细胞刺激试验。（一）OT试验 皮内注射一定量的旧结核菌素，若对旧结核菌素过敏，局部就出现红肿、硬结、水疱、糜烂，根据反应的强弱判断变态反应的强度。一般结核感染后48周就可

20、以出现阳性反应。（二）淋巴细胞刺激反应 体外用某种过敏原刺激淋巴细胞，淋巴细胞可出现转化反应，用3H胸腺嘧啶核苷（3HTdR）掺入法测定淋巴细胞转化程度，以此判断淋巴细胞对某种过敏原的过敏反应性。,自身免疫性疾病免疫学诊断 自身免疫病属于免疫功能调节紊乱，造成极为复杂的病理生理过程，涉及这一系统疾病不下30余种，几乎临床各科均有。其中较常见和典型的有SLE、类风湿性关节炎RA、免疫性溶血性贫血和桥本甲状腺炎。由于免疫调节紊乱，也影响到全部免疫环节，如T淋巴细胞、B淋巴细胞（体液免疫）、补体系统、吞噬细胞系统、CIC及自身抗体等。以下仅就自身抗体作简单介绍。,1、抗核抗体 这是最常见的一种自身抗

21、体，抗原成分较复杂，目前已知有抗DNA抗体（SsDNA和dsDNA）、抗RNP抗体、抗组蛋白抗体和抗着丝点抗体。抗核抗体强阳性者多为SLE，其次为硬皮病、干燥综合症、SLE、皮肌炎等。长期服用普鲁卡因酰胺、肼苯哒嗪亦可出现阳性，慢性肝炎也有30左右的阳性率。2、抗ENA抗体 也属于核抗原的一种，因系用盐水浸出的抗原，故称ENA。内含Sm抗原，RNP、SSA、SSB、Scl-70、Jo-1等，可用于SLE混合结缔组织病及干燥综合征等自身免疫性疾病的诊断和鉴别诊断。RNP只存在于混合结缔组织病，Sm（Smith，人名）只存在于SLE患者，SSA和SSB抗体用于干燥综合征的诊断，抗Scl70主要见于

22、进行性系统性硬化症，而抗Jo-1主要见于多发性肌炎和皮肤炎。,抗核抗体对不同疾病，其临床意义有所不同，并不是只要阳性就能明确所有自身免疫性疾病的诊断，根据文献报道及美国同行推荐，与抗核抗体相关的疾病情况见下表。,与IFANA阳性相关的情况 疾病名称 ANA阳性率（）1、ANA结果对诊断极为有用的疾病 SLE 95100 系统性硬化症（硬皮病）60802、ANA结果对诊断在一定程度上有用的疾病 干燥综合征 4070 特发性炎症性肌病（多发性肌炎或皮肌炎）30803、ANA结果对监测或预后有用的疾病 青少年慢性少关节炎伴发葡萄膜炎 2050 雷诺现象 20604、ANA阳性本身为其诊断标准之一的疾

23、病 药物诱导性SLE 100 自身免疫性肝病 100 混合性结缔组织病 100,5、ANA结果对其诊断没有意义的疾病类风湿性关节炎 3050多发性硬化症 25特发性血小板减少性紫癜 1030甲状腺疾病 3050盘状红斑 525感染性疾病 波动范围广恶性肿瘤 波动范围广硅胶隆胸病人 1525纤维性肌瘤 1525自身免疫性疾病患者亲属 5256、正常人群 1：40 2030 1：80 1012 1：160 5 1：320 3,3、RF 类风湿因子是一种抗变性IgG的抗体，本身属于IgM，是自身免疫病最常见的自身抗体之一，在RA、SLE、干燥综合征、结节性动脉炎、系统性硬皮病、混合结缔组织病、皮肌炎

24、等皆有较高的阳性率。4、抗平滑肌抗体 是一种有器官特异性而无种族特异性的抗体。临床主要用于慢性活动肝炎的诊断，有此抗体者常可作为自身免疫的指标。5、抗线粒体抗体 线粒体是各细胞内的细胞器，在肝病特别是胆汁性肝硬化，阳性率可达90以上，肝外阻塞性黄疸则阴性（短期），慢性肝炎阳性率也较高，常与抗平滑肌抗体、抗核抗体三者联合，用于肝病的诊断。,PBC与抗线粒体抗体(AMA)有关，高滴度的 AMA是PBC主要的血清学指标。AMA可被分为Ml-Mg共9个亚型，其中只有M2为PBC特异性抗体。M2的靶抗原为线粒体上的2-氧酸脱氢酶复合体(2-OADC)的一些组分。M2抗体阳性是PBC最早出现的异常变化(在

