制备了伤寒Vi多糖疫苗.ppt
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1、细菌性疫苗,杨丽华 2011年3月,1.死疫苗,2.活疫苗,3.蛋白类疫苗,4.多糖类疫苗,5.多糖蛋白结合疫苗,细菌性疫苗,国药长春所,细菌性疫苗种类,国药长春所,国药长春所,白喉疫苗,一、白喉概述二、病原学三、白喉杆菌的致病力及毒素产生的遗传学四、白喉毒素五、白喉类毒素六、生产工艺七、类毒素的质量检定,国药长春所,外毒素对神经系统损害,细菌产生的外毒素对心肌损害,外毒素对肾脏损害,白喉曾经是对儿童威胁非常大的传染病。它是由白喉棒状杆菌引起的一种呼吸道传染病,主要临床表现为上呼吸道发炎,常常表现在咽部,有时在鼻腔、喉部和气管,,白喉疫苗,国药长春所,白喉流行特点,1.传染原:白喉杆菌是严格寄
2、生于人类的细菌 没有中间宿主,病人及带菌者是唯 一的传染原。2.传播途径:主要是呼吸道飞沫传播,也可通 过被污的器具和食物传播。3.易感人群:人对白喉普遍易感,新生儿1岁时白喉易感性达高峰。,国药长春所,二、病原学,1.细菌形态 白喉棒状杆菌菌体一端或两端膨大呈 棒状,有着色较深的异染颗粒,革兰 氏染色阳性,白喉杆菌无动力,无荚 膜,不形成芽孢。,国药长春所,白喉棒状杆菌显微镜下形态,国药长春所,国药长春所,白喉棒状杆菌显微镜下形态,2.培养特性 白喉杆菌是需氧菌,最适温度为3435。能分解 葡萄糖、麦芽糖和糊精,产酸不产气,能还原硝酸 盐,不产生吲哚,不消化蛋白。3.抵抗力.白喉杆菌对抗生素
3、有不同程度敏感,对青霉素和 红霉素极敏感。.对消毒剂抵抗力弱,3苯酚10min可将该菌杀死.不耐热,58 10mi或100 1min即可被杀死。,国药长春所,二、病原学,三、白喉杆菌的致病力及毒素产生遗传学,1.致病力 自然界中动物不感染白喉,只能在敏感动物中造成 人工感染。猴、马、家兔和豚鼠对白喉敏感实验 室常用的动物是家兔、豚鼠和NIH小鼠。2.毒素产生遗传学 白喉是由白喉杆菌产生毒性很强的外毒素引起的。白喉杆菌的产毒基因是由嗜菌体携带。嗜菌 体感染无毒白喉杆菌后嗜菌体DNA与细菌DNA整合,形成溶原性白喉杆菌而获得产毒能力(PW8株目前 用于白喉类毒素生产)。,国药长春所,四、白喉毒素,
4、1.白喉外毒素为棒状杆菌-噬菌体tox基因表达 产物,可与细胞表面的特异性受体结合,干扰蛋 白质的合成,对人和动物都引起致死性毒性,如心脏、肾上腺、肝、肾、胰及神经组织等均 受到损害。2.白喉毒素是单一多肽,由560个氨基酸组成,分子量为62kDa,等电点pH4.1,在pH6时加热55 很快失活。3.通过物理和化学方法将其纯化。,国药长春所,毒素经甲醛处理后去除毒性 而保留免疫原性,五、白喉类毒素,国药长春所,甲醛浓度,PH,脱毒,影响脱毒因素,国药长春所,温度、pH和甲醛浓度等均影响脱毒效果,.温度越高脱毒越快,超过40影响抗原性,一般3738。.在酸性时脱毒较慢,但游离甲醛含量高,在 保存
5、过程中由于甲醛的继续作用,可导致脱 毒过甚,并影响毒素的稳定性;在碱性时脱 毒快,但抗原性损失较大,一般采用弱碱性。.甲醛浓度大则脱毒快,但抗原损失大。,国药长春所,温度升高游离甲醛的浓度低毒素纯度高,提高甲醛浓度、脱毒pH、脱毒温度和延长脱毒时间;增加非蛋白氮含量(于精制毒素中加入赖氨酸、精氨酸等),类毒素的毒性逆转,国药长春所,六、白喉疫苗工艺流程 菌种(PW8株)传代扩增 34代 发酵罐培养 3435培养对数生长 末期收获,甲苯杀菌。离心去菌体 收集清液 超滤浓缩 硫酸铵两段盐析 除盐除菌 氨离子及无菌检查 脱毒 甲醛液 37 脱毒试验(家兔)原液 检定(浓度、纯度、安全等)Al(OH)
