工业用微生物菌种课用.ppt

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1、发酵工程,Fermentation Engineering,第二章,发酵工业菌种,本章内容,一、常用的工业微生物二、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术三、发酵工业菌种改良,最常用的工业微生物,细菌醋酸杆菌属制醋工业的菌种乳酸杆菌枯草杆菌丙酮丁醇梭菌大肠杆菌谷氨酸棒状杆菌假单胞菌,荧光假单胞菌,荧光假单胞菌(P.fluorescens)属于假单胞菌属rRNA I群荧光DNA同源组，是植物根际最普遍的微生物类群，具有分布广、数量多、营养需要简单、繁殖快、竞争定殖力强的特点。荧光假单胞菌，而且许多菌株能产生几种活性物质，抗多种植物病害。其作用机制包括：抗生素的作用、噬铁素对铁的营养竞争、有效的根际定殖

2、等。世界许多国家均有人报道分离到抗植物病害的荧光假单胞菌,而且许多菌株能产生几种活性物质,如抗油菜菌核病的菌株。,铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）,谷氨酸发酵菌种,日前用于谷氨酸发酵的菌种有谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌、黄色短杆菌、嗜氨小杆菌、球形节杆菌。我国常使用的生产菌株是北京棒杆菌AS1.299、北京棒杆菌D110、钝齿棒杆菌A51.542、棒杆菌S-914和黄色短杆菌T6T13等。,在己报道的谷氨酸生产菌中，除芽孢杆菌外，虽然它们在分类学上属于不同的属种，但都有一些共同的特点，如菌体为球形、短秆至棒状、无鞭毛、不运动、不形成芽孢、呈革兰氏阳性、需要生物素做生长因子、在通气条件下培养产生谷氨酸。

3、,谷氨酸发酵机制,谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖经EMP途径或HMP途经生成丙酮酸再氧化成乙酰辅酶A然后进入TCA再通过乙醛酸循环、CO2固定作用生成a-酮戊二酸谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下生成谷氨酸,谷氨酸生产菌能够在体外积累菌体最大生长需要量300多倍的谷氨酸，研究发现：大量积累并非是当初设想的由于特异代谢途径导致，而是：代谢调节控制；细胞膜通透性的特异调节；发酵条件的适合。,谷氨酸菌种的定向选育,改变细胞膜的通透性：,生物素（乙酰CoA羧化酶的辅酶）营养缺陷型株丧失脂肪酸合成酶的油酸缺陷型；丧失a-磷酸甘油酶的甘油缺陷型。,选育温度敏感突变株：,例：使用典型的温度敏感突

4、变株TS-88生产谷氨酸时，通过控制发酵条件，在生长适当阶段将发酵温度由30提高到40，可在生物素含量为33ug/L，含糖3.6%的甜菜糖蜜发酵培养基中，产生20g/L谷氨酸，对糖转化率55%。,生物素对谷氨酸发酵的影响,生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的生物合成，进而影响磷脂的合成。当控制生物素在亚适量时，脂肪酸合成就不完全，导致磷脂合成不完全。而细胞膜是由磷脂双分子层组成的，当磷脂含量减少到正常时的一半左右时，细胞发生变形，谷氨酸能够从胞内渗出、积累于发酵液中。如果生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸，代谢产物中乳酸和琥珀酸明

5、显增多。,生物素亚适量的原因（2ug/L5ug/L）：,当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。,在谷氨酸发酵过程中，影响菌种代谢途径的因素见下表。,第36页，共69页,防止噬菌体和杂菌的污染,谷氨酸生产菌一 般都是生物素缺陷型，而在发酵培养基中又大多是控制生物素亚适量，所以谷氨酸生产菌对噬菌体和杂菌的抵抗能力较弱。最怕污染噬菌体，轻则出现谷氨酸收率低、难提取，重则倒罐，造成很大的经济损失。所以，杂菌和噬菌体的防治工作就显得特别重要。一定要从空气过滤、培养基、设备、环境等环节严格把关。,最常用的工业微生物,酵母菌酿酒酵母假丝酵母属产朊假丝酵母解脂假丝酵母热带假丝酵母毕

