原核基因表达调控-研.ppt

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1、第六章 基因的表达与调控(上)原核基因表达调控模式,Contents,基因表达调控的基本概念原核基因调控机制乳糖操纵子色氨酸操纵子其他操纵子转录后水平上的调控,第一节 基因表达调控的基本概念,一、基因表达的概念随着生物个体的发育，DNA分子能有序地将其所承载的遗传信息，通过密码子-反密码子系统转变成蛋白质，执行各种生理生化功能。科学家把从DNA到蛋白质的过程称为基因表达（gene expression）对这个过程的调节就称为基因表达调控（gene regulation或gene control）,rRNA、tRNA编码基因转录合成RNA的过程也属于基因表达,组成性表达(constitutive

2、 expression)适应性表达(adaptive expression）,二、基因表达的方式,1、组成性表达：,指不大受环境变动而变化的一类基因表达。,某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因(housekeeping gene)。,2、适应性表达指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导(induction)，这类基因被称为可诱导的基因(inducible gene)；相反，随环境条件变化而基因表达水平降低的现象称为阻遏(repression)，相应的基因被称为可阻遏的基因(repressible gene)。,三、

3、基因表达的规律 时间性和空间性,1、时间特异性（temporal specificity）,2、空间特异性(spatial specificity),基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，所以空间特异性又称细胞或组织特异性(cell or tissue specificity)。,在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，称之为基因表达的空间特异性。,四、基因表达调控的生物学意义,适应环境、维持生长和增殖（原核、真核）维持个体发育与分化（真核）,第二节 原核基因调控机制,内容提要：原核基因表达调控环节操纵子学说原核基因调控机制的类型与特

4、点转录水平上调控的其他形式,一、基因表达调控环节,1、转录水平上的调控（transcriptional regulation）2、转录后水平上的调控（post-transcriptional regulation）mRNA加工成熟水平上的调控翻译水平上的调控蛋白质加工水平的调控,二、操纵子学说1、操纵子模型的提出1961年，Monod和Jacob提出获1965年诺贝尔生理学和医学奖,Jacob and Monod,2、操纵子的定义,操纵子：是基因表达的协调单位，由启动子、操纵基因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组成。操纵基因受调节基因产物的控制。,1、根据操纵子对调节蛋白（阻遏蛋白或激活

5、蛋白）的应答，可分为：正转录调控 负转录调控,三、原核基因调控机制的类型与特点,激活蛋白,正转录调控,负转录调控,正转录调控,如果在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的，加入这种调节蛋白质后基因活性就被开启，这样的调控叫正转录调控。,激活蛋白,正转录调控,负转录调控,负转录调控,在没有调节蛋白质存在时基因是表达的，加入这种调节蛋白质后基因表达活性便被关闭，这样的调控负转录调控。,可诱导调节：指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。例：大肠杆菌的乳糖操纵子 分解代谢蛋白的基因,2、根据操纵子对某些能调节它们的小分子的应答，可分为可诱导

6、调节和可阻遏调节两大类：,酶合成的诱导操纵子模型,诱导物,如果某种物质能够促使细菌产生酶来分解它，这种物质就是诱导物。,可阻遏调节：基因平时是开启的，处在产生蛋白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。例：色氨酸操纵子 合成代谢蛋白的基因,酶合成的阻遏操纵子模型,调节基因,操纵基因,结构基因,mRNA,酶蛋白,调节基因,操纵基因,结构基因,辅阻遏物,辅阻遏物,如果某种物质能够阻止细菌产生合成这种物质的酶，这种物质就是辅阻遏物。,3、在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor），起着阻止结构基因转录的作用。根据其作用特征又可分为负控

7、诱导和负控阻遏：在负控诱导系统中，阻遏蛋白与效应物（诱导物）结合时，结构基因转录；在负控阻遏系统中，阻遏蛋白与效应物（辅阻遏物）结合时，结构基因不转录。,4、在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白（activator）。根据激活蛋白的作用性质分为正控诱导和正控阻遏在正控诱导系统中，效应物分子（诱导物）的存在使激活蛋白处于活性状；在正控阻遏系统中，效应物分子（辅阻遏物）的存在使激活蛋白处于非活性状态。,正控诱导,正控阻遏,四、转录水平上调控的其他形式,1、因子的更换 在E.coli中,当细胞从基本的转录机制转入各种特定基因表达时，需要不同的因子指导RNA聚合酶与各种启动子结合。,大肠杆菌中

