动物生化第二章蛋白质.ppt

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1、第二章 蛋白质的结构与功能 Chapter 1 Structure and Function of Protein,讲授内容,第一节 蛋白质在生命中的重要作用第二节蛋白质的化学组成第三节蛋白质的化学结构第四节蛋白质的高级结构第五节多肽、蛋白质结构与功能的关系第六节蛋白质的物理化学性质和分离提纯第七节蛋白质分类,第一节 蛋白质在生命中的重要作用,蛋白质的概念,“protein”是荷兰化学家Mulder首先使用的，来自于希腊语“protos”，意为“第一”和“最重要的”蛋白质和核酸（DNA和RNA）都是生物大分子。它们存在于动物、植物和微生物的细胞之中。蛋白质是生命活动的物质基础，在机体内蛋白质约

2、占机体固体成分的45%，几乎在一切生命过程中都起着关键作用,酶类 催化体内生化反应激素蛋白类 调节体内物质代谢，如Ins、IGF-I、GH（Hormone）运输蛋白类 运输代谢所需小分子、离子以及电子，如血红蛋白运动蛋白类 使细胞或生物体发生运动，如肌球蛋白和肌动蛋白防御蛋白类 抵抗入侵，保护机体，如抗体（与细菌、病毒选择性结合）、补体（杀死细菌、病毒）、干扰素（抑制病毒）；凝血酶和血液纤维蛋白原参与血液凝固受体蛋白类 存在于细胞各个部分，把激素、神经递质信号传递给靶细胞，如膜受体,生长、分化的调节蛋白类 对细胞的生长、分化、基因表达其调节作用。例如：组蛋白、阻遏蛋白、表皮生长因子营养和贮存类

3、 卵清蛋白、乳中酪蛋白、小麦种子中的醇溶蛋白结构蛋白类 机体的结构成分，如胶原蛋白、角蛋白、硬蛋白、丝心蛋白、弹性蛋白毒素蛋白类 极少量即可导致中毒，霍乱毒素、毒蛇的毒素蛋白膜蛋白类 生物膜的成分，可进行细胞的识别、物质运输、信息传递等,蛋白质是生命活动所依赖的物质基础。没有蛋白质就没有生命！,第二节蛋白质的化学组成,一、蛋白质的元素组成,碳50%55%、氢6%8%、氧20%23%、氮15%17%、硫0.3%2.5%某些蛋白中，还含有微量的磷、铁、铜、钼、碘、锌等元素各种蛋白质的氮的含量比较恒定，平均值为16%,蛋白质的含氮量,大多数蛋白质的含氮量接近于16%，这是蛋白质元素组成的一个特点，也

4、是凯氏（Kjedahl）定氮法测定蛋白质含量的计算基础。根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量：蛋白质含量=蛋白氮 6.256.25为蛋白质系数，即1克氮所代表的蛋白质量（克数）,二、蛋白质的基本结构单位和其它组分,蛋白质的基本结构单位是氨基酸蛋白质分为两大类简单蛋白质 水解后产生各种氨基酸结合蛋白质 水解后还可产生其它组分，如血红素、糖类、脂类、核酸、金属离子等,三、氨基酸,氨基酸的基本结构与构型常见的氨基酸20种，除脯氨酸是-亚氨基酸外，其余19种都是-氨基酸。,甘氨酸 结构式,除甘氨酸外，其余19种氨基酸都具有手性，天然蛋白中的所有氨基酸都是L-型的。但在某些微生物和植物体中常含有

5、D-型氨基酸,根据R侧链极性和电荷不同，分四大类非极性不带电极性正电极性负电极性,2.氨基酸的分类,非极性氨基酸,“丙、缬、亮、异亮、脯上色、苯、蛋”R基团具有疏水性。,Non-polar amino acids,不带电极性,“甘、丝、苏、半、酪、天冬、谷氨酰胺”R基团有极性，但不解离，或仅极弱地解离，它们的R基团有亲水性,Polar,uncharged amino acids,正电极性,“赖、精、组”R基团有极性，且解离，在中性溶液中显碱性，亲水性强,Basic amino acids,负电极性,“天冬、谷氨酸”R基团有极性，且解离，在中性溶液中显酸性，亲水性强,Acidic amino a

6、cids,3.稀有氨基酸,除了上述20种常见氨基酸以外，还有一些仅存在于少数蛋白质中的稀有L型氨基酸胶原蛋白和弹性蛋白中的4羟脯氨酸和5羟赖氨酸甲状腺球蛋白中的二碘酪氨酸和L甲状腺素肌球蛋白中的N甲基赖氨酸；-角蛋白中的胱氨酸是常见氨基酸的衍生物,没有遗传密码，是在蛋白质生物合成以后，通过有关酶的催化修饰而形成的。,4.非蛋白质氨基酸,有一些氨基酸不参与蛋白质的组成，而是以游离的状态存在于生物体之中。,5.必须氨基酸,从营养学角度还可以将氨基酸分为必需和非必需氨基酸。八种必须氨基酸:必需氨基酸包括：赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸和精氨酸，其中的组氨酸

