生物化学合工大第二章蛋白质化学.ppt

《生物化学合工大第二章蛋白质化学.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学合工大第二章蛋白质化学.ppt（91页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、第六节 蛋白质的三维结构,蛋白质分子的多肽链按一定方式折叠、盘绕或组装成特有的空间结构，亦称高级结构。蛋白质的高级结构即蛋白质的构象。,构象是指相同构型的化合物中，与碳原子相连的各原子或取代基团在单键旋转时形成的相对空间排布。构象的改变不需要共价键的断裂和重新形成，只需单键的旋转即可形成新的构象。,酰胺平面与-碳原子的二面角（和）,二面角 两相邻酰胺平面之间，能以共同的C为定点而旋转，绕C-N键旋转的角度称角，绕C-C键旋转的角度称角。和称作二面角，亦称构象角。,肽链的主链可看成是由被Ca隔开的许多平面组成的。,事实上，一个天然蛋白质多态链在一定条件下只有一种或很少几种构象，而且相当稳定。,维

2、持蛋白质分子构象的作用力,离子键,氢键,范德华力,疏水相互作用力,一、蛋白质的二级结构,（一）二级结构的概念 蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。,主要的化学键：氢键,1.a-螺旋(a-helix),2.b-折叠(b-pleated sheet),3.b-转角(b-turn),4.无规卷曲(nonregular coil),（二）二级结构单元的种类,1）绝大多数天然蛋白质都是右手螺旋。2）每隔3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈；每圈间距0.54nm，即每个氨基酸残基沿螺旋中心轴上升0.15nm，旋转100。,-螺旋结构的主要特点

3、：,1.-螺旋(-helix),3）每个氨基酸残基的N-H都与前面（C端）第四个残基C=O形成氢键。,4)螺旋体中所有氨基酸残基侧链都伸向外侧；链中的全部C=O和N-H几乎都平行于螺旋轴,氢键几乎平行于中心轴;,*R为Gly时，由于Ca上有2个氢，使Ca-C、Ca-N的转动的自由度很大，即刚性很小，所以使螺旋的稳定性大大降低。R基大(如Ile)也不易形成-螺旋。,*-螺旋遇到Pro就会被中断而拐弯，因为脯氨酸是亚氨基酸且有刚性的环状结构。,*带相同电荷的氨基酸残基连续出现在肽链上时，螺旋的稳定性降低。,侧链在a-螺旋结构的影响：,*R基较小,且不带电荷的氨基酸利于-螺旋的形成,如多聚丙氨酸在p

4、H7的水溶液中自发卷曲成-螺旋。,2.-折叠(-pleated sheet),-折叠是由两条或多条伸展的多肽链靠氢键联结而成的锯齿状片状结构。,在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm。,0.7nm,-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。,（a）平行式,（b）反平行式,-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。后者更为稳定。,3.-转角（-turn）,也

5、称-回折，存在于球状蛋白中。其特点是肽链回折180，使得氨基酸残基的C=O与第四个残基的N-H形成氢键。第二个氨基酸通常是pro。,-转角都在蛋白质分子的表面，多数为亲水氨基酸组成。,4.无规则卷曲（non-regular coil）,又称自由卷曲，是指没有一定规律的松散肽链结构，但是其结构是明确而稳定的，常常构成酶的功能部位。,无规卷曲常出现在a-螺旋与a-螺旋、a-螺旋与-折叠、-折叠与-折叠之间。它是形成蛋白质三级结构所必需的。,二、蛋白质的超二级结构,（一）超二级结构的概念 指蛋白质中相邻的二级结构单位(即单个-螺旋或-转角)组合在一起，形成有规则的在空间上能辩认的二级结构组合体。超二

6、级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域。,：由两股或三股右手螺旋缭绕而成的左手螺旋,：由两股折叠片，中间加入螺旋而形成的片层结构,：由三条或更多的反平行式-链通过-转角或其它的肽段连接而成的结构,（二）超二级结构的基本形式,超二级结构类型,1 2 3 4 5,指多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体，称为结构域（domain）。,酵母己糖激酶的三级结构,结构域之间有一段柔性的肽链相连铰链区，使结构域之间可以发生相对移动；结构域承担一定的生物学功能，几个结构域协同作用可体现出蛋白质的总体功能；结构域间的裂缝常为酶的活性部位，