8、的各种因子比较,温度较高,诱导产生各种热休克蛋白 由32参与构成的RNA聚合酶与热休克应答基因启动子结合,诱导产生大量的热休克蛋白,适应环境需要,枯草芽孢杆菌芽孢形成 有序的因子的替换,RNA聚合酶识别不同基因的启动子,使芽孢形成有关的基因有序地表达,2.降解物对基因活性的调节,有葡萄糖存在的情况下，即使在细菌培养基中加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麦芽糖等诱导物，与其相对应的操纵子也不会启动，因而也不会产生出代谢这些糖的酶，这种现象称为葡萄糖效应或称为降解物抑制作用。为什么会产生这种效应呢？因为葡萄糖是最方便的能源，细菌无需开启一些不常用的基因去利用其他糖类。添加葡萄糖后，葡萄糖的存在会抑制细菌

9、的腺苷酸环化酶活性，减少环腺苷酸（cAMP）的合成，与它相结合的蛋白质，即环腺苷酸受体蛋白CRP又称分解代谢物激活蛋白CAP，因找不到配体而不能形成复合物。而cAMP-CAP复合物的形成又是乳糖、半乳糖或阿拉伯糖操纵子等表达所必须的。,3.弱化子对基因活性的影响 属于这种调节方式的有大肠杆菌中的色氨酸操纵子、苯丙氨酸操纵子、苏氨酸操纵子、异亮氨酸操纵子等等。起信号作用的是有特殊负载的氨基酰-tRNA的浓度，在色氨酸操纵子中就是色氨酰-tRNA的浓度。当操纵子被阻遏，RNA合成被终止时，起终止转录信号作用的那一段核苷酸被称为弱化子。这种因为核糖体在基因转录产物上的不同位置，决定了RNA可以形成哪

10、一种形式的二级结构、并由此决定基因能否继续转录的调节方式确实是非常巧妙的。起调节作用的信号分子是细胞中某一氨基酸或嘧啶的浓度，因此是转录调节中的微调整，好比无线电调谐器中的微调一样，只要稍加变动就可影响整个体系的功能。,4.细菌的应急反应,细菌有时会碰到紧急状况，比如氨基酸饥饿时，就不是缺少一两种氨基酸，而是氨基酸的全面匮乏。为了紧缩开支，渡过难关，细菌将会产生一个应急反应，包括生产各种RNA、糖、脂肪和蛋白质在内的几乎全部生物化学反应过程均被停止。实施这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸（ppGpp）和鸟苷五磷酸（pppGpp）。产生这两种物质的诱导物是空载tRNA。当氨基酸饥饿时，细胞中便存在大

11、量的不带氨基酸的tRNA，这种空载的tRNA会激活焦磷酸转移酶，使ppGpp大量合成，其浓度可增加10倍以上。ppGpp的出现会关闭许多基因，当然也会打开一些合成氨基酸的基因，以应付这种紧急状况。关于ppGpp的作用原理还不大清。ppGpp与pppGpp的作用范围十分广泛，它们不是只影响一个或几个操纵子，而是影响一大批，所以它们是超级调控因子。,小结,一个体系在需要时被打开，不需要时被关闭。这种“开-关”（on-off）活性是通过调节转录来建立的，也就是说mRNA的合成是可以被调节的。,第三节 乳糖操纵子(lac operon),内容提要：乳糖操纵子的结构酶的诱导lac体系受调控的证据乳糖操纵