25、碱性磷酸酶升高之前)，M2不仅在PC诊断上具有重要价值，而且可能参与PBC的发病过程。,可能参与BEC的损伤的途径(1)IgA抗体的穿上皮细胞转运;(2)CD4+Thl细胞释放产生炎症效应的细胞因子，如IFN-、迟发型超敏反应;(3)CD4+Th2细胞释放IL-5，促进嗜酸性粒细胞的增殖 和杀伤效应;(4)CD8细胞毒性T细胞介导的溶解靶细胞效应;(5)NK、T细胞介导的针对表达有异常抗原的BEC的 ADCC效应。,有些现象提示感染可能参与PBC的发病:(l)PBC有成簇发病的倾向。PBC患者的家族成员的患病率显著增高。有PBC病人照顾者患PRC和配偶AMA阳性发生率升高的报道；(2)PBC低

26、发病率地区的居民迁到新地区后其PBC发病率往往与新地区趋于一致;(3)与病毒性肝炎类似，肝移植后的PBC病人免疫抑制冶疗增强，会导致疾病的提早复发。,(4)分析病人抗PDC-R2抗体的免疫球蛋白基因突变提示有外源性抗原的持续刺激，以选择产生高亲和力的抗体;(5)正常人血清中IgG3仅占1的总量的10%左右，在病毒感染时IgG3可显著增高，而PBC病人血清中的AMA主要为IgG3。,6、抗甲状腺抗体 有五种，即抗甲状腺球蛋白抗体、抗甲状腺微粒体抗体、抗甲状腺膜抗体、甲状腺刺激抗体及抗CA2抗体。桥本氏甲状腺炎阳性率90，其他自身免疫病也有不同浓度的这些抗体。7、抗中性粒细胞细胞浆抗体 其分为两种

27、，一是PANCA，指染色仅见于核周围者，二是CANCA，指荧光染着于细胞浆，PANCA阳性者多见于韦格氏肉芽肿，原发性肾小球肾炎及肺小血管炎者，还可见于感染性疾病、肾小球基底膜病及心脏瓣膜病等。8、抗磷脂抗体 多见于SLE、狼疮样疾病、慢性疾病如感染或肿瘤，多发性流产妇女中也可常检测出抗磷脂抗体。,病毒性肝炎的实验诊断 我国属病毒性肝炎高发区，全国有肝炎病人2700万人，每年新发病例900万人，HBsAg携带者达一亿二千万人。慢性肝炎中有5070有活性性病毒复制，30发展为肝硬化，510发展为肝癌，故我国又是原发性肝细胞癌的高发国家，慢性HBV携带者患肝癌危险性较非携带者高100倍。,HBV的

28、形态结构形态：球形颗粒，直径约42nm外膜：厚约7nm，HBsAg+脂类内核（核衣壳）：直径27nm，HBcAg、DNAP、病毒DNA、少量来源于宿主的磷酸激酶,HBV在血清中的存在形式完整的病毒颗粒(Dane颗粒)，如前述，能复制，有传染 性；乙肝表面抗原颗粒，为22 nm的小球型颗粒，由HBsAg和脂类组成，不含DNA，不能复制，不具有传染性*，数量最多；管型颗粒，长30-40 nm的，由HBsAg和脂类组成，不含DNA，不能复制，不具有传染性*，血清中数量最少。,HBV的基因结构 HBV基因组由一个双链缺口环型DNA组成，约有3,200个核苷酸，含有4个开放读码框(ORF)，分别为ORF

29、 S/PreS、ORF C、ORF P、和ORF X,分别编码外膜蛋白(根据起始位点不同分别为HBsAg、前S1、前S2)、核壳蛋白(HBcAg、HBeAg)、DNA聚合酶和X蛋白(X抗原，HBxAg)。,基因型1979年 第一个HBV DNA全序列1988年 日本学者将HBV分为A、B、C、D四个基因型。(Okamoto H,et al.J Gen Virol,1988;69:2575)1992年 增加E、F两型(Norder H,et al.Virol,1992;73:3141)临床意义 不同的基因型可能致病性不同，我国以B、C型为主，台湾发现：50岁以上的肝硬化和肝细胞癌的患者C型较多，

