色谱分析法导论.ppt

《色谱分析法导论.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《色谱分析法导论.ppt（95页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、1,第十五章 色谱分析法导论,15-1 概 述15-2 色谱分离原理15-3 色谱法基本理论15-4 分离度15-5 气相色谱定性分析15-6 气相色谱定量分析,2,15-1 概述,一、色谱法（Chromatography）利用样品在两相间的分配来分离、分析多组分混合物的技术。色谱法是一种物理化学分析方法，它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别，当溶质在两相间作相对移动时，各物质在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离。,3,1.色谱法的产生及发展 色谱法是一种分离技术，它是俄国植物学家茨维特1906年创立的。分离植物叶子中的色素时，将叶片的石油醚（饱和烃混合物）提取液倒入玻璃管中，柱中

2、填充CaCO3粉末（CaCO3 有吸附能力)，用纯石油醚洗脱（淋洗）。色素受两种作用力影响。,4,（1）一种是CaCO3 吸附，使色素在柱中停滞下来（2）一种是被石油醚溶解，使色素向下移动 各种色素结构不同，受两种作用力大小不同，经过一段时间洗脱后，色素在柱子上分开，形成了各种颜色的谱带，这种分离方法称为色谱法。,5,固定相(stationary phase):CaCO3颗粒流动相(mobile phase):石油醚,6,茨维特在当时的实验中观察到4个色带，它们分别是胡萝卜素、叶黄素和叶绿素A和B。随着被分离样品种类的增多，该方法广泛地用于无色物质的分离，“色谱”名称中的“色”失去了原有的意义

3、，但“色谱”这一名称沿用至今。,7,1906年茨维特在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法。1952年Martin和Synge因色谱的理论与应用研究获得诺贝尔化学奖。,8,1952年，Martin和James发表第一篇气液色谱论文，首次用气体作流动相，配合微量酸碱滴定，发明了气相色谱，它给挥发性化合物的分离测定带来了划时代的革命。Van Deemter等对色谱理论的研究极大地促使色谱技术的发展。1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代色谱分析的建立。,9,1956年，荷兰的Van Deemter在总结前人工作的基础上提出速率理论。1957年戈雷(Gol

4、ay)发表“涂壁毛细管气液分配色谱理论和实践”论文，实现了毛细管气相色谱分离。1979年弹性石英毛细管应用于气相色谱。80年代将固定液固载化是毛细管色谱技术的又一个重要发展。它大大提高了色谱柱的稳定性,延长了柱寿命,提高了色谱性能。,10,二.色谱法的分类,1.按两相所处的状态分类,气相色谱(GC)液相色谱(LC),按流动相的状态分类,适用于气体和低沸点有机化合物的分析，仪器简单，操作方便，应用广泛。可在不同操作温度条件下使用。,11,按固定相不同又分为,气固色谱(GSC)气液色谱(GLC),液相色谱,液固色谱(LSC)液液色谱(LLC),适用于高沸点、不易气化的、热不稳定及生物活性物质的分析

5、，通常在室温条件下工作。,12,13,2.按固定相所处的外形分类,平板色谱,填充柱色谱毛细管柱色谱,薄层色谱和纸色谱,柱色谱,3.按组分在两相间的分离机理分类,吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、空间排阻色谱、毛细管电泳,14,15,三、色谱法的特点,1.分离效率高,复杂混合物、性质相近的有机同系物及旋光异构体等。对于那些性质极为相似的组分,如同位素、同分异构体,采用高选择性固定相，使它们之间的分配系数产生足够大的差异,从而实现良好分离。,16,多种高灵敏检测器，痕量杂质分析的有力工具。可以检测出ppt(10-9)级甚至ppb(10-12)级。,2.灵敏度高,17,4.应用范围广,可分析有机或无