7、和精氨酸，虽然人体能自己合成，但效率较低，尤其在婴幼儿时期，需要由外界供给。“一家写两三本书来”+精组其余的10种氨基酸是非必需氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸和丙氨酸。,6.氨基酸的主要的理化性质,光吸收特性在紫外光区色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有吸收光的能力。其最大吸收波长()分别为279、278、259nm。是利用紫外分光光度计（在波长280nm处）测定蛋白质浓度的基础。,氨基酸的两性解离及等电点,氨基酸COOH能放出质子，变成COO；NH2能接受质子，而变成NH3。氨基酸是两性电解质(ampho1yte),两性离子：带有数量相等的正负电

8、荷的离子,氨基酸两性解离示意图,pH 1（pI，向正极移动),氨基酸的等电点,溶液中氨基酸以两性离子的形式存在时，溶液的pH，称为该氨基酸的等电点，用pI表示。,从左向右第一个拐点是氨基酸羧基解离50%的状态第二个拐点是氨基酸的等电点第三个拐点是氨基酸氨基解离50%的状态,甘氨酸的电离酸碱滴定曲线，用NaOH滴定，溶液的pH由小到大逐渐升高,例如丙氨酸有两个可解离基团，a-COOH和a-NH3，它们的解离常数pK值分别是2.4（pK1）和9.9（pK2）；组氨酸有3个可解离基团，即a-COOH、a-NH3和侧链基团咪唑基，pK值分别是1.8（pK1）、9.3（pK2）和6.0（pKR）。每一个

9、pK值都是位于滴定曲线缓冲区的中心，当丙氨酸处于pH2.4的缓冲液时，它的阳离子形式 和它的兼性离子形式 的摩尔浓度相等，同样在pH9.9时，它的兼性离子形式 和它的阴离子形式 的摩尔浓度相等。当氨基酸处于某一pH下，其净电荷为零时，该pH即为该氨基酸的等电点（pI）。pI可通过相应的pK值计算出。,pI（pKx pKy）/2 pKx，pKy为相应的两个可解离基团对于一氨基、一羧基的氨基酸，上式中的pKx 和pKy为它的pK1和pK2；而对于象天冬氨酸和谷氨酸那样的酸性氨基酸，pKx和pKy为它的pK1和pKR；而对于象赖氨酸、组氨酸和精氨酸那样的碱性氨基酸，pKx和pKy为它的pKR和pK2

10、。一个氨基酸带电状况取决于所处溶液的pH，当pI pH时，带净的正电荷。,氨基酸的等电点的作用,在一定的实验条件下，等电点是氨基酸的特征常数。不同的氨基酸，由于R基结构的不同，而有不同的等电点。当氨基酸处于等电点状态时，溶解度最小，容易发生沉淀；利用这一特性可以从各种氨基酸的混合物溶液中分离制取某种氨基酸。,7.氨基酸的重要化学反应,氨基酸与茚三酮的反应,氨基酸与茚三酮（ninhydrin）的反应是一个检测和定量氨基酸和蛋白质的重要反应。茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热，具有游离氨基的氨基酸都生成紫色化合物（l470），而亚氨基酸，则生成黄色化合物（l440）。在一定的反应条件下，产生的颜色的

11、强度（溶液中的光吸收）与氨基酸浓度成比例，根据溶液的吸光度，可以算出相应的氨基酸和蛋白质的浓度。,氨基酸与2,4-二硝基氟苯反应,2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB）也叫做Sanger试剂。DNFB在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反应，生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸（dinitro phenyl amino acid,DNP氨基酸）,氨基酸与丹磺酰氯的反应,丹磺酰氯（dansyl chloride）是5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯（5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl chloride）的简称。丹磺酰氯与氨基酸反应生

12、成荧光性质强和稳定的磺胺衍生物，也常用于多肽链的N末端氨基酸的鉴定。,氨基酸与苯异硫氰酸酯反应,苯异硫氰酸酯（phenylisothiocyanate,PITC）在弱碱性条件下，与氨基酸反应生成苯乙内酰硫脲（phenylthiohydantoin,PTH）衍生物，即PTH-氨基酸，这种衍生物是无色的，可用层析法鉴定,此反应又称之Edman反应，该反应是蛋白质或多肽氨基酸序列测定常用的反应。,第三节蛋白质的化学结构,蛋白质的化学结构,氨基酸组成多肽链数目末端氨基酸组成氨基酸排列顺序二硫键位置。,一、蛋白质的氨基酸组成,测定：用盐酸或NaOH对高纯度蛋白质样品进行彻底水解，再用氨基酸自动分析仪测定