6、3吸附 成品 检定(安全、效价等),国药长春所,七、类毒素的质量检定,1 絮状单位(Lf)是毒素或类毒素与抗毒素的结合单位,只能代表“量”而不能完全代表活性。使用抗毒素絮状单位标准品来测定类毒素的絮状单位。絮状单位测定 毒素或类毒素与相应抗毒素在适当的含量、比例、温度反应时间等条件下可在试管中发生抗原抗体结合,产生肉眼可见的絮状凝集反应,根据抗毒素絮状单位标准品可测定类毒素的絮状单位(Lf)值。2 纯度:1500Lf/mgPN3 安全性试验(豚鼠),国药长春所,七、类毒素的质量检定,4效价测定 类毒素刺激机体产生特异性抗体的免疫应答和对相应抗 体的特异性结合反应。小鼠Vero细胞法 将标准和待
7、检类毒素2倍稀释35个稀释度,皮下免疫N IH小鼠8只(0.5ml/只),免疫5周采血,根据vero细胞 生长情况,以标准品的效价为标准,用平行线分析法进 行结果计算。豚鼠毒素攻击法 皮下免疫豚鼠10只(1ml/只),免疫4周后用毒素攻击,观察5天根据存活率以标准品的效价为标准,用平行线分 析法进行结果计算。,国药长春所,百日咳疫苗,一、百日咳概述二、病原学三、百日咳疫苗发展简史四、无细胞百日咳疫苗、生产工艺流程、质量检定、APV的效果、接种不良反应,国药长春所,急性脑炎、呕吐、痉挛和昏迷,死亡或脑损伤,并发症肺炎形成肺气肿肺不张,甚至死亡。,营养缺乏症,百日咳是对儿童威胁非常大的传染病,它是
8、由百日咳杆菌引起的一种呼吸道传染病。,典型症状为突然阵发性痉咳,并带有吸气性尾声或伴有呕吐,可持续数月。,百日咳概述,国药长春所,百日咳流行特点,1.传染原:人是百日咳唯一的天然宿主百日咳 病人是传染原。2.传播途径:主要是呼吸道飞沫传播,也可通 过被污的器具和食物传播。3.易感人群:主要传染对象是6岁以下儿童,1 岁以内婴幼儿发病率50%。,国药长春所,二、病原学,细菌形态 百日咳菌呈革兰氏染色阴性,短杆状或椭圆形,国药长春所,生长特性,1.百日咳菌可分四种相变,相菌毒力最强有免 疫原性;相菌毒力消失,无免疫原性;相菌介于 相之间。2.百日咳菌是需氧菌,最适温度为3536,最 适。3.不发酵
9、任何糖类、不分解糊精,尿素盐,不液 化明胶不产生吲哚,不利用枸橼酸盐。,国药长春所,1百日咳相菌有两大类抗原 菌体O抗原 表面K抗原(荚膜物质)2百日咳菌可产生 外毒素(PT)内毒素 其他生物活性物质,据报道有25种之多。,、主要抗原和生物学活性,百日咳菌粘附在上呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖 重患(FHA PT PRN Agg)下呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖 细菌不进入组织和血液循环 干扰吞噬细胞功能 AC 分泌大量PT麻痹上皮细胞功能 TCT 产生血细胞增多损伤支气管血管周 HLT 细胞代谢发生变化 组织胺致敏性增强 围组织 分泌胰岛素增强和 血糖降低.,、致病机理,国药长春所,三、百日咳疫苗发展简
10、史,粗制百日咳灭活疫苗 第一次世界大战时期,在对病原菌的生物学构造及其 与 致病机理间的关系缺乏认识的前提下,凭经验制造的灭活 疫苗,工艺粗造、含量不确定。全菌体百日咳疫苗(WPV)以标准化方式生产的,制造疫苗的菌株必须含有123型凝 集原(Agg1、Agg2、Agg3)。经过50多年的临床应用证 明该疫苗的免疫效果是肯定的,但接种后的不良反应问题 一直未解决。无细胞百日咳疫苗(APV)20世纪80年代初期,对百日咳菌的成分及其所引起生物学 作用的认识,产生了APV。基因工程疫苗正在研究中。,国药长春所,四、无细胞百日咳疫苗,1981年日本的佐藤教授等人在纯化出PT和FHA两种抗原的基础 上,
11、在世界上第一次研制成功了含有两种抗原成分的无细胞百 日咳疫苗,并且与白喉和破伤风类毒素联合制成无细胞百白破 联合疫苗。该疫苗在日本开始正式使用,目前日本已经全部取 代了菌体百白破疫苗。1992年美国正式批准使用日本生产的无细胞百日咳疫苗。美国 获得生产许可证的APV还含有Agg2和PRN。目前WHO已经将其作 为儿童预防免疫推荐用疫苗。我国是于80年代中期开始研制无细胞百白破联合疫苗,90年代 中期获得正式生产文号。近期的临床试验证明含有5种保护性抗原(PT FHA PRN Agg2 A gg3)的APV效果最佳。,国药长春所,冻干百日咳菌种(相CS菌株)接种血培养基大管培养 36 48-72
