细胞工程第六章.ppt

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1、,第六章 动物细胞培养生物制药,第四节 动物细胞的大规模培养,第三节 动物细胞培养的应用,第五节 动物细胞生物反应器,第一节 动物细胞培养的基本概念及其优缺点,一、动物细胞培养的概念 动物细胞培养是指将动物活体体内取出的组织用机械或消化的方法分散成单细胞悬液，然后放在类似于体内生存环境的体外环境中，进行孵育培养，使其生存、生长并维持其结构与功能的方法。,二、动物细胞培养的优缺点1、动物细胞培养具有一系列优点：可简化细胞的生长环境。细胞培养技术使得在细胞存活的基础上独立研究细胞生命活动、逐项研究细胞生存条件和细胞功能成为可能。能够方便地控制实验因素。研究某种实验因素对细胞的生物学作用，只需在培养

2、液中有针对性地加入或者删除这种成分即可。,易于观测实验结果。利用细胞培养技术研究细胞的生命活动规律，可以很方便地采用各种实验技术和方法来观察、检测和记录。可供研究的细胞种类极其广泛。可同时提供大量均一性较好的细胞群，降低实验成本。,能够进行大规模生物制品的生产。目前，利用动物细胞大规模培养技术所生产的生物产品包括酶、单克隆抗体以及多种疫苗等生物制品或者基因工程产品。,2、动物细胞培养的缺点：体外培养的动物细胞对营养的要求较高。动物细胞生长缓慢，对环境条件要求严格。体外培养的细胞与体内生长的细胞存在或多或少的差异。组织和细胞离体之后，独立生存在培养环境中，缺乏在体内时的血液供应和神经体液调节作用

3、，其生物学行为与体内生长时相比会发生某些变化。,第二节 动物细胞培养发展史,一、动物细胞培养技术的创立 1907年，胚胎学家Harrison在无菌条件下，用盖玻片悬滴培养法将蛙胚髓管部组织在体外培养了数周，开创了动物组织和细胞培养的先河。,二、动物细胞培养技术的发展1、培养器材的发展,2、培养方法的发展双盖片悬滴培养法 旋转管培养的方法 灌注小室培养法,方便了更换培养液的操作，大大降低了污染的概率,培养物可交替地接触培养液和气体环境，利于细胞或组织成长,供新鲜培养液流入小室和旧培养液排出，从而使细胞生活在不断更新的培养液中,3培养液的发展天然培养基(胎汁、血浆和血清)人工合成培养基（需添加血清

4、）无血清细胞培养基（用激素、生长因子替代血清）,3、培养液的发展天然培养基(胎汁、血浆和血清)人工合成培养基（需添加血清）无血清细胞培养基（用激素、生长因子替代血清）,第三节 动物细胞培养的应用,一、在生物学领域基础研究中的应用1、在细胞生物学上的应用 研究动物的正常或病理细胞的形态、结构、生长发育、细胞营养、代谢以及病变等微观过程。2、在遗传学上的应用 除进行染色体分析外，还可结合细胞融合技术进行杂交育种。,3、在胚胎学上的应用 通过体外培养卵母细胞，进行体外受精、胚胎分割和移植，已应用于家畜的繁殖生产中。4、在病毒学上的应用 培养细胞为病毒的增殖提供了场所。5、在药理学领域的应用 药品、食

5、品添加剂等对机体的毒性及其产生不良影响的安全性调查，细胞培养技术为其提供了最简易而又可靠的方法。,许多致畸、致癌物质加入动物细胞培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。,二、在临床医学上的应用 1、用于遗传疾病和先天畸型的产前诊断 用羊膜穿刺技术获得胎儿细胞，培养后进行染色体分析，诊断胎儿是否患有遗传性疾病或先天畸型。2、用于癌症的早期诊断和预防 通过培养淋巴细胞，对其染色体进行对比分析检测出易患癌症的病人，进行及早的预防和治疗。,3、用于临床治疗 目前已有将正常骨髓细胞经大量培养后植入患造血障碍症患者体内进行治疗的报道。4、用于药物效应的检测 检测的药物具有组织特异性时，可选用相应的

6、细胞，如检测治疗肝病的药物可选用肝细胞、检测抗癌药物可选用癌细胞。,三、在动物育种上的应用 新品种的培育可大大缩短育种进程，且更加经济有效。胚胎干细胞的研究成果和克隆羊多莉的问世为动物遗传育种开辟了一条新途径。四、在生物制品生产上的应用 用动物细胞可生产的生物制品有各类疫苗、干扰素、激素、酶、生长因子、病毒杀虫剂、单克隆抗体等。,第四节 动物细胞的大规模培养,一、动物细胞大规模培养概述（一）动物细胞大规模培养技术的概念 指在人工条件（除满足培养过程必需的营养要求外，还要进行pH和溶解氧的最佳控制）下，在细胞生物反应器中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。,生物制品生产中适合工业化生产