6、赤酵母属、汉逊酵母属：酒精发酵工业及酿造工业的有害菌,1、酵母菌形态：酵母菌是一群单细胞的真核微生物,其形态因种而异.通常为圆形、卵圆形或椭圆形。也有特殊形态，如柠檬形、三角形、藕节状、腊肠形，假菌丝等。,酵母菌,假菌丝:酵母菌在一定条件下培养，产生的芽体与母细胞不分离形成的特殊形态。,啤酒酵母的菌落,红酵母的菌落,各种酵母菌的菌落,酵母菌菌落,最常用的工业微生物,霉菌曲霉属米曲霉黑曲霉青霉属青霉菌：点青霉、产黄青霉桔青霉根霉属德氏根霉米根霉、小麦曲根霉红曲霉属紫红曲霉,最常用的工业微生物,放线菌链霉菌属小单孢菌属地中海诺卡氏菌米苏里游动放线菌,未培养微生物,定义：指迄今所采用的微生物纯培养分

7、离及培养方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为99。研究方法 模拟自然培养法:原位培养、培养条件优化、单细胞操作 宏基因组分析法,二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术,（一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求（二）分离筛选原理与技术（三）应用举例,1.菌种选择的总趋势,野生菌变异菌自然选育代谢控制育种诱发基因突变基因重组的定向育种,2、微生物工业对菌种的要求,产物分泌型,工业菌种的改良方法,解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。增加前体物的深

8、度。改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高深度的有潜在毒物的底物、前体或产品的耐受力。,抑制或消除产品分解酶。改进菌种外泌产品的能力。消除代谢产品的反馈抑制，如诱导代谢产品的结构类似物抗性。,工业菌种的改良方法,（二）分离筛选原理与技术,1.筛选的指导思想2.分离筛选工作在实际中应用的几个方面3.新种分离筛选原理与技术,1.筛选的两种指导思想,先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。结果有两种可能：获得适于工业发酵菌株只获得选育所需的出发菌株,2.分离筛选工作在实际中应用的几个方面,从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌；生产中长期使用的菌种的

9、定期分离筛选；从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目的的优良菌株；从保藏机构获取菌种 好处：经济性、指导性从已知菌种和大自然中分离新菌株寻找新的发酵产品的产生菌；寻找老产品的新的优良菌株。,国际承认的中国培养物保藏单位,武汉大学的 中国典型培养物保藏中心 CCTCC。保藏了几乎所有的培养物。,(CCTCC),国际承认的中国培养物保藏单位,中科院微生物研究所的 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC。保藏有普通菌种。,(CGMCC),此外，较著名的中国培养物保藏单位还有,中国微生物菌种保藏管理委员会 CCCCM管理机构,3.新种分离与筛选的步骤,调查研究（包括资料查阅）试验方案设

10、计 含微生物样品的采集（如何使样品中含所需微 生物的可能性大？）样品预处理（如何在后续的操作中使这种可 能性实现）菌种分离,根据目的菌株及其产物特点分 选择性分离方法 随机分离方法(定向筛选选择压力)(用筛选方案-检测系统进行间接分离）富集液体培养 固体培养基条件培养(初筛)菌种纯化 复筛,菌种纯化 初步工艺条件摸索 再复筛 生产性能测试 较优菌株1-3株保藏及进一步做生产试验 某些必要试验和 或作为育种的出发菌株 毒性试验等,（1）含微生物样品的采集,采样时应注意的问题:土壤微生物的分布采土深度：525cm土壤植被情况采样季节土壤的酸碱度对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准：土壤来源广泛

11、在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新菌种,采样,1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。细菌（108）放线菌（107）霉菌（106）酵母菌（105）藻类（104）原生动物（103）,从自然界筛选,2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的

12、数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。,（2）样品的预处理,目的：提高分离效率方法：物理方法：热处理；膜过滤法；离心法化学方法：化学成分增加特定微生物的数量诱饵法：富集目的菌,膜过滤法,当样品中菌数很低时,可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器,然后将将膜转到相应的培养基上进行培养,对形成的菌落进行统计。,例如：放线菌的分离筛选，培养基的组成原则,大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的。除嗜温性放线菌外，其他放线菌一般在培养4-20天内在分离平板上缓慢形成菌落。在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。选择性地

13、添加抗生素。分离琼脂平板制备好后，一般皆应在37培养箱中存放3天。,放线菌的分离,土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，无菌海绵压印土样后压印平板后培养。植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下微生物后振荡培养。水中放线菌的分离：为使所要分离的放线菌的数量种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。,次代培养及纯化,菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异，作初步的鉴定和区分。通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子形成情况。成功地分离出各种不同的放线菌属及种的关键是所采集样本的本身及其分