13、。组成：即所含氨基酸的种类和数量。有两种表示方式：Aa g/100g 蛋白Aa个/个蛋白（已知分子量情况下）每一种蛋白质都有自己特定的氨基酸组成，氨基酸组成不同，则蛋白质不同。,二、肽键和肽链,肽键(peptide bond)，一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键，所形成的化合物称为肽。含有三个、四个、五个氨基酸的肽，分别称为三肽、四肽、五肽等。含有三个以上氨基酸的肽，统称为多肽(polypeptide)由许多氨基酸残基通过肽键彼此连接而成的链状多肽，称为多肽链(polypeptide chain),肽键,肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反

14、式结构存在。,氨基酸残基,组成多肽的氨基酸成为不完整的分子形式。被称为氨基酸残基(amino acid residue)。,三、蛋白质的一级结构,定义：就是蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序(sequence)是蛋白质最基本的结构。它是由基因上遗传密码的排列顺序所决定的。由于组成蛋白质的20种氨基酸各具特殊的侧链，侧链基团的理化性质和空间排布各不相同，当它们按照不同的序列关系组合时，就可形成多种多样的空间结构和不同生物学活性的蛋白质分子。蛋白质的一级结构决定了蛋白质的二级、三级等高级结构。,从多肽的结构可以看出，多肽的大多数离子电荷都是由它的组成氨基酸残基的侧链贡献的。所以一个多肽和蛋白质的离

15、子特性和它的溶解性都取决于它的氨基酸组成。此外就象我们将在下面看到的那样，氨基酸残基侧链之间的相互作用对于稳定一个蛋白质分子的三维结构有重要贡献。,有些肽比较大，例如胰岛素就是含有51个氨基酸残基的多肽，具有重要的生物学活性。但有些肽虽然比较小，也具有重要的生理功能例如加压素（9肽）和催产素（9肽）。一些神经多肽的类似物，如内啡肽，就是一种天然的止痛药。还有一些非常简单的肽也常用作食物的调味剂。如甜味剂Aspartame就是天冬氨酰苯丙氨酸的甲基酯（右图）。它的甜度是蔗糖的200倍，所以广泛用于食品饮料中。,多肽链的书写与名称,在多肽链中，肽链的一端保留着一个氨基，另一端保留一个羧基，带氨基的

16、末端称氨基末端(N端)；带羧基的末端称羧基末端(C端)。肽链书写：一般从N末端向C末端书写，N端写于左侧，用H做标帜，C端于右侧用OH表示。肽命名时为某某酰某某酰某某酸。,甲硫脑啡肽命名举例,中文氨基酸残基命名法：酪氨酰甘氨酰甘氨酰苯丙氨酰甲硫氨酸中文单字表示法：酪甘甘苯丙甲硫 1 2 3 4 5三字母符号表示法：TyrGlyGlyPheMet单字母符号表示法：YGGFM,蛋白质一级结构的测定,Sanger于1953年完成了第一个蛋白质胰岛素的氨基酸序列测定。每一种蛋白质都具有唯一的氨基酸序列，实际上蛋白质的氨基酸序列是由DNA决定的。蛋白质的氨基酸序列具有重要意义：蛋白质的氨基酸序列是阐明蛋

17、白质生物活性的分子基础；蛋白质的一级结构决定它的空间结构；氨基酸序列的改变可以导致蛋白功能异常和疾病；通过对一些蛋白质的氨基酸序列的比较可以反应出一些生物亲缘关系。,氨基酸的组成分析,一个已经纯化的蛋白质的氨基酸组成可以定量测定。首先通过酸水解破坏蛋白质的肽键，典型酸水解的条件是：真空条件下，110，用6M盐酸水解16至72小时。然后水解的混合物（水解液）进行柱层析，通过柱层析可以将水解液中的每一个氨基酸分离出来并被定量，这一过程称之氨基酸分析（amino acid analysis）。其中一种氨基酸分析方法是用苯异硫氰酸酯（PITC）处理蛋白质水解液（pH9），生成苯硫脲（PTC）-氨基酸衍

18、生物，PTC-氨基酸混合物经HPLC（细硅胶柱），按照它们的疏水特性被分离。分离的每个PTC-氨基酸经测量254nm（PTC-氨基酸吸收峰波长）光吸收，确定它们的浓度。下图给出了PTC-氨基酸混合物HPLC的洗脱图，图中的峰用各个氨基酸的吸收峰，用标准的单个字母表示。由于存在于水解液中每个氨基酸的量是与洗脱峰的面积成比例的。,缺点:,酸水解虽然很有用，但酸水解条件下不能获得完整的氨基酸分析，因为天冬酰胺和谷氨酰胺的侧链含有酰胺键，用于切断蛋白质肽键的酸也可以将天冬酰胺转换为天冬氨酸，谷氨酰胺转换为谷氨酸。所以当使用酸水解时，层析图中的谷氨酸和谷氨酰胺的总量用Glx或Z表示，而天冬氨酸和天冬酰胺