6、机的气、液、固体试样,组分的定性较为困难,缺点：,3.分析速度快,解决方法：发展联用技术,18,四.气相色谱分析法与其它方法比较1.气相色谱法与分馏法的比较 色谱分离比分馏快，得到的物质纯度比分馏法高。石油化学家采用分馏法花了20多年才鉴别出石油中的200余种组分，而当今采用毛细管GC仅需数小时即可完成。,19,苯和环己烷的沸点仅差0.6，如用精馏分离柱进行分离是不可能的。,20,2.气相色谱法与经典化学分析的比较 化学分析根据物质具有某种独特的化学性质来进行测定,而色谱分析能使许多化学性质相同/相似的复杂组分相互分离后测定。3.气相色谱法与光谱、质谱分析法的比较 光谱、质谱主要是定性分析工具

7、,色谱是分离分析的工具。色谱法的最大优越性在于它最擅长分离分析多组分的复杂体系。,21,15-2 色谱分离原理,热力学因素：分配系数动力学因素：组分在色谱柱的扩散和传质,22,色谱分离过程简述 在色谱分析中，当流动相携带样品通过固定相时，样品分子与固定相分子之间发生相互作用，使样品分子在流动相和固定相之间进行分配。与固定相分子作用越大的组分向前移动越慢，与固定相分子作用越小的分子向前移动速度越快，经过一定距离后，由于反复多次的分配（柱色谱为103106次），使原本性质（沸点、极性等）差异很小的组分之间也可得到很好的分离。,23,分配系数的微小差异吸附能力的微小差异微小差异积累较大差异作用能力弱

8、的组分先流出；作用能力强的组分后流出,24,一、分离原理,固定相是多孔性的固体吸附剂颗粒，其分离是基于固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同；,1.气固色谱:,25,固定相由担体和固定液所组成，固定液涂敷在担体表面，其分离混合物是基于固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。,2.气液色谱:,26,试样中的各组分K值不同是分离的基础,二、分配系数和分配比,1.分配系数K(distribution coefficient),在一定温度和压力下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度比，称为分配系数。,一定温度和压力下，K越大，出峰越慢,27,2.分配比 k(distribution ratio),在一定

9、温度和压力下，组分在两相间分配达到平衡时，分配在固定相和流动相中的质量之比。,28,k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也取决于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。,29,3、分配系数和分配比之间的关系 分配系数K与柱中固定相和流动相的体积无关，而取决于组分及两相的性质，并随柱温、柱压变化而变化。容量因子k决定于组分及固定相的热力学性质，随柱温、柱压的变化而变化，还与流动相及固定相的体积有关。,30,理论上可以推导出：,Phase ratio(相比，b):

10、反映各种色谱柱柱型及其结构特征填充柱（Packing column）:635 毛细管柱（Capillary column）:501500,31,三、气相色谱流出曲线,1.基线(baseline),色谱柱中仅有流动相通过检测器时，所检测到的信号。,2.峰高,从色谱峰顶点到基线之间的垂直距离。,32,3.区域宽度,1）半峰宽（Y1/2）：,2）峰底宽（Wb）,色谱峰高一半处的宽度,色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距之间的距离。,33,气相色谱流出曲线,34,4.保留值(retention value),1）用时间表示的保留值,保留时间(tR)：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间。,不与固定

11、相作用的气体的保留时间。,调整保留时间(tR)：tR=tRtM,死时间(dead time,tM)：,35,2）用体积表示的保留值,组分从进样到柱后出现浓度极大值时所通过的流动相体积,VR=tRF0,色谱柱内未被固定相占据的空隙体积,调整保留体积(VR)：VR=VR VM,死体积(VM)：,VM=tM F0,保留体积(VR)：,36,tR=tM(1+k),3）相对保留值 r21,又称选择因子，只与柱温和固定相性质有关,表示了固定相对这两种组分的选择性,6.保留值与分配比 k 的关系,5.保留值与分配系数K的关系,37,色谱峰反映的信息：,1）根据峰的个数，判断样品中所含最少的组分数,2）根据保

