固定化酶和固定化细胞.ppt

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1、第四章 固定化酶和固定化细胞（2学时）,主要内容：1 固定化酶的定义与优点 2 酶固定化技术发展史 3 固定化酶的制备方法 4 固定化酶的特性 5 固定化活细胞 6 酶催化反应器及其类型,游离酶的使用,蒸汽,酶解罐简易图,加热灭酶,酶无法回收,稳定性差,1 固定化酶的定义与优点,所谓固定化酶(immobilized enzyme)，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。,固定化酶的优点：,（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；（2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；（3）稳定性显著提高；（4）可长期使用，并可预测衰变的

2、速度；（5）提供了研究酶动力学的良好模型。,2 酶固定化技术发展史,1916年，Nelson和Griffin将蔗糖酶吸附在骨炭粉上，吸附以后酶不溶于水且具有和液体酶同样的活性，实现了酶的固定化，可惜长期未得到重视。,1953年Grubhofer和Schleith将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶等与这种载体结合，制成了固定化酶。60年代后期，酶固定化技术迅速发展，出现了很多新的酶固定化方法。,1969年，千畑一郎等将固定化氨基酰化酶应用于DL-氨基酸的光学拆分上，来生产L-氨基酸，开创了固定化酶应用于工业生产的先例。1973年，将固定化微生物细胞首次应用于工业生产。,目前，固定化技术已经取

3、得了许多重要成果，充分发挥了固定化酶和固定化细胞在改革工艺和降低成本方面的巨大潜力。但从目前的发展状况来看，尽管酶种类繁多，但已经固定化的酶却相对有限，采用固定化酶技术大规模生产的企业尚属少数，真正在工业上使用的固定化酶还仅限于葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等为数不多的十几个酶种，故仍需大力研究开发使更多的固定化酶和细胞能适用于工业规模生产。,应用现状：,3 固定化酶的制备方法,酶的固定化方法主要可分为四类：吸附法、包埋法、共价键结合法和交联法。对于特定的目标酶，要根据酶自身的性质、应用目的、应用环境来选择固定化载体和方法。,在具体选择时，一般应遵循以下6个原则。,（1）酶与载体的结

4、合部位不应当是酶的活性部位，固定化时应采取尽可能温和的条件。（2）酶与载体必须有一定的结合程度，利于反复使用。（3）用于固定化的载体必须有一定的机械强度，不易破坏或受损。（4）固定化应尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高催化效率和产物的量。（5）所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反应。（6）固定化酶的成本适中，以利于工业使用。,3.1吸附法,吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法。酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相互作用、离子键和氢键等。吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。,物理吸附法是通过物理方法将酶直接吸附在水不溶性载体表面

5、上而使酶固定化的方法。是制备固定化酶最早采用的方法。常用的载体：纤维素、胶原、淀粉及面筋、活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。优点：操作简单、价廉、条件温和，载体可反复使用，酶与载体结合后，活性部位及空间构象变化不大，固定化酶活力较高。缺点：酶和载体结合不牢固，在使用过程中容易脱落，常与交联法结合使用。,（1）物理吸附法,离子吸附法(ion adsorption)是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法，即通过离子键使酶与载体相结合的固定化方法。DEAE-纤维素吸附的-淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。具有操作简便、条件温和、酶活力不易丧失

6、等优点。此外，吸附过程同时可以纯化酶。,（2）离子吸附法,3.2包埋法,包埋法是将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法。前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型。,（1）凝胶包埋法,凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶或树脂。,1-2%海藻酸钠+酶液,E,E,E,E,5%CaCl2溶液,（2）微胶囊包埋法,微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半透膜微胶囊内的方法。它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外的环境直接接触，从而