19、的总量用Asx或B表示。由于水解温度比较高，色氨酸的吲哚环容易被空气氧化，即使在密封的管中，色氨酸的吲哚环也几乎都被破坏了。因此蛋白质的色氨酸含量往往是通过它的紫外吸收光谱估计的，也可以通过碱水解分析色氨酸的含量。半胱氨酸在酸水解中也不能精确测定，要精确测量需要在蛋白质水解之前进行氧化或羧甲基化，形成的衍生物在酸水解之后才能定量。,Edman降解,1950年P.Edman公布了一项新的氨基酸序列的测定技术，即运用上述苯异硫氰酸酯与氨基酸的反应（Edman反应）。这种技术每次都只是从蛋白质的N端解离和鉴定一个氨基酸残基，这是一项使蛋白质序列分析革命化的技术。1967年Edman和Begg建成了多

20、肽氨基酸序列分析仪。,过程,P.Edman降解测序主要涉及耦联、水解、萃取和转换等4个过程。首先使用苯异硫氰酸酯（PITC）在pH9.0的碱性条件下对蛋白质或多肽进行处理，PITC与肽链的N-端的氨基酸残基反应，形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，即PTC-肽。然后PTC-肽用三氟乙酸处理，N-端氨基酸残基肽键被有选择地切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下来将该衍生物用有机溶剂（例如氯丁烷）从反应液中萃取出来，而去掉了一个N-端氨基酸残基的肽仍留在溶液中。萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定，经酸作用，再进一步环化，形成一个稳定的苯乙内酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸。,大蛋

21、白被水解成肽段后再测序,Edman降解法测序每次只能测定几十个氨基酸残基，所以要测定较大蛋白质的氨基酸序列，需要将其降解为一些肽段，经HPLC分离出各个肽段，然后再进行Edman降解测序。蛋白质降解常用的是一些水解酶（如胰蛋白酶）和化学试剂（如溴化氰）。一般都是采用两种酶（或化学试剂）解获得两组不同的肽段，以便最后拼出完整的氨基酸序列。,溴化氰（BrCN）可以特异与蛋白质中的蛋氨酸残基反应生成一个C末端为高丝氨酸内酯的肽和一个带有新的N末端残基的肽。,胰蛋白酶特异地催化赖氨酸残基和精氨酸残基羧基侧的肽键的水解，而胰凝乳蛋白酶特异地催化苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸三种芳香族氨基酸残基羧基一侧的肽键水

22、解,蛋白质一级结构的比较可以揭示进化关系,蛋白质一级结构是由编码它的基因确定的，蛋白质一级结构之间的差别可以反映出进化关系。亲缘关系密切的蛋白质的氨基酸序列非常类似，一级结构中氨基酸残基序列差别越大，它们的亲缘关系就越远。细胞色素c是由一条含有104至111个氨基酸残基的多肽链组成的，由于细胞色素c几乎存在于所有的需氧生物中，所以通过在分子水平上比较来自不同种属的细胞色素c，可以看出它们之间的进化关系。,下图是根据不同种属的细胞色素c的氨基酸残基的差别绘制出的进化树，每一个树杈的长度都与蛋白质中氨基酸残基的差别数成比例。例如人与黑猩猩的细胞色素c的氨基酸序列完全一样，但与猴、狗、金枪鱼和酵母的

23、细胞色素c相比，可变换的氨基酸残基数依次为1、10、21和44。那些进化中不易改变的、保守的氨基酸残基是维持细胞色素c功能所必需的。由同一个祖先进化来的表现出序列相似性的蛋白质称之同源蛋白质。,1955年Sanger等人用酶和化学方法成功测定牛胰岛素全部化学结构要求：纯度达到97%以上，样品的分子量和氨基酸组成必须事先测出步骤：末端测定二硫键测定两种裂解法制短肽纯化短肽自动蛋白测序仪分析肽段序列重迭法排序确定二硫键位置,牛胰岛素的结构,小 结,蛋白质是由20种氨基酸组成的。氨基酸性质方面的差别反映了它们侧链的不同。除了甘氨酸没有手性碳以外，其他19种氨基酸都至少含有一个手性碳。氨基酸的侧链可以

