HPLC法测定虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量[1][1].孔改doc.doc

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1、HPLC法测定降酶片中白藜芦醇和虎杖苷的含量刘德茂1 史德胜2（1大连公安医院，辽宁 大连 116011 2天津丹溪国药研究所 天津 300061）降酶片由虎杖、白花舌蛇草、柴胡、茵陈等中药组成，具有疏肝理气，清热利湿的功效，临床主治慢性肝炎及早期肝硬化。虎杖为其主药之一，白藜芦醇和虎杖苷为其中的主要有效成分，因此可选择白藜芦醇和虎杖苷作为其质量控制的定量指标。本研究建立了HPLC法测定其主要有效成分白藜芦醇和虎杖苷含量的方法。1.仪器与试剂LC10A型高效液相色谱仪；SPD10A紫外检测器；Anastar色谱工作站；乙腈为色谱纯，水为蒸馏水，其他试剂为分析纯。虎杖苷对照品（批号 11575-

2、200301），白藜芦醇对照品（批号 111535-200301）由中国药品生物制品检定所提供。降酶片由本院制剂室提供，批号060820、060821、060822。2.方法与结果2.1色谱分析条件：Irregular C18 柱 （4.6250mm 5）；流动相：乙腈：水（25：75）；流速：1.0mlmin-1；柱温：35；检测波长：306nm；进样量：20l；理论塔板数以虎杖苷峰计不低于3000，以白藜芦醇峰计不低于3000。2.2对照品溶液的制备：精密称取虎杖苷对照品8.04mg、白藜芦醇对照品6.12mg，分别置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液。各精密量取

3、3ml，分别置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。2.3供试品溶液的制备：取本品20片，研细，取50mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加甲醇适量，超声处理30分钟，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。2.4线性关系考察：分别精密量取虎杖苷对照品储备液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml置10ml量瓶中，白藜芦醇对照品储备液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别吸取20l进样，记录峰面积。以对照品的浓度为横坐标（X），以相应的峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，得回归

4、方程。虎杖苷：Y=38364300X5194.1，=0.9999，进样浓度在0.008040.04020mgml-1与峰面积呈良好的线性关系；白藜芦醇：Y=85777166 2272.48，r=0.9999，进样浓度在0.006120.03060mgml-1与峰面积呈良好的线性关系。2.5阴性对照试验：按降酶片的处方量制备不含虎杖药材的阴性对照样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液，吸取20l进样，按上述条件测定，结果表明，阴性样品中其他成分对虎杖苷、白藜芦醇色谱无干扰。2.6精密度试验：各取虎杖苷、白藜芦醇对照品溶液，进样20l，连续进样6次，测定峰面积，结果峰面积RSD分别为0.36

5、%、0.87%。2.7稳定性试验：对同一供试品溶液，按上述色谱条件，于0、2、4、6、8小时进样，测定峰面积。结果溶液8h内稳定，虎杖苷峰面积RSD为0.57%，白藜芦醇峰面积为0.86%。2.8重现性试验：取同一供试品样品平行制备6份供试品溶液，依法检测，测定虎杖苷、白藜芦醇的含量，结果虎杖苷的质量分数为24.22mg/g，RSD=1.05%。白藜芦醇的质量分数为18.61 mg/g，RSD=1.42%。2.9回收率试验：采用加样回收法。取已知含量的样品，分别加虎杖苷、白藜芦醇对照品适量，按样品测定项下方法测定虎杖苷、白藜芦醇的含量，计算回收率。结果虎杖苷平均回收率为100.44%，RSD为

6、1.67%；白藜芦醇平均回收率为101.02%，RSD为1.86%（n=6）。2.10样品的测定：将3批样品分别按供试品溶液制备法制成溶液，依上述色谱条件分别进样20l，以外标法计算样品中虎杖苷、白藜芦醇的含量，结果见表1，色谱图见图1。表1 降酶片中虎杖苷含量测定的结果（n=3） Table1 Analysis of content of Peceid and Resveratol in Jiangmei Tablet (n=3)批号 虎杖苷的含量(mgg-1) RSD（%） 白藜芦醇的含量（mgg-1） RSD（%）060820 24.25 1.49 18.62 1.81060821 24

7、.48 1.32 18.57 1.54060822 24.23 1.30 19.08 1.36 A B C D图1 虎杖苷对照品（A）、白藜芦醇对照品（B）、供试品（C）和阴性对照（D）的色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of Peceid reference substance (A), Resveratol reference substance (B),Sample（C）and Sample without Polygonum cuspidatum Sieb (D)3.讨论31一般白藜芦醇和虎杖苷都能同时存在于植物中，二者在一定外界条件下会相互转化。目前的研究表明反式异构体是其活性成分，现一般测定反式的白藜芦醇和虎杖苷的总量作为评价标准。在葡萄及葡萄酒中同时发现了四种异构体，而目前虎杖中的顺式白藜芦醇及其苷鲜见报道。因此用反式白藜芦醇及虎杖苷为指标性评价虎杖质量是很有必要且合理的。32本文建立了用HPLC法测定虎杖中白藜芦醇和虎杖苷的分析方法。选用甲醇超声提取30min为最佳提取方式，流动相为乙腈水（25：75，V/V），检测波长306nm，流速1.0mlmin-1，柱温35，同时测定虎杖中白藜芦醇和虎杖苷，分离度好，杂质峰干扰少，完全出峰时间在25min内。该方法快速、准确、可靠。原始邮件发件人：liudemao1963日期：2008.10.8