动物细胞融合与单克隆抗体ppt.ppt

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1、电影人兽杂交剧照,动物细胞融合与单克隆抗体,1、定义：两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。也称细胞杂交,一、动物细胞融合,杂交细胞：融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞成为杂交细胞。,2、诱导融合的因素生物法：灭活的病毒诱导融合.(病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。)化学法：聚乙二醇PEG诱导融合.物理法：电激融合,病毒颗粒黏 附细胞表面,细胞膜连接,细胞膜被 病毒颗粒穿通,细胞融合、形成杂种细胞,不能，因为不灭活的病毒会感染细胞。,(三)动物细胞融合的应用,1.

2、突破有性杂交方法的局限,使远缘杂交成为可能。(至今种间、属间、科间，甚至动物与植物之间的细胞融合已获得成功。),2.成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。,3.为制造单克隆抗体开辟了新途径。,鼠鸡、鼠兔、鼠猴、人鼠、人兔、人鸡、人蛙、酵母菌鸡、人胡萝卜等,二、单克隆抗体,什么是抗体？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。B淋巴细胞（浆细胞）能产生抗体。,（一）获得抗体的传统方法,1、把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需的抗体。,2、缺点：产量低，纯度低，特异性差。,人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的

3、B淋巴细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每一个B细胞只分泌一种特异性抗体。要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的B淋巴细胞，形成细胞群。,1、请从以上文字资料中找出单克隆抗体的概念,用单个B淋巴细胞进行克隆，得到的细胞群能够分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体，这种抗体就叫做单克隆抗体。,2、怎样才能获得单克隆抗体？,提示1：仅用细胞培养技术可行吗？,提示2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？,提示3：有什么方法能使B细胞产生抗体的能力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？,如何大量生产单克隆抗体？,利用B淋巴细胞产生抗体的功能。利用肿瘤细胞无限增殖的特性。利用细胞融合的技术将两种细胞

4、融合获得具有B淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞。利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞。,细胞融合、筛选,足够数量的、能产生特定抗体的细胞群,单克隆抗体,单克隆抗体的制备,（二）单克隆抗体的制备,动物特异性免疫分离B淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意B淋巴细胞是一个系列。（B1,B2,B3,-Bn）细胞融合三种融合方式:（BB;BG;GG）第一次筛选：在“选择培养基培养”上培养筛选杂交瘤细胞（只有BG杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：如B1G,B2G-BnG。而BB,GG在此培养基上不能存活。）第二次筛选：在“多孔培养板上”培养杂交瘤细胞系列，每孔只放一个杂交瘤细胞。“克

5、隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进行“单一抗体检测”，“检测阳性”的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。,单抗的制备过程要点：,动物特异性免疫分离B淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意B淋巴细胞是一个系列。（B1,B2,B3,-Bn）细胞融合三种融合方式:（BB;BG;GG）第一次筛选：在“选择培养基培养”上培养筛选杂交瘤细胞（只有BG杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：如B1G,B2G-BnG。而BB,GG在此培养基上不能存活。）第二次筛选：在“多孔培养板上”培养杂交瘤细胞系列，每孔只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进行“单一抗体检测”，“检测阳性”的孔内即是所需要的杂

6、交瘤细胞。选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。提取单克隆抗体。,3）、为何要进行两次筛选？,4）、如何进行第2次筛选？,培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。,第1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。,问题强化：,1）、本过程利用了哪些原理？,免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理,2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？,这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体,1、作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等

7、,与常规抗体相比,具有准确、高效、简易、快速特点.,2、单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，可大量制备。,3、单克隆抗体的应用,单克隆抗体与早孕测试,试剂主要成分：抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体 原理：定性测定尿液中的人绒毛膜促性腺激素。（孕妇尿中的人绒毛膜促性腺激素能与抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体发生特异性结合）,从免疫学看，孕妇尿中的人绒毛膜促性腺激素是什么？,1、作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比,具有准确、高效、简易、快速特点.2、用于治疗疾病和运载药物：主要用于癌症治疗。生物导弹：单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。,2

8、、单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，可大量制备。,3、单克隆抗体的应用,为什么不用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？,就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是100%。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。,主要用于制备单克隆抗体,获得杂种植株,用途,物理、化学方法（同左）,灭活的病毒,物理（离心、振动、电激）化学（聚乙二醇）,诱导方法,使细胞分散后诱导细胞融合,去除细胞壁后诱导原生质体融合

9、,细胞融合的方法,细胞膜的流动性,细胞膜的流动性、植物细胞全能性,原理,动物细胞融合,植物体细胞杂交,比较项目,植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较,思考与探究,1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？,植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。,资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤

10、追踪及心肌梗塞的诊断。,2.制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？,哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的B淋巴细胞，B淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种B淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的B淋巴细胞大量增殖。B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。

11、,1在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（）A结果是相同的B杂种细胞的形成过程基本相同C操作过程中酶的作用相同D诱导融合的手段相同,2.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）淋巴细胞小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞杂交瘤细胞 A B C D,C,植物体细胞杂交的意义：,打破生殖隔离，克服远缘杂交不亲和的障碍，培育作物新品种。,一、动物细胞融合,细胞融合是正常的生命活动。,(一)动物细胞融合的概念,动物细胞融合也称细胞杂交,是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程

12、。,（二）动物细胞融合的过程,与植物原生质体融合原理相同，方法类似。,杂交细胞:融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。,细胞A,细胞B,杂种细胞,灭活的病毒,物理法化学法,用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程,（三）单克隆抗体的应用,与常规抗体相比，单克隆抗体特异性强，灵敏度高，并可大量制备。,应用主要有：,1、作为诊断试剂,2、用于治疗疾病和运载药物,准确、高效、简易、快速,把抗癌细胞的单克隆抗体与药物相结合，制成“生物导弹”。,为什么灭活的病毒能作为诱导剂？,因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。,不灭活的病毒能作为诱导剂吗？,不能

13、，因为不灭活的病毒会感染细胞。,如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？,融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行34次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。,在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交

14、瘤细胞的情况下，培养得到的细胞群是单个杂交瘤细胞克隆得来的，所以产生的抗体必然是化学性质单一的，特异性强的单克隆抗体。这里的单克隆确有单个细胞克隆的含义，只不过克隆的不是B淋巴细胞，而是杂交瘤细胞。,杂交瘤细胞既能迅速大量繁殖，又能产生专一抗体。,整个制备过程为何要经过两次筛选?,第一次筛选：用特定的选择培养基筛选出多种杂交瘤细胞,第二次筛选（克隆化培养和抗体检测）：筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。,单克隆抗体的概念：由单个杂交瘤细胞进行无性繁殖,也就是通过克隆，形成细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。,单克隆抗体的制备,抗原注入小鼠体内,骨髓瘤细胞,单克隆抗体,能产生抗体,能无限增殖,既能产生抗体又能无限增殖,我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含B淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。,