固定化酶与固定化细胞.ppt

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1、第四章固定化酶与固定化细胞,本章内容,酶的固定化(1)为什么要固定化?(2)怎样固定化?(固定化方法)(3)固定化酶的特性细胞的固定化(1)细胞固定化所用的方法(2)固定化细胞的特性辅酶的固定化,什么是固定化酶？,指固定在一定载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。,一 酶的固定化,直接利用微生物酶,（1）不稳定。在高温、高压、强酸、强碱下。（2）易失活。即使在最适合的条件下反应。（3）回收困难。用适当方法提取目的产物后，残存酶回 收困难。（4）反应速度减慢。不容易和毒副分子和产物分离.（5）经济上不合算。一次性反应后不能再次使用。,阻碍了微生物酶的应用和发展。研制固定化酶和固定化菌体,(一

2、)为什么要固定化?,(一)为什么要固定化?,在一定程度上可以改善酶的稳定性；可以多次反复使用，有利于采用连续操作工艺，从而使酶和细胞的使用率提高，降低生产成本；酶和细胞不混入产物，可精简产物分离工序。,(1)固定化在一定程度上可以改善酶的稳定性,固定化增加了酶的耐热性（热变性原理）固定化增加了酶对蛋白变性剂（尿素，盐酸胍）等的抵抗能力固定化减少了蛋白酶的作用（阻碍了活性部位的接近）,(2)固定化使酶和细胞的使用率提高,江南大学的孙志浩通过卡拉胶包埋的方法，使酶的重复利用30个批次后活性没有明显减少，大大促进了酶的利用率，加速了工艺工业化进程,(3)可精简产物分离工序,底物和产物更容易和酶分离,

3、(二)怎样固定化?(固定化方法),固定化的第五种方法变性法,在不使用载体的情况下，借助加热、冰冻或-射线等物理手段，也可通过添加柠檬酸、各种絮凝剂、交联剂或变性剂处理，使细胞内起破坏作用的蛋白酶变性、细胞结构固定和菌体聚集成大颗粒达到固定化的目的。此法制备的细胞一般只用于完成单酶或少数几种酶催化反应。,(1)吸附法,物理吸附是通过氢键、疏水键和电子亲和力等物理作用力将酶固定于不溶性载体的方法。常用的载体有高岭土、皂土、硅胶、磷酸钙胶、氧化铝、微孔玻璃等无机吸附剂 离子交换吸附是在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换剂的相互作用而达到固定化的一种方法。最常用的交换剂有CM纤

4、维素、DEAE纤维素、DEAE葡聚糖凝胶等。,蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。载体：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比 小分子慢得 同时对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越 强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小 和总吸附面积的大小。,影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素,吸附法特点,优点：操作简便，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心不易破坏，有利于制备高活性酶缺点：载体与酶的结合力较弱，在高离子强度下酶易从载体上脱落,吸附法（制备

5、的工艺）,水相固定化法 这是最常见的吸附固定化方法，即将酶溶解于缓冲液中，加入载体，振荡或搅拌一定时间后，抽滤、洗涤、冷冻干燥即可得固定化酶 载体表面涂布法 将酶溶入少量缓冲液中，加入载体，混合均匀，冷冻干燥可得固定化酶。此法相当于直接将酶涂布于载体上，避免了水相固定化中酶的大量流失溶剂沉淀法 即在低温下向含有载体的脂肪酶液中加入酶的有机溶剂作沉淀剂(如丙酮)使酶析出，沉淀在载体表面。此法所得固定化酶酶活性较高，载体性质对固定化无明显影响，但酶在载体表面分布不均匀,吸附法（制备的工艺）,游离固定化法 将具有一定亲水性的载体分散于疏水溶剂中，另将酶粉溶入少量缓冲液的酶液加入，振荡可搅拌一定时间后