30、而50岁以下的肝细胞癌患者B型较多(Kao JH,et al.Gastroenterology,2000;118:554)。,目前实验室常用的至少有四对抗原抗体系统：HBsAg和抗HBs HBcAg和抗HBc HBeAg和抗HBe Pre-S2和抗Pre-S2。,HBsAg阳性的意义（1）HBV感染的潜伏期；（2）乙型肝炎急性期；（3）慢性或迁延性乙型肝炎活动期；（4）肝炎后肝硬化或原发性肝癌；（5）无症状HBsAg长期携带者。*（6)HBsAg阴性不能完全排除慢性乙型肝炎。,注意!一、血清分离不佳或用肝素抗凝血常导致HBsAg假阳性；二、HBsAg假阴性 常见的原因为：5%的急性感染者肝炎症

31、状出现后仍阴性，极少数的慢性感染者也为HBsAg阴性，这种情况需要检测抗HBc-IgM及HBV DNA；S基因突变导致HBsAg的氨基酸结构改变，由于多数商用试剂盒检测系统采用的为多克隆抗体检测HBsAg的a决定簇，这一区域的点突变即可导致临界测定值或阴性结果；由于慢性病毒携带者（低水平HBsAg携带者）或HBV感染潜伏期，HBsAg浓度低于检测水平的下限。,血清抗HBs检测的意义（1）在乙型肝炎感染率调查时,HBsAg、抗-HBs和抗-HBc均为感染率的指标。在这三项指标中,只要其中一项阳性,表示受过HBV感染。（2）抗HBs是对HBV免疫的指标,抗HBs阳性率和滴度表示人群的免疫状况。（3

32、）乙型肝炎的诊断和鉴别诊断,在HBV感染后3个月,血清中出现抗HBs。采集双份血清（急性期和恢复期）同时检测,抗HBs阳转，或恢复期与急性期比较,抗体滴度有4倍或4倍以上增长,表示这次感染为HBV感染。*（4）乙型肝炎疫苗免疫效果考察。在疫苗免疫前后,采集血清检测抗HBs,如抗HBs阳转或抗体滴度明显提高,表示疫苗免疫效果良好。否则免疫效果不佳。（5）对乙型肝炎预后的判断。抗HBs的出现表示疾病处于恢复期，预后较佳。,同时可检出抗HBs及HBsAg见于以下几种情形：急性HBV感染时一过性存在，两者浓度均很低（以免疫复合物的形式出现），以后再采血检测仅有抗HBs；前后或同时感染两种亚型HBV，H

33、BsAg短暂或持续存在反映其中一种亚型感染，抗HBs及HBsAg同时检出通常要持续很久，且浓度均很高；抗HBs假阳性；编码HBsAg的基因变异使得HBsAg抗原性改变，原型抗HBs不能将其清除。,抗HBc检测的意义（1）HBcAg是HBV感染和复制的标志之一，高滴度的抗HBc表示HBV现症感染，低滴度的抗HBc表示过去感染，常与抗HBs 并存。（2）高滴度的抗HBc-IgM是诊断急性肝炎的金指标，低度的抗HBc-IgM表示慢性肝炎急性发作。（3）血中HBcIgA的滴度与病毒复制不相关，与肝组织病变有明显的相关性，随病情恢复，HBcIgA消失，持续不降提示慢性化和病情进展。（4）在献血员的筛选中

34、是一项辅助指标。从血源血中检出高滴度的抗HBc,表示有传染性,此血源不能作输血用。,注意!A、临界阳性一般是假阳性，是由于IgM型引起的交叉反应。B、抗HBc阴性而HBsAg阳性一般发生在免疫缺陷病例，这时存 HBV复制的其他标志如 HBeAg及高滴度的HBV DNA。C、对抗HBc单独阳性，排除假阳性后，美国CDC有以下解释：急性感染后的恢复早期（窗期）在HBV急性感染消退时，HBsAg减少甚至消失，抗HBs尚未出现，抗HBc是唯一能检出 的特异性指标，此时抗HBc IgM也为阳性。被动转移：HBsAg携带者母亲所生的婴儿可因母体抗体被 动转移（抗HBc可通过胎盘）而呈现抗HBc单独阳性。远