24、按照它们的化学结构分为：脂肪族的、芳香族的、含硫的、含醇的、碱性的、酸性的和酰胺类。氨基酸和多肽的酸性和碱性基团的离子状态取决于pH。许多氨基酸具有非极性的侧链，在水溶液中它们倾向于聚集在一起，以减少与水相互作用的面积，这种倾向称为疏水相互作用。,茚三酮与脯氨酸反应生成黄色化合物，与其它氨基酸生成的都是紫色化合物。2,4-二硝基氟苯、丹黄酰氯和苯异硫氰酸酯都能与氨基反应。蛋白质中的氨基酸残基是通过肽键连接的，残基的序列称之为蛋白质的一级结构。肽和小的蛋白质可以利用液相或固相合成法合成。可以根据蛋白质溶解度、净电荷、大小以及结合特性上的差异，从生物资源中纯化蛋白质。常用方法包括离子交换层析、凝胶

25、过滤层析、HPLC、SDS-PAGE、等电聚焦和双向电泳等方法。多肽的氨基酸序列可以通过Edman降解确定。利用蛋白酶和化学试剂有选择地水解，结合Edman降解可确定大的蛋白质的序列。比较蛋白质的一级结构可以揭示进化关系，种属的不同常反映在它们蛋白质的一级结构的差异上。,第四节蛋白质的高级结构,学习目标,掌握a-螺旋、b-折叠和胶原的结构特征，二级、三级和四级结构概念，维持蛋白质空间结构的主要作用力。熟悉肌红蛋白和血红蛋白结构特征以及它们的氧饱和曲线和镰刀型细胞贫血病的起因。,大多数蛋白质可以分为两种主要类型：纤维蛋白（Fibrous proteins）和球蛋白（globular protei

26、ns）。纤维蛋白的主要功能是维持和支撑单个的细胞和整个的有机体。a-角蛋白和胶原蛋白是最常见的纤维蛋白，a-角蛋白是毛发和动物尾巴的主要成分，而胶原蛋白是腱、皮肤、骨骼和牙齿的主要蛋白成分。大多数球蛋白是水溶性的、多肽链紧密折叠、轮廓上象一个球型的大分子。球蛋白典型特征是它有一个疏水的内部环境和一个亲水的表面.,概 念,蛋白质分子：蛋白质中具有完整生物功能的最小结构单位。有的包含一条多肽，有的包含多条多肽。蛋白质高级结构（构象）：一条或数条多肽链上所有原子在三维空间中的排布。构型的改变是由于共价键的变化产生的，构想的改变是由于单键的旋转产生的。,一、蛋白质的结构层次,由于蛋白质是个生物大分子，

27、结构比较复杂，所以其结构是通过四种水平描述的。其中包括蛋白质的一级结构（primary structure）、二级结构（secondary structure）、三级结构（tertiary structure）和四级结构（quaternary structure）。X-射线晶体结构分析法能测定晶体中蛋白分子构象；二维核磁共振法能分析水中蛋白分子构象。,一级结构就是共价连接的氨基酸残基的序列，它描述的是蛋白质的线性（或一维）结构。蛋白质的三维结构是通过另外三种水平：二级结构、三级结构和四级结构描述的。形成和维持（或称之稳定）这三种水平结构的力主要是非共价键。二级结构是通过肽键中的酰胺氮和羰基氧之

28、间形成的氢键维持的，通常二级结构指的是a-螺旋和b-折叠。,三级结构是指一条多肽链形成紧密的一个或多个球状单位或结构域，三级结构的稳定依赖于非相邻的氨基酸残基侧链的相互作用。四级结构并不是每个蛋白质都具有的，只有那些由两条或两条以上多肽链组成的蛋白质才具有四级结构，每一条肽链也称为亚基，肽链可以是相同的，也可以是不同的。,一般来说纤维蛋白的特性通过它的二级结构就可表现出来，但球蛋白的生物学功能通常都是以三级结构表现出来的，而某些球蛋白的生物学活性则需要四级结构。,二、肽单位平面结构和二面角,肽单位的特征,肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转；肽单位上的6个原子都位于同一个刚性平面上，称为酰胺平

29、面,尽管绕肽键旋转存在很大的障碍，但肽单位可以选择两种可能构象中的一种：反式（trans）构象，或顺式（cis）构象。,由于连接在两个a-碳上的侧链基团之间的立体干扰，不利于顺式构象的形成，对伸展的反式构象的形成有利，因此蛋白质中几乎所有的肽单位都是反式构象。但也有例外，一般都出现在脯氨酸的酰胺氮参与的肽键，只是顺式构象引起的立体干扰比反式构象多些。通过X-射线晶体分析发现蛋白质中大约有6的脯氨酸残基处于顺式构象,二面角,C2原子位于相邻二个肽平面的交线上，C2原子上的C2N1和C2C2键都是单键。肽平面1可以围绕C2N1单键旋转，其旋转的角度用表示；肽平面2也可以围绕C2C2单键旋转，其旋转