12、子调控模型影响因子Lac操纵子中的其他问题,一、乳糖操纵子的结构,Z编码-半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖Y编码-半乳糖苷透过酶：使外界的-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。A编码-半乳糖苷乙酰基转移酶：乙酰辅酶A上的乙酰基转到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。,二、酶的诱导lac体系受调控的证据,在不含乳糖的培养基中，每个大肠杆功细胞内大约只有1-2个利用乳糖的酶分子。如果在培养基中加入乳糖，利用乳糖的酶浓度很快达到细胞总蛋白量的6%或7%，每个细胞中可有超过105个酶分子。由底物导致合成利用该底物的酶，这种现象称为酶的诱导。,如何确定诱导物的作用是诱导新酶合成，

13、还是将已存在于细胞中的酶前体转化为有活性的酶？,把大肠杆菌细胞放在加有放射性35S标记的氨基酸但没有半乳糖诱导物的培养基中繁殖几代然后再将这些带有放射活性的细菌转移到不含35S、无放射性的培养基中随着培养基中诱导物的加入，-半乳糖苷酶便开始合成分离-半乳糖苷酶，发现这种酶无35S标记说明酶的合成不是由前体转化而来的，而是加入诱导物后新合成的,同位素示踪实验,酶的诱导现象是生物进化过程中出现的一种合理、经济地利用有限资源的本能。酶诱导已证明是低等生物的普遍现象。,Jacob和Monod认为诱导酶（他们当时称为适应酶）现象是个基因调控问题，可以用实验方法进行研究，因此选为突破口，终于通过大量实验及

14、分析，于1961年建立了该操纵子的控制模型。,机制：阻遏蛋白的负性调节,无乳糖:lac操纵子处于阻遏状态(repression)有乳糖:lac操纵子即可被诱导 诱导剂(inducer):别乳糖、半乳糖、IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）,安慰诱导物：如果某种物质能够促使细菌产生酶而本身又不被分解，这种物质被称为安慰诱导物，如IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）。,三、乳糖操纵子调控模型,主要内容：Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码,这个mRNA分子的启动子（P）紧接着操纵基因（O），而位于调节基因（I）与O之间的启动子P，不能单独启动合成-半乳糖苷酶和透过酶的生理过程。,操纵

15、基因（O）是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点。,RNA聚合酶结合部位,阻遏物结合部位,操纵位点的回文序列,当阻遏物与操纵基因结合时，lac mRNA的转录起始受到抑制。,诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因结合，从而激发lac mRNA的合成。当有诱导物存在时，操纵基因区没有被阻遏物占据，所以启动子能够顺利起始mRNA的合成。,组成型突变：lacOc,几种突变对Lac操纵子的影响,组成型突变：lacI-,几种突变对Lac操纵子的影响,不可诱导突变（超阻遏）：,几种突变对Lac操纵子的影响,四、影响因子,1、lac操纵子的本底水平表达有两个矛盾是操

16、纵子理论所不能解释的：诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而转运诱导物需要透过酶，后者的合成又需要诱导。真正的诱导物是异构乳糖而非乳糖，前者是在-半乳糖苷酶的催化下由乳糖形成的，因此，需要有-半乳糖苷酶的预先存在。,解释：一些诱导物可以在透过酶不存在时进入细胞？一些透过酶可以在没有诱导物的情况下合成？一些诱导物可以在-半乳糖苷酶不存在时被分解成半乳糖？一些-半乳糖苷酶在没有诱导物的情况下合成？,本底水平的组成型合成：非诱导状态下有少量的lac mRNA合成。,2、大肠杆菌对乳糖的反应,培养基：甘油 按照lac操纵子本底水平的表达，每个细胞内有几个分子的-半乳糖苷酶和-半乳糖苷透过酶；培养基：

17、加入乳糖少量乳糖,透过酶,进入细胞,-半乳糖苷酶,异构乳糖,诱导物,诱导lac mRNA的生物合成,大量乳糖进入细胞,多数被降解为葡萄糖和半乳糖（碳源和能源）,异构乳糖,乳糖,诱导物的加入和去除对lac mRNA的影响,3、阻遏物lacI基因产物及功能,Lac 操纵子阻遏物mRNA是由弱启动子控制下组成型合成的，每个细胞中有5-10个阻遏物分子。当I基因由弱启动子突变成强启动子，细胞内就不可能产生足够的诱导物来克服阻遏状态，整个lac操纵子在这些突变体中就不可诱导。,4、葡萄糖对lac操纵子的影响,如果将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中，lac操纵子处于阻遏状态，不能被诱导；一旦耗尽外源葡萄糖，乳