12、留值对色谱峰进行定性分析,3）根据峰高或面积进行定量分析,38,15-3 色谱法基本理论,塔板理论(plate theory)速率理论(rate theory),39,一、塔板理论,塔板理论把色谱柱比作一个分馏塔，假设柱内有n个塔板，每个塔板高度称为理论塔板高度，用H表示，在每个塔板内，试样各组分在两相中分配并达到平衡，最后，挥发度大的组分和挥发度小的组分彼此分离，挥发度大的最先从塔顶（即柱后）逸出。尽管这个理论并不完全符合色谱柱的分离过程，色谱分离和一般的分馏塔分离有着重大的差别，但是因为这个比喻形象简明，因此几十年来一直沿用。,40,理论假设：,1）色谱柱由一块一块的虚拟塔板组成，在一个塔

13、板内组分在气液两相间可以很快达到平衡；,2）塔板内一部分空间由固定相占据，另一部分由流动相占据，称为板体积；,1941 Martin,41,5）分配系数在各塔板上是常数。,3）载气进入色谱柱不是连续而是脉动的，每次进气为一个板体积；,4）试样沿色谱柱方向的扩散可以忽略不计；,42,设色谱往由5块塔板（n5，n为色谱柱的塔板数）组成，并以r表示塔板编号，r0，1，2，nl；某组分的分配比k=1，根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下：开始时，若有单位质量的，即m1的组分加到0号塔板上，分配平衡，即mSmM0.5。,43,44,45,色谱流出曲线,将离开色谱柱物质的量作纵坐标，载气

14、塔板体积做横坐标得到色谱图,46,随着脉冲载气的加入，组分从色谱柱出口流出进入检测器。实际上，组分在柱内的分布就是二项式的展开式：,P为组分分配在液相中的质量，q为组分分配在气相中的质量。当n100，流出曲线的形状就呈高斯分布，一般气相色谱柱的n 约为103106。,47,对于色谱过程而言，n很大，采用数学上近似处理方法，可推导色谱流出曲线上任意一点样品的浓度值：,C色谱流出曲线上任意一点样品的浓度；n理论塔板数；m溶质的质量；VR溶质的保留体积；V色谱流出曲线上任意一点的保留体积,48,决定色谱峰最大浓度的因素：,l进样量越大，峰高越大；l相同保留时间，塔板数越大，峰高越大；l固定进样量和塔

15、板数，保留时间越小，色谱峰高且窄；反之，保留时间长的组分色谱峰低且宽。,49,由流出曲线方程可推出：,而理论塔板高度（H）即：,50,注意：同一色谱柱用不同物质计算可得到不同的塔板数。,有效塔板数,有效塔板高度,51,塔板理论的优点:,塔板理论是一种半经验理论，它初步揭示了色谱分离过程。塔板理论在色谱中的意义在于：色谱流出曲线符合高斯峰分布；塔板数作为衡量柱效指标是有效的；浓度极大点的位置Cmax符合实验结果。,52,2.用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。,1.柱长一定，有效塔板数 n 越大，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能越高。,3.柱效不能表示被分离组

16、分的实际分离效果。,53,塔板理论假设的缺点：在气相色谱中，忽略分子纵向扩散；流动相的运动是跳跃式的、不连续的假设显然违背了实际色谱过程；实际色谱过程难于达到真正的平衡状态；分配系数与浓度无关只在一定的范围内成立。,54,塔板理论的最大缺点：说明不了色谱流出曲线峰展宽的本质及曲线形状变化的影响因素；说明不了各种实验操作条件变化所引起的色谱峰峰宽变化的原因；无法把各种色谱参数与塔板高度定量地关联起来，特别是不能解释流速对柱效率的影响。,综上所述：塔板理论虽为半经验理论，但在色谱学发展中起到了率先作用和对实际工作的指导作用。,55,2.速率理论,前面已知，用塔板理论来说明色谱柱内各组分的分离过程并