30、的角度用表示。由于和这二个转角决定了相邻二个肽平面在空间上的相对位置，因此，习惯上将这二个转角称为二面角(dihedral angle)。二面角决定多肽链主链骨架的构象。,C2,N1,C2,肽平面1,肽平面2,维持蛋白质分子构象的化学键,非共价键维持氢键范德华引力疏水作用力离子键二硫键配位键,二级结构,定义：指多肽链主链在一级结构的基础上进一步盘旋或折叠形成的有规律构象维系二级结构的力是氢键。二级结构不涉及氨基酸残基的侧链构象。主要类型-螺旋-折叠片-转角（回折）无规卷曲,-螺旋(-helix),每一圈包含3.6个残基，螺距0.54nm，残基高度0.15nm，螺旋半径0.23nm。每一个角等于

31、-57，每一个角等于-47。相邻螺圈之间形成链内氢键。即一个肽单位的羰基氧原子与其前的第三个肽单位的氨基氢原子生成一个氢键。氢键的取向与螺轴几乎平行。氢键封闭环本身包含13个原子。-螺旋构象允许所有的肽键都能参与链内氢键的形成。因此，-螺旋构象是相当稳定的，是最普遍的螺旋形式。与-碳原子相连的R侧链，位于-螺旋的外侧。,-折叠,二条-折叠股平行排布，彼此以氢键相连，可以构成-折叠片。为了在相邻主链骨架之间形成最多的氢键，避免相邻侧链间的空间障碍，各主链骨架同时作一定程度的折叠，从而产生一个折叠的片层。其侧链近似垂直于相邻二个平面的交线，交替地位于片层的两侧。,平行式反平行式,回折,在多肽链中，

32、经常出现180转弯的结构，此结构就是回折(reverse turn)。通常有-转角和-转角两种形式。-转角与转弯相关的有4个氨基酸残基，第一个氨基酸残基的CO和第四个氨基酸残基的NH之间形成氢键，称为41氢键，氢键封闭10个原子。另一种构象是-转角，第一个氨基酸残基的CO和第三个氨基酸残基的NH之间形成氢键，称为31氢键。,无规卷曲,没有规律性的多肽链主链骨架的构象，就是无规卷曲。球蛋白分子中，往往含有较多的无规卷曲。无规卷曲往往与生物活性有关。它对外界理化因子极为敏感。,超二级结构,在球状蛋白质分子的一级结构顺序上，相邻的二级结构常常在三维折叠中相互靠近，彼此作用，在局部区域形成规则的二级结

33、构的聚合体，就是超二级结构。常见的超二级结构有、等三种组合形式，另外还有、C结构（C代表无规卷曲）也可见到。在此基础上，多肽链可折叠成球状的三级结构。,结构域,在较大的蛋白质分子里，多肽链在二级结构基础上折叠成几个相对独立的球状区域，称为结构域。它是较大球蛋白分子三级结构的折叠单位。,三级结构,指一条多肽链在二级结构（超二级结构及结构域）的基础上，进一步的盘绕、折叠，从而产生特定的空间结构定义：广义讲，三级结构是指多肽链中所有原子的空间排布维系三级结构的力有疏水作用力、氢键、范德华力、盐键（静电引力）。另外二硫键在某些蛋白质中也起着非常重要的作用。,四级结构,定义：由相同或不同的亚基(或分子)

34、按照一定的排布方式聚合而成的聚合体结构较大的球蛋白分子，往往由二条或更多条的多肽链组成功能单位。这些多肽链本身都具有球状的三级结构，彼此以非共价键相连。这些多肽链就是球蛋白分子的亚基(亚单位)由少数亚基聚合而成的蛋白质，称为寡聚蛋白(Oligomer protein)；由几十个，甚至于上千个亚基聚合而成的蛋白质，称为多聚蛋白(polymer protein),寡聚蛋白特有的空间结构寡聚蛋白由数条具有三级结构的蛋白质通过次级键叠合而成亚基单独没有生物功能,亚基,血红蛋白,四亚基两两相同，分别称为1、2、1、2；,第五节多肽、蛋白质结构与功能的关系,一、多肽结构与功能的关系,催产素(oxytoci

35、n)和加压素(vasopression)都是由人和高等动物的垂体后叶所分泌的多肽激素。催产素能促进子宫和乳腺平滑肌收缩，临床上用于引产和减少产后出血；加压素有增加血压和抗利尿的作用，临床上用于治疗尿崩症等。二者以及结构相似，功能及相近有不同。,二、同功能蛋白质结构的种属差异与保守性,各种动物胰岛素(insulin)一级结构51个氨基酸残基中，只有24个氨基酸残基始终保持不变，称为保守氨基酸残基(保守残基)一般认为，与激素的活性中心以及维持活性中心构象有关可变动的氨基酸只是与免疫有关,细胞色素C一级结构,对50多种不同生物来源的细胞色素C的一级结构作了比较研究，发现35个氨基酸在各种生物中是保守

