发酵工业的无菌技术.ppt
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1、第四章,发酵工业的无菌技术,本章内容,一、概念 二、发酵工业污染的防治策略三、发酵工业的无菌技术四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌,一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐,灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命物质的过程。消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。除菌(degermation):用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。防腐(antisepsis):用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖。消毒与灭菌的区别消毒与灭菌在发酵工业中的应用,二、发酵工业污染的防治策略,(一)污染的危害(二)污染
2、的防治,1.染菌的不良后果,消耗营养合成新产物;菌体自溶、发粘等造成分离困难改变pH分解产物噬菌体破坏极大,2.染菌危害的具体分析(1)染菌对不同菌种发酵的影响,A细菌谷氨酸(棒状杆菌):发酵周期短,培养基不太丰富,较少染杂菌,但噬菌体威胁大。肌苷(枯草杆菌):缺陷型生产菌,培养基丰富,易染菌,营养成分迅速被消耗,严重抑制菌生长和合成代谢产物。,B.霉菌PenG:青霉素水解酶上升,PenG迅速破坏,发酵一无所获。柠檬酸:pH2.0,不易染菌,主要防止前期染菌。C.酵母菌:易污染细菌以及野生酵母菌 D.疫苗:无论污染的是活菌、死菌或内外毒素,都应全部废弃。,(1)染菌对不同菌种发酵的影响,(2)
3、染菌种类对发酵的影响,青霉素:怕染细短产气杆菌链霉素:怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌四环素:怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌柠檬酸:怕染青霉菌肌苷(酸):怕染芽孢杆菌谷氨酸:怕染噬菌体,易造成连续污染,(3)不同发酵时期染菌对发酵的影响,种子扩大时期染菌:发酵前期染菌:发酵中期染菌:挽救困难,应早发现,快处理,处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 抗生素发酵 柠檬酸发酵 a.污染细菌:加大通风,加速产酸,调pH3.0,抑制细菌 b.污染酵母:加入0.0250.035g/L CuSO4抑制酵母;通风加大,加速产酸。,灭菌后弃去,应迅速重新灭菌,补充必要的营养成分,重新接种,(3)不同发
4、酵时期染菌对发酵的影响,柠檬酸发酵c.染黄曲霉:加入另一罐将近发酵成熟的醪液,pH下降,黄曲霉自溶。d.青霉菌:在pH很低下能够生长。提前放罐。发酵后期污染染菌量不太多,可继续发酵污染严重,则提前放罐杀菌剂的添加:前期无必要,增加成本;发现后加入,效果要具体评价,(4)杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响,丝状菌发酵被产酸菌污染:pH不断下降,菌丝大量自溶,发酵液粘度增加,过滤困难 处理方法:将发酵液加热后再加助滤剂;先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀杂菌分泌较多蛋白质杂质时,对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利,使水相和溶媒之间极易发生乳化,1.染菌的检查与判断,显微镜检查法 镜检出
5、杂菌需要一定时间平板划线培养或斜面培养检查法:菌落 噬菌体检查可采用双层平板法:噬菌斑肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断DO2水平异常变化pH异常变化尾气CO2异常变化,1,2,2.污染原因分析,主要原因:种子带菌 无菌空气带菌 设备渗漏 灭菌不彻底 操作失误 技术管理不善,从污染时间看:早期污染可能与接种操作不当有关;后期污染可能与及中间补料有关。从杂菌种类看:耐热芽孢杆菌:与有关球菌、无芽孢杆菌:与 有关浅绿色菌落的杂菌:与水有关,即冷却盘管渗漏霉菌:与有关,即无菌室灭菌不彻底或操作问题酵母菌:糖液灭菌不彻底或放置时间较长 从染菌幅度看:各个发酵罐或多数发酵罐染菌,且所污染的是同一种杂