17、不合理，因为色谱柱内并没有塔板。当同一试样进入同一色谱柱，当流动相速度变化时，得到不同的色谱图。测得的 n 和 H 也不同，充分说明塔板理论不足以说明色谱柱的分离过程。,56,1956年荷兰学者Van Deemter等人在研究气液色谱时提出色谱过程的动力学理论，它是在吸收了塔板理论中塔板高度概念的同时，考虑了影响塔板高度的动力学因素，指出理论塔板高度是峰展宽的量度，导出了塔板高度H与载气线速度u的关系式，即速率理论。,57,二、速率理论影响柱效的因素,H=A+B/u+Cu,H：理论塔板高度,u：载气的线速度(cms-1),A：涡流扩散项：,B：分子扩散项系数,C：传质阻力项系数,荷兰 Van

18、Deemter,58,1.涡流扩散项(eddy diffusion),气体碰到填充物颗粒时，不断改变流动方向，使试样在气相中形成类似“涡流”的流动，引起色谱峰的扩张。,59,A=2dp,：固定相的填充不均匀因子,dp：固定相的平均颗粒直径,固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n,对于毛细管柱，A=0,涡流扩散项系数,60,2.分子扩散项(molecular diffusion),61,B=2 Dg,：组分分子在柱内扩散路径的弯曲程度 有关的因子,Dg：试样组分在气相中的扩散系数(cm2s-1),填充柱色谱:=0.5 0.7,毛细管柱:=1,流速，滞留时间，扩散因子,扩散系数：Dg M

19、载气-1/2；M载气，B值,分子扩散项系数,62,分子扩散项B/u（纵向扩散项）,减小纵向扩散项u 采取措施：适当提高流动相流速u，减小保留时间 用相对分子质量较大的气体作流动相。适当降低柱温c。,63,3.传质阻力项,传质阻力系数C等于气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl之和：,C=Cg+Cl,64,气相传质阻力：是指组分分子由气相移动到气液两相界面进行交换，这一传质过程中所受到的阻力。,固定相颗粒越小 dp，Cg；Dg，Cg,65,Dl为组分在液相中的扩散系数，Dl，Cl,液相传质阻力：组分分子由气液两相界面扩散至固定液内部，进行质量交换达到分配平衡后，再返回气液两相界面的传质过程中

20、所受到的阻力。,df为固定相液膜厚度，df，Cl,66,传质阻力项Cu,减小采取措施：采用粒度小的填充物 Cgdp2 相对分子质量小的载气，DG大。Cg1/DG 降低固定液液膜厚度(Cldf2)并且液膜要均匀；若膜厚，扩散，费时；但不能太薄，否则包不住载体。DL越大越好，增加柱温是提高DL的方法之一。,67,范氏方程讨论：H=A+B/u+Cu 作Hu图,68,讨论1.曲线有一最低点 uopt(即Hmin)将方程微分:2.对开管柱(毛细柱)A=0 得Golay方程 H=B/u+Cu 对填充柱A项与u无关,决定于柱的填充情况,69,3.u很小时：Cu项可忽略,方程简化为:H=A+B/u 作H1/u

21、直线,斜率为B分子扩散项对H影响大4.u很大时:B/u项可忽略,方程简化为:H=A+Cu 作Hu直线,斜率为C，截距A传质阻力项对H影响大5.k 对板高H的影响(比较复杂):n随k的变化而变化,70,综合考虑:u实际稍高于uopt 因为:1.右侧曲线斜率小,u稍变 不会引起H的大变化 2.为提高分析速度 因为u 则tR,71,讨论：影响柱效的因素,1）被分离组分在色谱柱内的涡流扩散、分子扩散及传质阻力是造成色谱峰扩展，柱效下降的主要原因。,72,4）各种因素相互制约，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。,3）通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。,2）速率理论为色谱的