35、期感染伴抗 HBs消失，这种情况通常在感染后多年才会 发生，且相当少见（0.5%）。远期感染伴有低水平HBsAg。HDV重复感染继发HBsAg产生下降,抗HBc始终不出现或延迟出现者占一定比例，可能系1.与抗原复合2.种族差异3.免疫缺陷，如化疗后4.基因变异,HBeAg：A.传染性：HBeAg是临床上表示病毒复制较为实用的指标，因此也反映了血清的感染性。慢性HBsAg携带者中，HBeAg及HBV-DNA检测可以用来评估其传染危险性，特别是对医务界的HBsAg携带者，非常有必要了解他是否会传染给他的病人，90%HBeAg阳性HBsAg携带者可以传染给她们的新生儿，而HBeAg阴性或抗HBe阳性

36、的孕妇中只有10%会传染给婴儿。B.预后：急性期HBeAg的消失通常伴随ALT的降低，预示着疾病的好转；HBeAg持续阳性超过12个星期提示HBV感染趋向慢性；HBeAg阳性的无症状者很少见；如果在慢性感染期HBeAg阳性，一般为慢性急性化或病人免疫缺陷，这种情况的病人如果又出现HBeAg的消失，则被认为是预后好的信号。,注意!前C区基因变异（如1896位gua变为-arg导致终止密码子的出现干扰了HBeAg的翻译）导致不能生成和分泌HBeAg，血清中HBeAg阴性，但这种突变并不影响乙肝病毒的复制，仍可形成完整的病毒颗粒，该种情况下尽管检测不到HBeAg，慢性HBV感染炎症反应也相当强。,抗

37、-HBe：A、反映血清感染性：通常情况下HBsAg（+）、抗HBe（+）病例的传染性较低，但有部分病例尽管抗HBe（+）也具有很高的传染性，因此，要评价HBeAg阴性血清的传染性，推荐用检测HBV DNA，1/3的病例能达到大于106基因组/mL；B、监视急性和慢性HBV感染：血清HBeAg消失、抗HBe出现对监视急慢性HBV感染很有诊断价值，特别是抗HBe出现更有预见价值，在干扰素治疗中出现表明疾病状况的改善；C、预后：抗 HBe阳转出现在HBeAg阴转后早期（2周内），可能预示急性肝炎恢复顺利；如出现在晚期（HBeAg阴转后6周以上）或不出现抗HBe，则提示病程迁延，可能发展为慢性迁延性肝

38、炎或慢性活动性肝炎。,注意!HBeAg（-）/抗HBe（-）的慢性HBV感染有不同的感染状态：有的表示复制病毒已清除，但无抗HBe应答；有的复制病毒一时减少，HBeAg消失后可再现；有的由于前C区变异不能编码合成HBeAg。,前S2抗原及抗体 pre-S2抗原检测可作为判断HBV复制的一项指标，同时可对HBV复制作出定量的推断，动态测定pre-S2抗原的变化，有助于急、慢性乙型肝炎的治疗预后的判断。抗pre-S2在急性乙型肝炎恢复早期出现，并发挥其保护性抗体的作用，对观察乙型肝炎病情进展、预后及疫苗免疫效果均有一定的作用。,常规检测HBV抗原抗体的基本解释HBsAg 急慢性HBV感染；可能具有

39、传染性；浓度降低表明感 染恢复HBeAg 反映HBV复制；有传染性；其消失表明急慢性HBV感染正在恢复抗-HBs 感染后免疫；对疫苗的免疫应答抗-HBe 表示HBV低复制或不复制抗-HBc 低滴度表示过去感染，高滴度表示现行感染抗HBc-IgM 高滴度是诊断急性HBV感染最好的指标，监视慢性HBV感染。,不同厂家和方法HBV标志物测定的比较 HBsAg 抗-HBsHBeAg 抗-HBe抗-HBc 进口 34 9 22 27 42 A 34 9 12 18 37 B 34 8 13 14 37 C 32 8 33 15 37 n=44 PCR:+26-18 前S1:+20-24 抗前S1:+12