7、增加了酶的稳定性。常用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素等。适合于小分子为底物和产物的酶的固定化。如脲酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、过氧化氢酶等。,3.3共价键结合法,共价键结合法(covalent binding）是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。酶蛋白上可供载体结合的功能基团有以下几种：（1）酶蛋白N末端的-氨基或赖氨酸残基的-氨基。（2）酶蛋白C末端的-羧基、天门冬氨酸残基的-羧基以及谷氨酸残基的-羧基。（3）半胱氨酸残基的巯基。（4）丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基。（5）组氨酸残基的咪唑基。（6）色氨酸残基的吲哚基。（7）苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环。,其中最普遍的共价

8、键结合基团是氨基、羧基以及苯环。常用来和酶共价偶联的载体的功能基团有芳香氨基、羟基、羧基和羧甲基等。这种方法是固定化酶研究中最活跃的一大类方法，但必须注意，参加共价结合的氨基酸残基应当是酶催化活性非必需基团，如若共价结合包括了酶活性中心有关的基团，会导致酶的活力损失。,用共价键结合法制备的固定化酶，酶和载体之间都是通过化学反应以共价键偶联。由于共价键的键能高，酶和载体之间的结合相当牢固，即使用高浓度底物溶液或盐溶液，也不会使酶分子从载体上脱落下来，具有酶稳定性好、可连续使用较长时间的优点。但是采用该方法时，载体活化的难度较大，操作复杂，反应条件较剧烈，制备过程中酶直接参与化学反应，易引起酶蛋白

9、空间构象变化，酶活回收率一般为30%左右，甚至酶的底物的专一性等性质也会发生变化，往往需要严格控制操作条件才能获得活力较高的固定化酶。,3.4交联法,交联法（cross-linking）是使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。由于酶蛋白的功能团，如氨基、酚基、巯基等参与反应，所以酶的活性中心构造可能受到影响，使酶明显失活。常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、异氰酸衍生物、双偶氮联苯和N,N-乙烯双顺丁烯二酰亚胺等，其中使用最广泛的是戊二醛。戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生Schiff反应，形成薛夫碱，从而使酶分子之间相互交联形成固定化酶。,以上四种固定化酶方法各有其优缺

10、点（见表4-1）。往往一种酶可以用不同方法固定化，但没有一种固定化方法可以普遍地适用于每一种酶。在实际应用时，常将两种或数种固定化方法并用，以取长补短。,4 固定化酶的特性,4.1固定化酶的形状,固定化酶的形式多样，依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。其中颗粒占绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产，如装成酶柱用于连续生产，或在反应器中进行批式搅拌反应；薄膜主要用于酶电极，应用于分析化学；酶管机械强度较大，亦宜用于工业生产。,4.2酶活力,固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，其原因可能是：酶活性中心的重要氨基酸残基与水不溶性载体相结合；当酶与载体结合时，它的高级结构发生了变化；酶

11、与底物间的相互作用受到空间位阻的影响。也有在个别情况下，酶经固定化后其活力升高，可能是由于固定化后酶的抗抑能力提高使得它反而比游离酶活力高。,4.3固定化酶的稳定性,4.4固定化酶的反应特性,固定化酶的反应特性，例如，底物特异性、酶反应的最适pH、酶反应的最适温度、动力学常数、最大反应速度等均与游离酶有所不同。,（1）底物特异性,固定化酶的底物特异性与底物分子量的大小有一定关系。一般来说，当酶的底物为小分子化合物时，固定化酶的底物特异性大多数情况下不发生变化。而当酶的底物为大分子化合物时，如蛋白酶、-淀粉酶、磷酸二酯酶等，一般随着底物分子量的增大，固定化酶的活力下降。这是由于载体引起的空间位阻