22、 分离和操作条件的选择提供了理论指导。,73,15-4 分离度,单独用柱效能或单独用选择性都不能反映组分的实际分离效果,因此引入综合性指标分离度,74,影响因素：,一、分离度的定义,区域宽度色谱过程的动力学因素决定,保留值之差色谱过程的热力学因素决定,75,色谱分离关系式设两相邻峰的峰宽相等，即w1=w2，k1=k2,又根据塔板理论得知：,76,77,选择性较差，柱效低，分离效果更差。,柱效较高，选择性较好,完全分离；,选择性 较差，柱效较高，基本完全分离,选择性 较好，但柱效较低，分离的不好；,78,Rs=1，分离程度98%；Rs=1.5，达99.7%,79,二、柱效能、选择性与分离度的关系

23、,柱效能n有效越大，越有利于分离；,选择性r21是两种组分能否分离的依据；,分离度Rs是色谱柱的总分离效能指标，可以判断物质在色谱柱中的分离情况，反应了柱效能与选择性影响的总和。,80,柱效能n有效很大，选择因子r21接近于1，可能分不开柱效能n有效很大，选择因子r21很大，分离得很好柱效能n有效很大，选择因子r21等于1，一定分不开柱效能n有效很小，选择因子r21接近于1，一定分不开柱效能n有效很小，选择因子r21很大，可能分开,81,例：在一定条件下，两个组分的保留时间分别为90秒和105秒，死时间为5秒，要达到完全分离，计算需要多少块有效塔板。若填充柱的塔板高度为0.1cm，柱长应是多少

24、？,解：,r21=(105-5)/(90-5)=1.18,=161.52(1.18/0.18)2,n有效=16Rs2 r21/(r211)2,=1547（块）,L有效=n有效H有效=15470.1,=155 cm,82,15-5 气相色谱定性分析,一、利用纯物质对照定性,比较试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质。,二、利用加入纯物质峰高增加定性,将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化，峰高增加的组分可能为这种纯物质。,83,三、利用相对保留值定性,相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关,四、利用保留指数定性,保留指数又称Kovats指数，是一种重现性较好

25、的定性参数。,将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以100（如正己烷的保留指数为600）。,84,保留指数测定方法：,通过选定两个相邻的正构烷烃，其分别具有Z和Z1个碳原子。被测物质X的保留时间应在相邻两个正构烷烃的保留值之间,85,色质谱联用仪；色谱-红外光谱仪联用仪,五、利用与其他分析仪器联用的定性方法,86,15-6 气相色谱定量分析,一、峰面积的测量,1.峰高乘半峰宽法,A=1.065 hY1/2,2.峰高乘平均峰宽法：,A=h Y1/2,A=h(Y0.15+Y0.85)/2,峰形对称，且不太窄,不对称峰,87,3.峰高表示峰面积法：,4.自动积分和微机处理法：,自动

26、处理数据，报出分析结果,峰形狭窄时，峰高定量法比面积定量法更准确,88,二、定量校正因子,1.绝对校正因子,物理意义：单位面积对应的物质量,fi与仪器灵敏度及操作条件有关，不易准确测定，也无法直接应用,89,2.相对校正因子,组分的绝对校正因子f i与标准物质的绝对校正因子f s之比。,1）质量校正因子,90,相对校正因子与操作条件、仪器灵敏度无关,2）摩尔校正因子,标准物：,FID 正庚烷,TCD 苯,91,仅适用于试样中所有组分全部出峰的情况,三、常用的定量方法,1.归一化法,92,2.外标法,外标法不使用校正因子，准确性较高，但操作条件变化对结果准确性影响较大,标准曲线法,93,3.内标法,适用于试样中所有组分不能全部出峰的情况，或仅对某几个组分进行定量,mi待测组份的质量 m试样质量 ms 内标物的质量,将内标物准确称量加入到准确称量的试样中，,94,内标物的要求：,2）与被测组分性质比较接近；,3）不与试样发生化学反应；,4）出峰位置应位于被测组分附近，且对各组分的峰无影响。,1）试样中不含有该物质；,准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大。,特点；,95,若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定，则：,准确称取一定量的试样m，加入一定量内标物mS,试样配制：,