6、，便得固定化酶。其原理是：亲水性载体可在其表面形成一层水膜，酶分子不溶于溶剂，只能存在于这层水膜中，因而可以完全被固定化 微晶体法 将可结晶的物质和酶溶液混合在一起，然后滴入亲水有机溶剂中，当可结晶物质结晶析出时，酶就有规则吸附在晶体表面上电沉积法。在酶溶液中放置两个电极，在电极临近加入载体，通电后，酶移向电极，并沉积到载体表面的固定化方法。采用这种方法时需事先确定载体和酶在电场中是否会分解和失活。在沉积过程中和酶活性、稳定性有关的某些离子如果发生移除、损漏，那么就必须即时补充、替代。,(2)共价结合法,借助共价键将酶的活性非必须侧链基团或细胞表面基团（如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基等）和载

7、体的功能基团进行偶联以达到固定化目的方法。此法得到的固定化酶结合牢固、稳定性好、利于连续使用，因此它是目前应用最多的一类固定化酶的方法。,共价偶联法的优点：得到的固定化酶结合牢固、稳定性好、利于连续使用。共价偶联法的缺点：载体活化的操作复杂，反应条件激烈，需要严格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。同时共价结合会影响到酶的空间构象，从而对酶的催化活性产生影响。,共价偶联法的优点、缺点,共价结合法example,纤维素,+盐酸甲醇,CMC甲酯,肼,CMC酰肼,CMC叠氮化物,羧甲基纤维素叠氮法制备固定化葡萄糖淀粉酶程序,重氮法溴化氰法烷基化（三氯匀三嗪）叠氮法,A重氮法,反应式及原理,B 叠氮

8、法,例用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下：酯化 肼解 叠氮化(4)偶联,B 叠氮法,对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后与酶偶联。,与酶中的氨基、羟基、巯基反应。,C烷基化反应法,含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。,与酶中的氨基、羟基、巯基反应。,D硅烷化法,多孔玻璃特点：机械强度好，表面积大。耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。,D硅烷化法,一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。,D硅烷化法,D硅烷化法,D硅烷化法,E 溴化氰法,本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。

9、如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。,E 溴化氰法,与酶中的氨基反应,1)载体的物化性质要求载体亲水(避免吸附)，并且有一定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团。2)偶联反应的反应条件必须在温和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中。3)所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能基团副反应尽可能少。4)要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响。,共价偶联法固定化酶的几个影响因素,共价偶联法成功的关键在于载体的选择、偶联反应、偶联反应

10、过程中的活性保护和偶联量的多少。此法固定化细胞的报导甚少，它的发展有赖于新的温和偶联方法和生物相容性好的偶联试剂的开发,(3)交联法,利用双功能或多功能试剂在酶分子间、或酶分子与惰性蛋白间进行交联反应以制备固定化酶的方法。常用的试剂有戊二醛、甲苯二异氰酸酯、乙烯-马来酸酐共聚物等。交联法操作简便，但交联反应往往比较激烈，许多酶容易在固定化过程中失活，酶回收率不高。,交联法,发生作用的氨基酸残基：酪氨酸的酚基 胱氨酸的SH巯基 N末端的a氨基常用的双功能或多功能试剂：戊二醛 聚甲叉双碘乙酰胺 双重氮联苯胺,共价交联法的四种形式1）酶直接交联法 在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固

11、定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。操作简单，但是缺乏选择性，活力回收往往不高。,2）酶辅助蛋白交联：当可得到的酶量有限，可以使用第二个“载体”蛋白来增加蛋白质浓度，从而使酶与惰性蛋白共交联的方法。这种“载体”蛋白即辅助蛋白，可以是白蛋白、明胶、血红蛋白等。,3）吸附交联法：此法先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联，用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。,4）载体交联法：用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中的另一部分功能基团偶联酶蛋白。,(4)包埋法,通过物理或化学的方法将酶或