36、的。其中，Cysl4、Cysl7、Hisl8、Met 80、Tyr 48和Trp59是呈现电子传递功能的关键部位亲缘关系越远的生物氨基酸差异越大。,蛋白质的激活,使前体变成活性蛋白的过程，被称为激活（activation）胰岛素的激活,镰刀状贫血病血液中大量出现镰刀红细胞，患者因此缺氧窒息它是最早认识的一种分子病。流行于非洲，死亡率极高，大部分患者童年时就夭折，活过童年的寿命也不长，它是由于遗传基因突变导致血红蛋白分子结构的突变。,正常细胞 镰刀形细胞,卟啉铁,正常型-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys-链 谷氨酸镰刀型-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Ly

37、s-链 缬氨酸,谷A（极性）缬A（非极性）(了解)由于缬氨酸上的非极性基团与相邻非极性基团间在疏水力作用下相互靠拢，并引发所在链扭曲为束状，整个蛋白质由球状变为镰刀形，与氧结合功能丧失，导致病人窒息甚至死亡，但病人可抗非洲疟疾。,血红蛋白变构与运输氧功能,变构效应在寡聚蛋白分子中，一个亚基，由于与配体结合，而发生的构象变化，引起相邻其它亚基的构象和与配体结合的能力亦改变的现象。血红蛋白,(R)relaxed state,(T)tense state,血中氧分子的运送：,静脉,动脉,环境氧高时Hb 快速吸收氧分子,环境氧低时Hb 迅速释放氧分子,释放氧分子后Hb 变回 T state,蛋白质的变

38、性,天然蛋白质因受物理、化学因素的影响，使蛋白质分子的构象发生了异常变化，从而导致生物活性的丧失以及物理、化学性质的异常变化。这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。,蛋白质变性后的表现：生物活性丧失；溶解度降低，对于球状蛋白粘度增加；生化反应易进行；光吸收系数增大；组分和分子量不变。,引起蛋白质变性的主要因素,温度（热、冷）强酸、强碱尿素和盐酸胍的影响（破坏分子内部氢键、破坏疏水效应）表面活性剂的影响：如十二烷基硫酸钠（SDS）,蛋白质的复性,定义：当变性因素除去后，变性蛋白质又可恢复到天然构象，这一现象称为蛋白质的复性（renaturation）。蛋白质变性的预防和利用：医疗

39、方面；食品方面；蛋白质制备；酶制剂保存等。,第六节蛋白质的物理化学性质和分离提纯,1 蛋白质的分子量,沉降速度法沉降系数：一种蛋白质分子在单位离心力场里的沉降速度为恒定值，即沉降系数（S，Svedberg）用110-13秒表示凝胶过滤法仅适用于球状蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法它决定于蛋白质分子的大小,2 蛋白质的两性解离和等电点,蛋白质除了肽链末端基团外，还有各种侧链集团，是多价的两性电解质不同的蛋白质有不同的等电点,电 泳（electrophoresis）,在直流电场中，带正电荷的蛋白质分子向阴极移动，带负电荷的向阳极移动，这种现象称为电泳,3 蛋白质的胶体性质,蛋白质分子量已达到胶粒11

40、00nm范围之内，在水中形成水溶胶。胶体稳定的因素球状蛋白质的表面多亲水基团，使蛋白质分子形成水化膜，从而阻止蛋白质颗粒的相互聚集每个水化球状分子带有相同电荷,由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等,蛋白质的沉淀,定义：通过改变蛋白质胶体溶液的稳定性，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离的过程。非变性沉淀或可逆沉淀，在温和条件下，沉淀过程中蛋白质结构和性质都没有发生变化，沉淀在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基

41、本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。变性沉淀或不可逆沉淀，在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。加热沉淀（次级键）、强酸碱沉淀（影响荷电）、重金属盐沉淀（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag2+）和生物碱试剂或某些酸类沉淀等都属于不可逆沉淀。,可逆沉淀,等电点沉淀法盐析法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠）使蛋白质沉淀析出的现象（水与离子的相互作用增加了蛋白质表面的疏水补丁的相互作用；同时瓦解了以电荷为基础的蛋白质分子之间的作用）。分段盐析 盐溶：低浓度的中性盐可以增加蛋白质的

42、溶解度，此现象叫盐溶。有机溶剂沉淀法（脱去水化层、降低介电常数）。在低温下或缩短处理时间可防止或减缓变性）,蛋白质的颜色反应,双缩脲反应二个以上的肽键酚试剂反应Tyr的酚基将福林试剂还原茚三酮反应-氨基酸中的氨基和羧基,蛋白质的紫外吸收,大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定和定量测定。,二、蛋白质分离纯化的一般步骤,前处理粗分级细分级质量鉴定,几种常见的纯化蛋白质的方法,1 透析方法,通常是将浓缩液装在一个用赛咯吩（cellophane）制造的透