7、也是反应物的出入口。,三、蛋白质的结构域,+结构域,乳酸脱氢酶结构域1,/结构域,丙酮酸激酶结构域4,3-P-甘油醛脱氢酶结构域2,木瓜蛋白酶结构域1,木瓜蛋白酶结构域2,无规则卷曲+-螺旋结构域,无规则卷曲+-回折结构域,三级结构（tertiary structure）：指的是多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上，主链构象和侧链构象相互作用，进一步盘曲折叠形成球状分子结构。,四、蛋白质的三级结构,（一）三级结构的概念,（二）球状蛋白的三级的结构特征,含有多种二级结构单元。,蛋白质的三级结构具有明显的折叠层次。,分子呈现球状或椭圆状。,（三）维持三级结构的作用力,二硫键 共价键,疏水作

8、用,非共价键（次级键）,氢键,离子键,范德华力,四级结构（quaternary structure）：由两条或两条以上具有三级结构的多肽链聚合而成、有特定三维结构的蛋白质构象。每条多肽链又称为亚基(subunit)。,五、蛋白质的四级结构,例如，血红蛋白的四级结构,（一）四级结构的概念,（二）蛋白质四级结构的特点,1）有多个亚基2）稳定性主要靠亚基间的疏水作用维持3）亚基单独存在时无生物活性或活性很小，只有通过亚基相互聚合成四级结构后，蛋 白质才具有完整的生物活性。4）亚基见具有协同性和别构效应。,蛋白质的空间结构,二级结构,超二级结构,结构域,三级结构,四级结构,六、蛋白质三维结构与功能的关

9、系,（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构,Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。,（二）血红蛋白的构象变化与结合氧,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,1.协同效应(cooperativity),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应(positive cooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应(negative cooperativity),血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环

10、的小孔中，继而引起肽链位置的变动。,变构效应(allosteric effect),蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。,2.波尔效应（Bohr）,1904年，Christian Bohr发现：增加CO2浓度、降低pH能显著降低血红蛋白与O2的结合。,？,生理意义：波尔效应使血红蛋白运输O2的效率提高。,2，3二磷酸甘油酸（BPG）通过与血红蛋白的两个亚基形成盐键稳定了血红蛋白的脱氧态构象，因而降低了血红蛋白的氧亲合力。,3.BPG的别构效应,（三）蛋白质构象改变与疾病,蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可

11、导致疾病发生。,蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。,疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,第七节 蛋白质的理化性质与分离纯化,一、蛋白质的理化性质（一）蛋白质的两性电离 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧

12、链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。*蛋白质的等电点(isoelectric point,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。,蛋白质的等离子点（特征常数）：指在纯水中（即没有其它盐类存在）蛋白质的正离子数等于负离子数的pH值。因蛋白质的等电点不是一成不变的，它随溶剂性质、离子强变等因素而改变。,二、蛋白质的胶体性质,由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的颗粒，因而具有胶体溶液的特征（布郎运动、丁道尔现象、不

13、能透过半透膜）。,1.蛋白质胶体稳定的因素可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒表面形成水化层，其可防止分子互碰而聚集；蛋白质在非等电点状态时带同种电荷，在颗粒表面形成电荷层，同性电荷互斥，使分子不能聚集。,水化层,蛋白质胶体溶液沉淀作用示意图,2.蛋白质的沉淀作用 如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。沉淀方法类别:高浓度中性盐（盐析）等电点沉淀 有机溶剂沉淀 重金属盐类沉淀 生物碱试剂和某些酸类沉淀 加热变性沉淀,盐析(salt precipitation

14、)是将高浓度硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等中性盐加入蛋白质溶液，使蛋白质表面水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。*分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几 种蛋白质分段析出。例如：血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。,3.沉淀类型A.可逆沉淀 在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部、空间结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于水溶液中。这种作用称为可逆沉淀反应。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质以及利用等电点的沉淀，提纯蛋白质时，常利用此类反应。B.不可逆沉淀/变性沉淀 在发生沉淀

15、反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解于原来溶剂或水溶液中的作用称为不可逆沉淀反应或变性沉淀。重金属盐、生物碱试剂，强酸、强碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在而并不析出，例如：在强酸碱中变性的蛋白质在强酸碱溶液中仍存在电荷效应，所以不表现为沉淀现象。相对地，沉淀的蛋白质也未必都已变性。,*蛋白质的凝固作用(protein coagulation)蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,（三）蛋白质的