12、细胞限制在一定的空间范围内，底物和产物能自由扩散，从而达到重复利用生物质的一种固定化方法。此方法是固定化细胞的最主要方法。包埋法可分为格型包埋和微囊型包埋。前者是将酶或细胞分散包埋在聚合物的胶格中，如聚丙烯酰胺凝胶、卡拉胶、聚乙烯醇、海藻酸钙等；后者是将一定量的酶或细胞包在半透膜内，如尼龙膜、醋酸纤维、NaCS/PDMDAAC胶囊等。此法制备条件温和、生物相容性好，但仅可用于低分子量的底物，且常受扩散限制。,微胶囊特点,微囊直径几微米几百微米。低分子底物可以自由通过并进入微囊内。酶本身是高分子物质不能通过微囊而被留在微囊中，外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内,包埋法的优点在于它

13、是一种反应条件温和、很少改变酶结构但是又较牢固的固定化方法。包埋法的缺点是只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶并不适合。这是由于高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变，使活力降低。,包埋法的优点、缺点,微囊化制备方法,微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质体和中空纤维中。胶囊和脂质体主要用于医学治疗，中空纤维主要适于工业使用。微囊制备方法（1）界面沉淀法是一种简单的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。（2）界面聚合法有机溶液中添加表面活性剂使之乳化形成油包水结构,再用单体分子在界面聚合,达到包

14、埋目的的一种方法。（3）原位聚合 没有界面发生的聚合反应成膜,A 乳化分散：取含有酶和亲水性单体的水溶液，在不溶于水的有机溶媒中充分乳化。,B 表面聚合：将含有疏水性单体的有机溶媒加入到上述乳化液中，发生聚合反应，生成的薄膜把酶包围起来形成微型胶囊球。,C 清洗：反应完成后，用有机溶剂洗去未反应的剩余单体,界面聚合法,微胶囊的制备（example)-原位聚合,NaCS(Sodium Cellulose Sulphate）纤维素硫酸钠 PDMDAAC(Polydimethyldiallylammonium Chloride，聚二甲基二烯丙基氯化铵这两种物质均是能溶于水的聚电解质。NaCS是聚阴离

15、子化合物，PDMDAAC为聚阳离子化合物，当这两种带不同电荷的物质混合时，在两者的界面发生络合反应，生成多聚电解质复合体（PEG，Polyelectrolyte Complexe，形成了一层半透膜。,NaCS-PDMDAAC微胶囊制备的反应过程示意图,固定化酶的制法及其特性比较,特性,制备方法,共价键结合法,离子结合法,物理吸附法,包埋法,制法,难,易,易,难,酶活力,高,高,高,低,底物特异性,易变,不变,不变,不变,结合能力,强,中,弱,弱,再生,不可,可能,可能,不可,交联法,难,中,易变,强,不可,固定化酶的保存方法,使用时固定化酶的保存是一个很重要的环节。,1 真空冷冻干燥保存（长期

16、保存）2 低温保存 3 多孔玻璃的无机质载体比纤维素等的有机质载体 更适于长期保存。4 无机质载体中，以重氮结合法制备的固定化酶具 有较好的保存性。,(三)固定化酶特性,固定化后酶会发生()（载体酶）构象变化微扰 立体屏蔽酶特异性(Km)稳定性以及最适温度()（载体底物）分配效应扩散效应最适pH变化,立体屏蔽：是由于载体的孔隙太小，或是由于固定化的方式与位置不当，给酶的活性中心或调节中心造成了空间障碍，因而底物与效应物无法和酶接触，从而影响酶活性的一种效应。这种效应也难于定量描写，多见于包埋，吸附法或共价偶联法。微扰：是由于载体的亲水、疏水性质和介质的介电常数等直接影响酶的催化能力或酶对效应物