43、析袋内，两端都密封好，然后将透析袋悬浮在一个装有很多缓冲液的容器内进行透析（下图）。因为赛咯吩膜是半通透的膜，蛋白质等大分子不能透过膜，仍然留在袋内，但蛋白质周围的小分子可以与缓冲液进行交换，通过多次更换透析液，就可除去小分子（如硫酸铵）。经硫酸铵分级纯化、透析的粗分级的蛋白质样品可以通过以下一些常用的分离纯化技,2.凝胶层析,凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。单个凝胶珠本身象个筛子。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续

44、不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。（下图）给出了凝胶过滤分离蛋白质的示意图。,3 电泳SDSPAGE,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）,4 等电聚焦电泳,等电聚焦电泳（Isoelectric focusing electrophoresis

45、,IFE）等电聚焦电泳是一种电泳的改进技术，实际上是利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个pH梯度。所用的缓冲液是低分子量的有机酸和碱的混合物，该混合物称之两性电解质（ampholytes）。当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳时，每种蛋白质都将迁移至与它的pI 相一致的pH处（下图），具有不同pI的各种蛋白质最后都迁移至凝胶中相应的pH处，达到分离的目的。,5 双向电泳,双向电泳（two-dimensional electrophoresis）如果将等电聚焦电泳与SDS-PAGE结合起来，就是分辨率更高的一种双向电泳了（下图）。双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，

46、水平方向反映出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。,3.离子交换层析,离子交换层析，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电

47、荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。,第七节蛋白质分类,从蛋白质形状上分为球状蛋白质纤维状蛋白质从组成上可分为单纯蛋白质(分子中只含氨基酸残基)清蛋白(又名白蛋白)、球蛋白、谷蛋白、醇溶谷蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白等。结合蛋白质(分子中除氨基酸外还有非氨基酸物质，后者称辅基)核蛋白、磷蛋白、金属蛋白、色蛋白等。,名词术语,构型（configuration）：一个有机分子中各个原子特有的固定的空间排列。这种排列不经过共价键的断裂和重新形成是不会改变的。构型的改变往往使分子的光学活性发生变化。构象（conformation）：指一个分子中，不改变

48、共价键结构，仅单键周围的原子旋转所产生的原子的空间排布。一种构象改变为另一种构象时，不要求共价键的断裂和重新形成。构象改变不会改变分子的光学活性。肽单位（peptide unit）：又称之肽基（peptide group），是肽链主链上的重复结构。是由参与肽键形成的氮原子和碳原子和它们的4个取代成分：羰基氧原子、酰胺氢原子和两个相邻的-碳原子组成的一个平面单位。,蛋白质二级结构（protein secondary structure）:在蛋白质分子中的局部区域内氨基酸残基的有规则的排列，常见的二级结构有-螺旋和-折叠。二级结构是通过骨架上的羰基和酰胺基团之间形成的氢键维持的。蛋白质三级结构（p

49、rotein tertiary structure）:蛋白质分子处于它的天然折叠状态的三维构象。三级结构是在二级结构的基础上进一步盘绕、折叠形成的。三级结构主要是靠氨基酸侧链之间的疏水相互作用、氢键范德华力和盐键（静电作用力）维持的。,蛋白质四级结构（quaternary structure）:多亚基蛋白质的三维结构。实际上是具有三级结构的多肽链（亚基）以适当方式聚合所呈现出的三维结构。-螺旋(-helix)：蛋白质中常见的一种二级结构，肽链主链绕假想的中心轴盘绕成螺旋状，一般都是右手螺旋结构，螺旋是靠链内氢键维持的。每个氨基酸残基（第n个）的羰基氧与多肽链C端方向的第4个残基（第n4个）的酰

50、胺氮形成氢键。在典型的右手-螺旋结构中，螺距为0.54nm，每一圈含有3.6个氨基酸残基，每个残基沿着螺旋的长轴上升0.15nm。-折叠(-sheet)：是蛋白质中的常见的二级结构，是由伸展的多肽链组成的。折叠片的构象是通过一个肽键的羰基氧和位于同一个肽链或相邻肽链的另一个酰胺氢之间形成的氢键维持的。氢键几乎都垂直伸展的肽链，这些肽链可以是平行排列（走向都是由N到C方向）；或者是反平行排列（肽链反向排列）。-转角（-turn）:也是多肽链中常见的二级结构，连接蛋白质分子中的二级结构（-螺旋和-折叠），使肽链走向改变的一种非重复多肽区，一般含有216个氨基酸残基。含有5个氨基酸残基以上的转角又常