12、小时培养 传代 接种发酵罐培养(综合培养基)培养48小时 收集培养物 第一段硫酸铵盐析及浸提 第二段硫酸铵盐析及浸提 透析 密度梯度离心 戊二醛脱毒 透析 超声 无细胞百日咳原液,、生产工艺流程,国药长春所,、质量检定,国药长春所,日本和中国的APV和DTPa按以上主要检定项目进行质量 控制。美国、欧洲一些国家及WHO推荐的毒性和效价测定方法 等与之不同。毒性试验仅要求做HST,效价测定采用EL ISA法检测疫苗注射小鼠后百日咳抗体应答水平。用小鼠脑腔保护力试验(MPT)评价疫苗效果,WPV 的 效价明显高于APV,而且并非所有的APV均可通过MPT试 验。因此还没有令人满意的针对APV疫苗的
13、效价试验方 法。免疫原性试验在衡量制品的一致性方面是有用的,但 与临床保护之间还缺乏相关性。,国药长春所,效价测定方法探讨,表明APV的保护效果是肯定的,能够达到WPA的保护水平。,、APV的效果,国药长春所,表明APV的不良反应明显低于WPV。,、接种不良反应,国药长春所,伤寒疫苗,一、概述二、病原学三、伤寒疫发展简史四、伤寒Vi疫苗,国药长春所,1.伤寒病是一种急性全身性感染,感染网状内皮细胞系统,肠道淋巴组织及胆囊,病原是伤寒沙门氏菌。2.传播途径是食入被污染的食物或水源。3.学龄儿童发病率最高,两岁以下儿童和35岁以上成人发病率低。,一、概述,国药长春所,典型的临床症状,国药长春所,二
14、、病 原 学,1.细菌形态 伤寒沙门氏菌是革兰氏阴性杆菌,有鞭毛,能运动。,国药长春所,伤寒沙门氏菌革兰染色,国药长春所,伤寒沙门氏菌电镜形态,国药长春所,2.培养特性在肉汤琼脂、马丁琼脂或其他适宜培养基上以易生长,需氧,适宜温度35-37,适宜的pH为7.07.2。发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇均产酸不产气;不发酵乳糖、蔗糖;氧化酶试验阴性。,1.鞭毛(H)抗原:为蛋白质,煮沸破坏,不受(1)甲醛影响。2.菌体(O)抗原:细胞壁部份,耐热,为脂多 糖(LPS)由多糖(重复寡 糖和核心寡糖)和类脂A组 成。3.莢膜(Vi)抗原:即荚膜多糖(CPS),是伤寒 杆菌细胞外壁的一种荚膜抗 原,Vi抗原与
15、其致病性有关 Vi来源于毒力的缩写。,抗原结构,国药长春所,血清学诊断,1.肥达氏试验(widal test)选择抗原的方法:.测定O抗体 用伤寒0901株(没有H和Vi抗原)用加热杀菌破坏H抗原(不耐热).测定H抗体 用伤寒S株(没有O菌体抗原)用甲醛处理伤寒沙门氏菌破坏O抗原 2.酶联免疫试验,国药长春所,1,2,3,4,全菌体灭活疫苗,口服Ty21a减毒活疫苗,伤寒Vi多糖疫苗,伤寒结合疫苗,二、伤寒疫苗的发展简史,国药长春所,1甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗,2.加热杀菌石碳酸防腐疫苗,3.丙酮杀菌疫苗,、全菌体灭活疫苗,国药长春所,甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗,50年代初期学自前苏联,为伤寒、副伤
16、寒甲乙三联疫苗。用甲醛杀菌,0.5石炭酸生理盐水制成。每毫升含伤寒沙门氏菌体原为1亿-亿;副伤寒甲乙由每毫升各亿-.5亿,细菌总量原三联疫苗为20亿-10亿。,国药长春所,加热杀菌石碳酸防腐疫苗,此法历史最久,1896年首创的伤寒疫苗即为此法制成,只用56水浴30in杀菌加石碳酸防腐制成。美国仍用此法制作标准品。,国药长春所,丙酮杀菌疫苗,1921年创制,认为对稳定Vi抗原有益,系将一份菌液加三份丙酮处理,然后抽气干燥制成。1943年首次在意大利使用,经世界卫生组织做现场考核,认为效果最好。,国药长春所,伤寒、副伤寒甲乙三联疫苗接种反应,实践证明,菌体疫苗预防伤寒效果肯定的,但接种后的严重反应
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