17、作出反应能力的一种效应。这种效应更难于定量描写和预见，但是通过改变载体与介质的性质可作出判断与调节。,空间障碍效应(立体屏蔽)固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体的空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易于底物或效应物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用,所造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效应。,分配效应 由于载体和底物的性质差异引起了微环境和宏观环境之间的性质不同。微环境是在固定化酶附近的局部环境，而将主体溶液称为宏观环境。由这种不同造成的底物、产物和各种效应物在两个环境之间的不同分配，被称为分配效应。,

18、扩散限制效应 酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产生了扩散阻力：1）、外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过程中的一种扩散限制效应，它发生在反应之前，发生在固定化颗粒周围的液膜层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。2）内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到酶活性部位时的一种扩散阻力，它与催化反应同时进行。载体小而弯曲的细孔是产生内扩散阻力的要原因。因此使用低分子量底物，小的粒径、载体孔尽可能大而直且互相连通，或仅仅将酶固定在载体表面都可以降低这种内扩散阻力。,固定化酶的特性,具体表现在如下特性：稳定性(一般升高)1)固

19、定化后的酶与载体多点连接，可防止酶分子 伸展变形。2)抑制自降解，提高了酶稳定性最适温度变化（一般升高，但有些酶仍然会降低，如烷基化固定的氨基酰化酶）最适pH（受底物影响和载体影响发生偏移动）底物特异性（由于空间障碍妨碍底物接触而影响Km值）,固定化酶最适pH变化,底物（扩散限制）如酸性底物停留在酶分子周围，使酶表面pH降低，需要升高溶液pH值才能达到原来最优pH氢离子,底物滞留在酶表面,降低宏观H+(升高pH),固定化酶最适pH变化,载体（分配效应）,阴离子载体,要达到自由酶表面氢离子水平（最优pH）,必须升高宏观溶液中OH浓度,减少分配进入载体的氢离子,二 细胞的固定化,细胞固定化所用的方

20、法固定化细胞的特性,1、可增殖，细胞密度大，可获得高度密集而体积小的生产菌集合体2、发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连续使用。3、发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化。4、有利于需要辅酶和多酶系统才能进行的反应。,(一)细胞固定化所用的方法,吸附法（依据细胞特性选择吸附载体）(1)酵母（负电荷）多孔陶瓷和塑料(2)霉菌（菌丝体长）金属网丝(3)植物细胞中孔纤维外壁(4)动物细胞（贴壁细胞）容器壁,细胞固定化所用的方法,包埋法 包埋实质上是酶周围聚合(连接)的过程(1)温度诱导的交联琼脂（机械强度差，扩散困难）甲叉菜胶明胶(2)离子诱导交联海藻酸钙(3)光等诱导的交联 1)聚丙烯酰胺 2)

21、光交联树脂（聚氨酯预聚物，光敏剂，光）,2.4%左右的卡拉胶，70 溶解,再冷却到 42,+10%左右的细菌菌体(预热到42）迅速混合均匀 4 冰箱放置大约30min 取出后切成33mm的小颗粒,Example:卡拉胶 包埋,Example 海藻酸钙包埋法,将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把酶或细胞分散在其中，然后将其滴入凝固浴中（常用CaCl2 溶液），使海藻酸钠中的Na+，部分被Ca+所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。,注意：(1)乳酸和磷酸等对其干扰(2)capsule和bead区别；正滴和反滴的区别,Exmaple聚丙烯酰胺包埋固定化细胞,酶液,丙烯酰胺,N，N双丙烯酰胺,催化

22、剂为过硫酸钾、核黄素,光照,聚合反应,凝胶酶块,固定化酶,切割,(二)固定化细胞的特性,对菌体提高了细胞密度，提高产率对植物分散了细胞（用于研究或利于传递底物）对动物由于容易和底物分离，从而可实现菌体生长和发酵条件的控制,细胞特性比较(固定化中要注意事项）,三辅酶的固定化,原因有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应中有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生有机辅因子价格昂贵工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生,辅酶的固定化,方法固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中问题辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。,辅酶的固定化（example）,