6、菌,一般是空气系统问题,若个别罐连续染菌,一般是设备问题。,2.污染原因分析,3.预防,种子带菌的防治 灭菌彻底接种可靠:无菌室及设备可靠,无菌操作可靠保藏可靠过滤空气带菌的防治设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治,“死角”,发酵罐的“死角”法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件 口:人孔(或手孔)、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”消除方法:加强清洗并定期铲除污垢;安装放汽边阀管道安装不当或配置不合理形成的“死角”,发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”,法兰连接不当造成的“死角”,灭菌时蒸汽不易通达
7、的“死角”及其消除方法,培养基与设备灭菌不彻底的防治原料性状:大颗粒的原料过筛除去。实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。灭菌过程中产生的泡沫造成染菌:添加消泡剂 防止泡沫升顶连消不彻底:最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角 操作不当造成染菌 噬菌体染菌及其防治,3.预防,采取哪些措施能够保持无菌发酵?,物料、培养基、中间补料要灭菌;发酵设备及辅助设备(空气过滤装置、各种发酵罐进出口连接装置)和管道要灭菌;好气发酵通入的空气要除菌;种子无污染;接种无菌操作过关;为了保持发酵的长期无菌状态,需维持正压。,三、发酵工业的无菌技术灭菌方法,干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法过滤除菌
8、法火焰灭菌法,四、培养基及设备灭菌,(一)湿热灭菌原理(自学)(二)分批灭菌(实罐灭菌)(三)连续灭菌(连消)(四)分批灭菌与连续灭菌的比较,分空气过滤器灭菌并用空气吹干,夹套或蛇管排冷水,开启排气管阀,空气管通蒸汽,也可夹套内通蒸汽,达70左右,取样管,放料管,通蒸汽,120,1105pa,保温,保温阶段,凡液面以下各管道都应通蒸汽,液面上其余各管道则应排蒸汽,不留死角,维持压力、温度恒定,罐压接近空气压力,向罐内通无菌空气,保温结束,依次关闭各排汽、进汽阀门,夹套或蛇管中通冷水 培养基降温到所需温度,(二)分批灭菌(实罐灭菌)1.灭菌工艺过程,将配置好的培养基放入发酵罐或其它装置中,通入蒸
9、汽将培养基和所用设备一起进行灭菌的操作过程。,升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果,考虑到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行,故可以简单地利用式(N/N0)=-kt 来粗略估算灭菌所需时间。,2.灭菌时间的估算,2.灭菌时间的估算,例1:有一发酵罐内装40m3培养基,在1210C温度下实罐灭菌,原污染程度为每1ml有2105个耐热细菌芽孢,已知1210C时灭菌速度常数k=1.8min-1,求灭菌失败机率为0.001时所需时间。解:N0=401062105=81012(个)Nt=0.001(个)k=1.8(min-1)(Nt/N0)=-kt t=2.303/klg(N0/Nt)=2.303/1.8lg
10、(81015)=20.34(min)由于升温阶段就有部分菌被杀灭,特别是当培 养基加热至1000C以上,这个作用较为显著,故实际保温阶段时间比计算值要短。,(三)连续灭菌(连消),工艺流程喷淋冷却连续灭菌流程喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程 灭菌时间的计算(Ct/C0)=kt t=2.303/klg(C0/Ct)式中:C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。,将配置好的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却等灭菌过程。高温短时,例2某发酵罐内装40m3培养基,采用连续灭菌,灭菌温度为1310C,原污染程度为每1ml含有2105个杂菌,已知1310C时灭
11、菌速度常数为15min-1,求灭菌所需的维持时间。,连续灭菌时间的估算,解:C0=2105(个/ml)Ct=0.001/(40106)=2.510-11(个/ml)t=2.303/klg(C0/Ct)=2.303/15lg(2105)/(2.510-11)=2.37 min,喷淋冷却连续灭菌流程,生培养基,真空冷却器,无菌培养基进发酵罐,分批灭菌与连续灭菌的比较,连续灭菌的优点:(适用于大型罐)可采用高温短时灭菌,营养成分破坏少,有利于提高发酵产率;发酵罐利用率高;蒸汽负荷均衡;采用板式换热器时,可节约大量能量;适宜采用自动控制,劳动强度小;可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下分开灭菌
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