14、离用的琼脂培养基；而肉眼识别不同的生长形态、从而初步地加以鉴定，在分离放线菌时显得尤为重要。将分离平板上所形成的菌落用经火焰灼烧灭菌的钩形针或无菌牙签挑取，点接到琼脂平板上进行影印培养，以进一步筛选和分离。,（3）分离方法的选择,根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法菌种的营养特征独特 生长特征独特 无选择性特征 根据产物的特征进行 随机分离 选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控制，从而实现定向富集筛选。,选择性分离,A、选择性分离原理和技术,1、生长条件的选择与控制原理控制营养成分 控制培养基酸碱度 添加抑制剂 控制培养温度 控制通气条件 2、选择性分离技术富集液体培养技术固体培养技术,

15、施加选择压力，进行定向筛选,富集液体培养,增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件培养方式分批培养方式：以最大比生长速率（max）筛选，存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题连续培养方式：以比生长速率（）筛选,A,B,S0,基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（）的影响 当SS0时，富集什么菌株？连续培养方式：以比生长速率筛选,连续富集培养技术分离菌株的优点,分离的菌株特别适合连续发酵生产过程有利于分离具有某种工业生产特性的菌株可以筛选出能共生的稳定混合培养物,固体培养技术,常用于分离某些酶产生菌 选择压力：在选择

16、培养基中加入所需酶的基质,随机分离原理与技术,从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛选出所需的目的菌。技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应筛选方法的确定。随机分离技术举例 抗生素产生菌的筛选药理活性化合物产生菌的筛选生长因子产生菌的筛选多糖产生菌的筛选,高产培养基设计的几个原则,制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素；使用一聚合或复合形式的生长限制养分；避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物阻遏；确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；使用pH缓冲剂以减少pH变化；前体、促进剂及抑制剂的采用。,抗生素

17、产生菌的筛选,筛选模型：试验菌筛选方法：铺菌法 复印平板法液体培养筛选 抗药性筛选筛选模型：氨苄青霉素和-内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同 I II无试样时（不含棒酸时），I对II菌作用不大有试样时（含棒酸时），I对II菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性,固体培养筛选,试验菌 代表微生物类型金黄色葡萄球菌209p 革兰氏阳性球菌枯草杆菌6633 革兰氏阳性杆菌 大肠杆菌 革兰氏阴性肠道细菌耻垢分枝杆菌607 结核杆菌白色念珠菌 酵母状真菌 青霉菌 丝状真菌,药理活性化合物产生菌的筛选,药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到治疗的目的。筛选模型：目标酶,生长因

18、子产生菌的筛选,筛选模型：营养缺陷型试验菌 筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进营养缺陷型试验菌生长,氨基酸产生菌的筛选,样品 预处理 初筛（除真菌）在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板（copy 法）平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 对应到copy前相应 u.v线杀死长好的菌落 位置，找到目的菌落再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂 培养后 产氨基酸菌落周围有生长圈,目的菌落进行液体培养，对产物进行定量测定,筛选产物含量高的菌株,多糖产生菌的筛选,取样特点：碳水化合物工业的废弃物筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选高产菌。,4、

19、几种典型微生物的分离筛选方法举例,细菌放线菌真菌,细菌分离：以乳酸菌为例,取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中 加麦芽汁至瓶口处，封塞，25培养24-48h培养基中长出绢丝状波动物，镜检 杆状，阳性染色 初步断定乳酸菌 用选择性培养基分批富集培养2-3代稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、CaCO3的琼脂培养基 根据透明圈挑选菌落 性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定）Rf值定性（有机酸呈黄斑点）乳酸生成量测定（滴定法）,放线菌的分离：以产链霉素菌种的分离为例（从退化菌种中筛选）,取工业发酵液（含孢子）样品1环放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀采用稀释法制平板，获

20、取单菌落 斜面保藏 高产菌恢复根据高产菌的特点，选择目的菌落 放大培养，发酵液性能测试,筛选模型：形态依据,真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例,取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7 稀释分离法 取0.1ml 加入固体培养基铺平皿（2）在麦芽汁固体培养基上，25培养48-72h 形态筛选 根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用 纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次 生成子囊孢子速度测定 发酵力测定 性能测定 热死温度测定 凝集力测定 双乙酰含量测定,菌种选育改良的具体目标,提高目标产物的产量 提高目标产物的纯度，减少副产物 改良菌种性状，改善发酵过程 改变生物合成途径，以获得高产

21、的新产品,第二节 发酵高产菌种选育,常规育种(诱变育种)细胞工程育种 基于代谢调节的育种技术 基因工程育种 蛋白质工程育种 代谢工程育种,选择育种方法时综合考虑的因素,(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(如批式或连续发酵试验)；(2)对这一特定菌种的遗传和生物化学万面认识的明了程度；(3)经济费用。如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术：如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。,诱变育种,以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。诱变育种：以诱发