16、变性与复性,蛋白质在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。,1.蛋白质变性的概念,2.变性的本质,破坏非共价键，不改变蛋白质的一级结构。,3.变性的因素 加热、有机溶剂、强酸、强碱、表面活性剂（如十二烷基硫酸钠即SDS）、还原性试剂（尿素、盐酸胍）、紫外线、机械力等。,4.变性蛋白质性质的改变 生物学功能的丧失（主要标志）；分子形状改变，肽链松散，反应基团增加，易被 酶消化；疏水基团外露，水化层被破坏，溶解度降低，易 形成沉淀析出，粘性增加，紫外吸收改变等；丧失结晶能力。,应用举例临床医学上，变性因素常被

17、应用来消毒及灭菌。此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,5.蛋白质的复性 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)，这种变性也称为可逆变性。,可逆变性作用,蛋白质复性,（尿素、-巯基乙醇）,（去除尿素、-巯基乙醇）,非折叠状态，无活性,天然状态，有催化活性,（四）蛋白质的分子大小,蛋白质是分子量很大的生物分子，相对分子质量大于6000，最高可达40000000（烟草花叶病毒）。目前常用的方法包括：扩散系数、沉降超离心、凝胶过滤、渗透压、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。,1.

18、根据化学成分测定最小相对分子质量 利用化学分析定量测定蛋白质中某一特殊元素的含量，并假定蛋白质分子中含1个这种元素，即可测算最低Mr。如：用化学分析法测定血红蛋白质中含Fe 0.34，则 最低 Mr=55.84100/0.34=16700；用其它方法测定，其实际Mr为16700的4倍，由 此可知，血红蛋白含有4个Fe的原子，而不是1 个 Fe。,2.超离心法在60 00080 000r/min 的高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动。超离心法最为准确，但需昂贵的超速离心机。用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度。蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关，因为沉降系数

19、S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。,离心机结构示意图,转头,转头腔,沉降样品,驱动马达,真空,冷冻,沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S表示。一个S单位，为110-13秒。相对分子质量越大，S值越大。蛋白质的沉降系数：1200S。超速离心法既可以用来测定蛋白质的分子量也可以用作分离纯化蛋白质。,v=沉降速度（dx/dt）=离心机转子角速度（弧度/s）x=蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）,由沉降系数S可根据斯维得贝格Svedberg方程计算蛋白质分子的相对分子质量：M=RST/D1i R：气体常数

20、T：绝对温度 D：扩散系数：溶剂的密度,3.凝胶过滤法凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构。一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大。测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex洗脱体积：自加入样品开始到该组分的洗脱峰峰顶（即收集液中该组分浓度最大时）出现时所流出的洗脱液体积。,测定样品蛋白质分子量的方法：测得几种标准蛋白质的洗脱体积Ve；以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线；再测出未知样品洗脱体积V

21、e；从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子 质量。,4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶：单体丙烯酰胺（acrylamide,简称Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide,简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合而成的高分子物质，具有三维网状结构和分子筛性质。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE）。SDS:十二烷基硫酸钠，变性剂普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形状）此方法只能测得亚基肽链的相对分子质量,方法：用SDS和巯基乙醇（

22、打开二硫键）处理 蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成 SDS-蛋白质复合物，使得不同蛋白质分子均带 负电（SDS带负电），且荷质比相同（蛋白质分 子大，结合SDS多；分子小，结合SDS少）；不同蛋白质分子具有相似的构象。用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们 的迁移率作图 测出待测样品的迁移率 从标准曲线上查出样品的相对分子质量,二、蛋白质的分离纯化,蛋白质分离纯化的一般原则 提纯的目标：尽量提高蛋白质的纯度或比活性，设法除去变性的和不需要的蛋白质，尽可能提高蛋白质的产量。根据蛋白质的性质加以选择，如分子大小，溶 解度、电荷、吸附性质及生物亲和力等。,一般程序：1、从组织细胞中溶解

23、放出蛋白质，并保持天然状态，常用低温冰冻、化学试剂及溶菌酶破壁、破膜，再用溶剂提取。2、分离所需要蛋白质与其他蛋白质 a 等电点沉淀 b 盐析和有机溶剂分级分离 纯化：a 离子交换层析 b 凝胶过滤层析 c 亲和层 析 d 电泳方法 3、结晶提纯 a 多次结晶，除杂蛋白和变性蛋白 b 结晶的最佳条件：略过饱和溶液 各步骤要求条件温和，并加少量杀菌剂。防止蛋白质变性、蛋白质酶作用及微生物污染。,（一）根据分子大小不同的分离方法 1.透析和超过滤 透析：根据的是蛋白质不能通过半透膜的性质，而 水和无机盐等小分子自由通过，此方法只能 将蛋白质和小分子物质分开，不能将不同蛋 白质分开。超过滤：是利用外