12、作用，使大分子底物难以与酶分子接近而无法进行催化反应，酶的催化活力难以发挥出来，催化活性大大下降。例如，糖化酶用CMC叠氮衍生物固定化时，对分子量8000的直链淀粉的活性为游离酶的77，而对分子量为50万的直链淀粉的活性只有15%17。,（2）反应的最适pH,酶被固定后，其最适pH和pH曲线常会发生偏移。一般来说，产物为酸性时，固定化酶的最适pH与游离酶相比升高；产物为碱性时，固定化酶的最适pH与游离酶相比降低。,（3）反应的最适温度,固定化酶的最适反应温度多数较游离酶高。如色氨酸酶经共价结合后最适温度比固定前提高515，但也有不变甚至降低的。固定化酶的作用最适温度会受固定化方法以及固定化载体

13、的影响。,（4）米氏常数,酶经固定化后，酶蛋白分子的高级结构的变化以及载体电荷的影响可导致底物和酶的亲合力的变化。使用载体结合法制成的固定化酶Km有时变动的原因，主要是由于载体与底物间的静电相互作用的缘故。,（5）最大反应速度,固定化酶的最大反应速度与游离酶大多数是相同的。有些酶的最大反应速度会因固定化方法的不同而有所差异。,5 固定化活细胞,20世纪70年代，在固定化酶的基础上科学家们研制成固定化细胞（Immobilized Cell），并且用于生产。直接固定那些含有所需胞内酶的细胞，并且利用这样的细胞来催化化学反应。70年代末，法国研究成功固定化细胞生产啤酒，80年代初我国居乃琥等用固定化

14、细胞批量生产啤酒和酒精取得重要研究成果。固定化细胞按其生理状态又可分为固定化死细胞和活细胞两大类。,固定化细胞的优点和缺点：,固定化活细胞,必须保持菌体的完整，防止菌体的自溶，否则影响产物的纯度；必须抑制细胞内蛋白酶对目的酶的分解；胞内多酶的存在，会形成副产物；载体、细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍等。,无需进行酶的分离和纯化，减少酶活损失，降低成本；可进行多酶反应，且不需添加辅助因子；活细胞保持了酶的原始状态，稳定性更高，对污染的抵抗力更强；细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快等等。,物理吸附法包埋法,6 酶催化反应器及其类型,以酶为催化剂进行反应所需要的设备称之为酶催化反应器，简称酶

15、反应器。,6.1酶反应器的类型,酶反应器有两种类型：一类是直接用游离酶进行反应，即均相酶反应器；另一类是应用固定化酶进行的非均相酶反应器。均相酶反应能在批量式搅拌桶反应器或超滤膜反应器中进行，而非均相酶反应则可在多种反应器中进行，适用于连续催化反应，包括：连续流搅拌桶反应器、填充床反应器、流化床反应器、连续搅拌桶-超滤和循环式反应器等。,6.2反应器的结构特点,这类反应器结构简单，造价较低，传质阻力很小，反应能迅速达到稳态，主要应用在饮料等食品工业中。其缺点是操作麻烦，在反复回收过程中固定化酶容易损失，所以工业规模的固定化酶很少采用。但是，常用于游离酶。,图4-2 批量式搅拌桶反应器,6.2.

16、1 批量式搅拌桶反应器,这种反应器在运转过程中，底物以恒定的流速流入反应器，与此同时，反应液则以同样的流速流出反应器。反应桶内装有搅拌器，使反应组分与固定化酶颗粒混合均一，出口处有过滤膜，可使不断补充新鲜底物与反应液流量维持动态平衡，如图4-3。,6.2.2 连续流搅拌桶反应器,图4-3 连续流搅拌桶反应器,6.2.3 填充床反应器,图4-4填充床反应器,PBR具有高效率、易操作、结构简单等优点。它适用于各种形状的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以及有产物抑制的转化反应。,其缺点是传质系数和传热系数相对较低。当底物溶液含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用,目前工业生产及研究中应用最为普