22、突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。,诱变,物理、化学或生物诱变方法,一、诱变剂和诱变处理,物理诱变剂：射线如紫外线、X射线、射线，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。,化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。使用化学诱变剂的优缺点：1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。,化学诱变剂：化学因子如碱基类

23、似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。,1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射行工作时，设备费用大，并要注意安全性。3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。,诱变剂的选择,1碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回复突变率高，效果不大。2亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常

24、被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。3吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。4紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。,诱变育种的基本方法,出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选,(一)出发菌株的选择,1自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。2在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。3每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。4出发菌株开始时可以同时选23株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。,5要

25、尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。6根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。,(二)处理菌悬液的制备,这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。,(三)诱变处理,结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。,(四)中间培养,由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延

26、迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。,方法措施：让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。,(五)分离和筛选,筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异.例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物

27、与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。,（1）营养缺陷型的选育,营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。与营养缺陷型对应的是野生型。能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基(MM)；在基本培养基中加入相应的营养成分的称补充培养基(SM)；能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。

28、,营养缺陷型的用途,营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。要研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。,筛选营养缺陷型的步骤,诱变淘汰野生型检出缺陷型确定生长谱具体方法：影印法、点种法、夹层法,赖氨酸生产菌种的选育改良思路,出发菌株：黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌育种思路 1.优先合成的转换渗漏缺陷型的选育 2.切断支路代谢营养缺陷型的选育：高丝氨酸缺陷型 3.抗结构类似物突变株的选育：AEC 4.解除代谢互锁：Leu-、抗Leu结构类似物、喹啉s、苯醌s 5.增加前体物的合成和阻塞副产物的生成：Ala-、抗Asp结构类

29、似物 选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株 6.改善细胞膜的透过机能 7.选育温度敏感突变株 8.应用细胞工程和基因工程育种,选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株,赖氨酸合成中间代谢有以下两条途径：通过TCA循环 葡萄糖 丙酮酸 草酰乙酸 天冬氨酸 赖氨酸 通过磷酸烯醇丙酮酸羧化反应 葡萄糖 磷酸烯醇 草酰乙酸 天冬氨酸 式丙酮酸 丙酮酸 赖氨酸,代谢工程的定义,利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一个新的学科领域。又称作途径工程，是多基因的

30、基因工程。,代谢工程发展基础,代谢网络理论：是把细胞的生化反应以网络整体，而不是孤立地来考虑。代谢网络分流处的代谢产物称为节点，其中对终产物合成起决定作用的少数节点称为主节点。根据节点下游分支的可变程度，节点分为：柔性节点：解除一个分支的反馈抑制可提高该分支下游产物的产量。半柔性节点：须降低主分支的酶活并同时提高次分支的酶活或解除其反馈抑制，才可提高次分支下游产物的产量。刚性节点：其下游各分支的比例不易改变。,代谢工程发展基础,相依网络：代谢网络中各主节点集中于产物，为了避免中间物的过量积累，各分支的代谢流都必须保持平衡，各分支的分流相等，各节点的重要性相同。独立网络：代谢网络的主节点不集中，

31、可以通过对代谢的修饰来影响产物的产量,其对代谢修饰的应答能力，取决于各节点的刚柔性及其位置。S I P S P B B1 B2,相依网路,独立网路,（三）代谢工程育种思路,1.改变代谢流：改变分支代谢途径的流向，阻断有害代谢产物的合成。（1）加速限速反应（2）改变分支代谢途径流向：提高代谢分支点的某一分支代谢途径酶系的活力，在与另外的分支代谢途径的竞争中占有优势，可以提高目的代谢末端产物的产量。（3）构建代谢旁路（4）改变能量代谢途径,代谢工程育种思路,2.扩展代谢途径（1）在引入外源基因后，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端代谢产物。（2）使原来的代谢途径向前延伸，可以利用新的原料生物合成代谢末端产物。,代谢工程育种思路,3.转移或构建新的代谢途径 1)转移代谢途径:为生产某一新的化学结构的代谢产物，将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一不具备该种能力的微生物中，达到代谢途径转移的目的，使之具备生产该种新化合物的能力。2)构建新的代谢途径:利用基因工程手段，通过克隆少数基因将原来细胞中无关的两条代谢途径桥连在一起，形成新的代谢途径。,本章小结,掌握微生物分离筛选的基本概念、基本原理与基本技术掌握菌种改良的基本技术与方法,