18、糖就会诱导lac操纵子表达分解乳糖所需的三种酶。代谢物阻遏效应：葡萄糖对lac操纵子表达的抑制是间接的，不是葡萄糖本身而是其降解产物抑制lac mRNA的合成，科学上把葡萄糖的这种效应称为代谢物阻遏效应。,5、cAMP与代谢物激活蛋白,代谢物激活蛋白（CAP）/环腺甘酸受体蛋白（CRP）CRP+cAMP 复合物CAP,ATP,腺苷酸环化酶,cAMP（环腺苷酸）,大肠杆菌中：无葡萄糖，cAMP浓度高；有葡萄糖，cAMP浓度低,无葡萄糖，cAMP浓度高时促进转录,有葡萄糖，cAMP浓度低时不促进转录,CAP的正调控,当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用,如无CAP存在，即使没有阻遏蛋白

19、与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。cAMPCAP复合物与启动子区的结合是转录起始所必需的。,协调调节,单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。,第四节 色氨酸操纵子（trp operon）,内容提要：色氨酸操纵子的结构色氨酸操纵子的阻遏系统色氨酸操纵子的弱化机制,一、色氨酸操纵子的结构 调控基因 结构基因 催化分枝酸转变为色氨酸 的酶,trpR,trp,特点:(1)trpR和trpABCDE不连锁；(2)操纵基因在启动子内(3)有衰减子(attenuator)/弱化子(4)启动子和结构基因不直接相连，二者被 前导序列(Leader)所隔开,

20、二、trp 操纵子的阻遏系统,低Trp时：阻遏物不结合操纵基因;高Trp时：阻遏物+Trp 结合操纵基因,三、trp 操纵子的弱化机制,衰减子（attenuator）/弱化子前导序列（leader sequence）,1、弱化子：DNA中可导致转录过早终止的一段核苷酸序列（123-150区）。,123150,研究引起终止的mRNA碱基序列，发现该区mRNA通过自我配对可以形成茎-环结构，有典型的终止子特点。,2、前导序列：在trp mRNA5端trpE基因的起始密码前一个长162bp的mRNA片段。,3、弱化机制,前导肽,转录终止结构,细菌通过弱化作用弥补阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使转录

21、不起始，对于已经起始的转录，只能通过弱化作用使之中途停下来。阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少；弱化作用的信号则是细胞内载有色氨酸的tRNA的多少。它通过前导肽的翻译来控制转录的进行，在细菌细胞内这两种作用相辅相成，体现着生物体内周密的调控作用。,Contents,基因表达调控的基本概念原核基因调控机制乳糖操纵子色氨酸操纵子其他操纵子转录后水平上的调控,一、翻译起始的调控 RBS（核糖体结合位点）：mRNA链上起始密码子AUG上游的一段非翻译区。RBS的结合强度取决于SD序列的结构及其与起始密码子AUG之间的距离。SD-4-10（9）-AUG,第六节 转录后水平上的调控,二、稀有密码子对翻译的

22、影响,dnaG(引物酶)RNA引物,dnaG、rpoD和rpsU属于大肠杆菌基因组上的同一个操纵子,50个拷贝的dnaG蛋白、2800个拷贝的rpoD和40000个拷贝的rpsU,几种蛋白质中异亮氨酸密码子使用频率比较,细胞内对应于稀有密码子的tRNA较少，高频率使用这些密码子的基因翻译过程容易受阻，影响了蛋白质合成的总量。,三、重叠基因对翻译的影响,TrpB 谷氨酸-异亮氨酸-终止 GAA-AUC-UGA-UGG-AA AUG-GAA 甲硫氨酸 谷氨酸trpA,trpE苏氨酸苯丙氨酸终止 ACU-UUC-UGA-UGG-CU AUG AUG GCU 甲硫氨酸-丙氨酸-trpD,翻译终止时核糖体立即处在起始环境中，这种重叠的密码子保证了同一核糖体对两个连续基因进行翻译的机制。,