40、-32,国产“两对半”试剂与进口试剂比较（阳性符合率%）A B C HBsAg 100(34/34)100(34/34)94.1(32/34)抗-HBs 100(9/9)88.9(8/9)88.9(8/9)HBeAg 54.5(12/22)59.1(13/22)(33/22)抗-HBe 66.7(18/27)51.9(14/27)55.6(15/27)抗-HBc 88.1(37/42)88.1(37/42)88.1(37/42),肿瘤的实验诊断 肿瘤标志物(tumor markers)是标志肿瘤存在的一些生化物质。从临床应用角度出发,它们主要是指那些在血浆或其他体液中可以检测到的有关物质。肿瘤

41、标志物研究的第一阶段 1846年 Bence-Jones 蛋白 19281932年提出与肿瘤有关的异位激素的存在如 ACTH,hCG等。1933年和1959年 报道与前列腺肿瘤有关的同功酶、前列腺酸性磷酸酶及组织分化同功酶。1960年 Newell 发现肿瘤的畸变染色体(philadelphia chromosome)。上述成果可视为对肿瘤标志物研究的第一阶段。当时尚没有先进的检测技术,这些发现难于在临床诊断中推广。,六十年代AFP和CEA的发现是肿瘤标志物研究的第二个阶段。伴随放射免疫分析技术的成熟,使AFP和CEA的测定达到很高的灵敏度并在临床上得到广泛应用,推动了肿瘤相关抗原的进一步研究

42、,使具有不同组织特异性的肿瘤标志物相继发现。,肿瘤标志物研究的第三阶段,是糖类肿瘤抗原,包括糖脂和糖蛋白。CA-125、CA19-9及CA-50的发现是肿瘤标志物研究第三阶段中具有代表性的成就。单克隆抗体技术的建立是这些重要发现的前提,故我们可以把1975年Kohler 与 Milstein 首次制备成功单克隆抗体作为肿瘤标志物研究第三阶段的起点。,肿瘤标志物可以分为两大类 由肿瘤组织产生 包括分化抗原(淋巴细胞表面标志);胚胎抗原(CEA及AFP);同功酶(如NSE及PAP);激素(如hCG及ACTH);组织特异抗原(如-乳清蛋白及PSA);癌基因及其产物(如SrC,N-myc 及H-ras

43、);粘蛋白或其他糖蛋白或糖脂(如CA-125,CA19-9,CA-50及CA15-3);多胺及唾液酸等。肿瘤与宿主相互作用而产生 肿瘤与宿主相互作用而产生或称为宿主反应标志物。包括血清铁蛋白、免疫复合物、急性期蛋白,同功酶(如LDH,GDH,CK-BB即乳酸脱氢酶,谷氨酸脱氢酶及肌酸激酸BB同功酶),和反应淋巴细胞和巨噬细胞免疫活力的白细胞介素-2受体(IL-2 receptor)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)及新喋呤(Neopterin)等。,肿瘤标志物的选择,HCC AFP结肠癌 CEA、CA199前列腺癌 PSA胰腺癌 HCG、CA199、CEA卵巢

44、癌 CA125乳腺癌 CA153胃癌 CEA小细胞肺癌 NSE,芯片技术现状及展望基因 蛋白质遗传信息携带者 生命活动的执行者 了解生命现象 解释疾病发生 提供疾病诊断和治疗手段,芯片技术用来诊断疾病已初露头角。包括基因芯片和蛋白质芯片两大类。简化检测程序、快速出报告、多指标同时检测、节省标本量、疾病易感性预测、药敏基因检测、疾病分型分类诊断等。数据分析是瓶颈，此外，还存在质控和标准化问题、假阳性及假阴性问题、资源数据库共享问题等。,实验室常用免疫学技术散射及浊度测定技术 免疫单扩散技术 免疫火箭电泳EIA和RIA 区带电泳技术免疫电泳技术 免疫固定技术 免疫印迹(Western Blot),单向免疫扩散,双向免疫扩散,双向免疫扩散,免疫电泳,对流电泳火箭电泳,血凝实验,补体固定实验,放射免疫分析,酶联免疫测定,直接及间接免疫荧光,免疫印迹,免疫沉淀,免疫固定电泳,复习思考题,影响检测有哪三方面因素？简述免疫球蛋白异常的临床意义,