24、加压或离心使水和其他分通过半 透膜，蛋白质留在膜上。,透析与超过滤简易装置,2.密度梯度离心 a.蛋白质颗粒沉降不仅决定于它的大小也取决于 它的密度。b.颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时，即停止不前。c.在离心力的作用下，各种蛋白质在不同密度介 质中形成独立的区带。,3.凝胶过滤a.又称分子筛层析，是根据分子大小分离蛋白质 混合物最有效的方法之一。b.常用葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex)和琼脂糖凝 胶（商品名为Sepharose）。c.网孔大小用交联剂与葡聚糖或琼脂糖的比 例来实现d.大分子先洗脱下来，小分子后洗下来。,凝胶过滤法,（二）利用溶解度差别的分离方法 1.等电点沉淀 利用

25、各种蛋白质在等电点时，溶解度最小 这一性质，可以通过调节蛋白质溶液的PH 值，将不同的蛋白质分开。,2.盐溶和盐析 盐溶：低浓度的中性盐在蛋白质分子表面形成双电层，使蛋白质溶解度增加；盐析：高浓度的中性盐破坏蛋白质分子表面的水化层，使蛋白质溶解度降低，发生沉淀析出。分段盐析：不同蛋白质盐析所需的盐浓度不同，蛋白质溶液中，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。,3.有机溶剂沉淀法 a 有机溶剂（与水相溶）争取蛋白质颗粒上的水 膜，使之沉淀。b 有机溶剂：乙醇、丙酮 c 低温操作，边加入边搅拌，防止局部过热，引 起变性，尽量缩短处理时间。,（三）根据电荷不同的分离方法 1.电泳 原理与A

26、A的电泳相同 电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率不同，在电泳时可以分开。a.自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。b.区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进 行电泳，不同组分形成带状区域。1）纸电泳：用滤纸作支持物。2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作 支持物。,1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。2）平板电泳：铺有凝胶的平板上进行的电泳。,纯化中应用最多的是聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳，它们既可以作为蛋白质纯度检验方法，也可以纯化、制备蛋白质。,PAGE垂直平板电泳示意图,聚丙烯酰胺凝胶电泳具有三种物理效应：浓缩

27、效应 分子筛效应 电荷效应,等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。,通电,2.离子交换层析法 1）根据蛋白质带电荷情况 2）不同载体：离子交换纤维素 离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应 离子交换交联琼脂糖,离子交换层析法,（四）蛋白质的选择吸附分离 1 极性的硅胶和氧气铝以及非极性的活性碳等 具有吸附能力 2 吸咐层析法是利用物质与不同蛋白质的吸附能力的强弱不同达到分离目的。3 蛋白质提纯中，最广泛和最有效的是结晶磷酸钙即羟基磷灰石。,（五）根据配体特异性的分离亲和层析 1.是一种极为有效的分离方法 2.根据蛋白质分子能与另一种称为配体的分子特异而非共价地结合。3.

28、将某一蛋白质的配体经适当的反应共价地连接到如琼脂糖（凝胶）一类的载体表面。4.配体指能被生物大分子所识别并与之结合的 原子、原子团和分子，如：酶的作用底物、辅酶、调节效应物及其结构类似物，激素和受体蛋白、抗原和抗体互为配基。5.用含有自由配体的溶液洗脱蛋白质,亲合层析原理及流程示意图,三、蛋白质含量分析和纯度鉴定,（一）含量的测定 1.凯氏定氮法：2.双缩脲法 3.紫外线吸收法,4.福林酚试剂法：a 福林酚试剂包括两组试剂：碱性铜试剂和磷钼酸和磷钨酸的混合试剂 b 碱性铜试剂与蛋白质产生双缩脲反应 c 反应后的蛋白质的酚基在碱性条件将磷钼酸和磷钨酸还原为蓝色的钼蓝和钨蓝，蓝色的深浅与蛋白含量质成正比。,（二）蛋白质纯度的鉴定 常用聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳法 高纯度：电泳得到均一的一条区带 低纯度：电泳得到几条区带,本章重点:1.氨基酸的结构和性质2.蛋白质的结构、性质、功能3.蛋白质一级结构的测定4.蛋白质的结构与功能的关系5.氨基酸、蛋白质分离纯化的基本原理与方法,