17、遍的反应器。,流化床反应器,图4-5 流化床反应器,主要被用来处理一些粘度高的液体和颗粒细小的底物，如用于水解牛乳中的蛋白质。同时，亦可用于需要供气体或排放气体的酶反应（即固、液、气三相反应）。但因FBR混合均匀，故不适用于有产物抑制的酶反应。,6.2.5 连续搅拌桶-超滤反应器(CSTRUF),图4-6 连续搅拌桶-超滤反应器,适用于颗粒较细的固定化酶、游离酶和细胞以及小分子产物与大分子底物。如：纤维素的连续糖化、-淀粉酶水解淀粉,循环反应器（Recycle Reactor，RCR）,外循环反应器,内循环反应器,循环操作仍能为底物与酶提供足够的接触机会，以达到所需的转化率。这种反应器可用于难

18、溶或者不溶性底物的转化反应。,6.3膜式反应器,膜式反应器是20世纪70年代以来发展起来的一种新型反应器，它是利用膜的分离功能，同时完成反应和分离过程的一种反应器。膜式反应器的类型：根据酶的存在状态、相数、膜组件型式、膜材料类型、耦合方式、传质推动力等的不同，酶膜反应器有不同的分类方式。根据膜组件的型式不同，可把酶膜反应器分为板框式、螺旋卷式、管式和中空纤维式酶膜反应器。以下以螺旋卷膜式反应器和中空纤维膜式反应器为例来说明。,（1）螺旋卷膜式反应器,此反应器的螺旋结构是将含酶的膜片与支持材料交替地缠绕在中心棒上。所用的膜片一般是胶原蛋白；而支持材料则是一种称为凡克塞的惰性聚合网状物。把上述螺旋

19、元件装进圆筒，筒两端加盖板，并安装进出口管，这样，就制成了螺旋卷膜式反应器。,螺旋模型可将流体流动的单元分隔成许多独立空间，改善接触效果，消除短路；另外，网状支持材料可以提高每一流动间隔的混合效果，加快物质传递。,（2）中空纤维膜式反应器,外层：,中空纤维膜,用这种固定化酶填充的反应器可以提供较大的催化表面，缺点：中空纤维的制造极为困难，难以保证纤维束内流体流动的均匀性，以及存在较大的物质传递阻力等。,6.3.2 膜式反应器的特点,（1）膜的选择透过性使某些组分(如产物)连续脱除，使反应转化率不受化学平衡转化率的限制，提高了反应的转化率。（2）酶膜反应器可将目的产物分离出去，而酶可以重复利用，

20、可实现连续操作，并有可能提高复杂反应的选择性。（3）膜作为酶的固定化载体可以使酶在类似生物膜的环境中高效发挥作用。（4）可实现对流传质代替自由扩散，强化了传质速率，提高了反应速率。（5）可以简化工艺流程和操作步骤，降低生产成本和增加产量的作用。（6）膜作为相分离器和相接触器，避免了乳化和破乳等问题，也摆脱了液泛的限制。,但是膜反应器在使用过程中也存在着一些问题，这些问题严重制约了膜反应器的推广应用：膜孔分布与形态结构的均一性差，造成酶分子和小分子激活剂(金属离子或辅助因子等)的泄漏损失。酶在膜表面的随机吸附引起酶空间构型的改变或活性位点的遮蔽，降低或破坏酶的催化活性。酶分子在酶膜反应器中容易因湍流等原因而发生剪切失活。有些情形下，由于产物分子在靠近膜面的位置逐渐积聚而形成凝胶层，造成酶膜反应器中严重的产物抑制。浓差极化和膜污染使酶膜反应器的传质速率和生产能力急剧下降，膜孔堵塞、膜厚增加使膜的结构形态发生不利变化，膜需要频繁地清洗或更换。,6.3.3 膜式反应器的应用,其在食品中的应用如：透过果胶水解来降低果汁粘度；通过将乳糖转化为可以消化的糖类来降低牛奶和乳清中乳糖的含量；通过多酚化合物和花色素的转化来进行白酒的处理；从牛奶产品中去除过氧化物等。,本章重点：,1、固定化酶的优点及应用实例。2、酶被固定化后的理化性质的变化，对工业应用的利弊？,