7、的细胞株有：CHO（Chinese hamster ovary cell）：从中国仓鼠卵巢分离的细胞，亚二倍体，有多种突变株，贴壁生长，也可以悬浮培养，对剪切力和渗透压改变有较高的忍受能力。,BHK 21细胞（Baby hamster kidney cell）：是1961年英国从幼地鼠的肾脏分离的细胞。成纤维样，异倍体。常用于增殖病毒制备疫苗和重组蛋白。,Vero细胞（Vero cell）:是1962年日本从非洲绿猴肾中分离的细胞。成上皮型，异倍体，贴壁型，是最常用的大规模培养的动物细胞。,（二）动物细胞大规模培养技术的应用1、生产疫苗 目前，通过动物细胞大规模培养已实现商业化的疫苗产品有口蹄

8、疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、巨细胞病毒疫苗等。2、生产干扰素3、生产多肽和蛋白质类药物4、生产人源化单克隆抗体,（三）动物细胞大规模培养的一般工艺流程,1 组织块；2组织块碎片；3消化；4离心；5原代培养；6一传代培养；7一液氮罐保存细胞；8复苏培养；9扩大培养；10大规模生物反应器培养,二、动物细胞大规模培养的方法和操作方式（一）动物细胞大规模培养的方法 根据动物细胞的培养特性不同，可采用悬浮培养、贴壁培养和固定化培养三种培养方法进行大规模培养。,1、悬浮培养 指细胞在生物反应器中自由悬浮生长增殖的培养方法。主要用于非贴壁依赖型细胞培养，杂交瘤细胞

9、、血液白细胞、淋巴细胞、某些肿瘤细胞等属于此类细胞。贴壁型细胞贴附在微载体上或者包裹在微囊中后可以接种在适当生物反应器中实现悬浮培养。,悬浮培养的优点：操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧效果比较好，容易扩大培养规模。悬浮培养的缺点：不能采用灌流培养，导致细胞密度较低，另外只有少数细胞适合悬浮培养。,搅拌式生物反应器,气升式生物反应器,2、贴壁培养 指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。贴壁培养的优点：容易更换培养液；容易采用灌注式培养；提取产物时不需过滤系统去除细胞；适用于所有类型细胞。贴壁培养的缺点：扩大培养比较困难，投资大，占地面积大；不能有效监测细胞的生长。,课堂测验（三）小结,1、

10、杂交瘤细胞的筛选方法HAT培养基筛选B淋巴细胞：HGPRT+，TK+存活，6-10天骨髓瘤细胞：HGPRT-，TK-死亡杂交瘤细胞：双亲性状，HGPRT+，TK+存活,1、杂交瘤细胞的筛选方法HAT培养基筛选B淋巴细胞：HGPRT+，TK+存活，6-10天骨髓瘤细胞：HGPRT-，TK-死亡杂交瘤细胞：双亲性状，HGPRT+，TK+存活,2、动物细胞大规模培养的工艺流程主要包括哪些步骤？1 组织块；2组织块碎片；3消化；4离心；5原代培养；6一传代培养；7一液氮罐保存细胞；8复苏培养；9扩大培养；10大规模生物反应器培养,中空纤维培养,细胞工厂培养,微载体培养,目前为细胞提供贴附表面的培养基质

11、主要有旋转瓶、中空纤维、细胞工厂和微载体等。,兼具悬浮培养和贴壁培养的优点,（1）旋转瓶培养 细胞贴附在转瓶或转管的内表面，培养液随旋转而流动，细胞交替接触营养和空气，利于细胞吸收营养、进行气体交换。,细胞在体内、体外的生存空间：存在差异,三维空间，高密度生长,二维空间，单层生长，生长密度低,体内,体外,（2）中空纤维培养 中空纤维培养技术模拟细胞在体内生长的三维状态，利用一种人工的“毛细血管”即中空纤维来为细胞提供物质代谢条件。,中空纤维是细微的管状结构，管壁为极薄的半透膜，水分子、小分子营养物质和气体可以通过。管壁表面有许多海绵状多孔结构，细胞能在上面贴壁生长。,细胞接种到中空纤维的外表面

12、，而充氧的培养液灌流到中空纤维的内腔。贴附在外表面的细胞吸取内腔渗出的营养，迅速生长繁殖。一段时间后细胞占据中空纤维外壁所有空间，并在纤维表面堆积。,（3）细胞工厂培养由一组长方形培养小室组成。(a)向培养室内灌注培养液，培养液在各培养小室之间流动；(b)细胞工厂转动90。，每个培养小室液体被分隔，气相仍到达各个培养小室；(c)向下放平，封闭入口，或者连接到5CO2通气管上,（4）微载体培养微载体（Microcarrier）：是直径60-250m的适用于贴壁依赖型细胞生长的微粒。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。,微载体培养是在培养容器内加入培养液及对细胞无害的颗粒微载体，作为载体，

13、使细胞在微载体表面附着并呈单层生长繁殖，通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态的培养方法。微载体使利用生物反应器进行动物细胞大规模培养成为可能，既能满足动物细胞的贴壁要求，又能充分利用生物反应器的内部空间。,良好微载体的特点：1、好的生物相容性：无毒无害；2、好的黏附性：适于细胞附着、伸展和增殖，一般带正电荷；3、大的比表面积：颗粒均匀，孔径均一；4、良好的传质性能；5、强的机械性能：保护细胞、重复利用；6、好的热稳定性：适合高压蒸汽灭菌。,动物细胞贴壁生长的主要环节有哪些？1、潜伏期：（1）游离期：接种的细胞在培养液中呈悬浮状态。（2）吸附期：不同类型的细胞贴壁时间有所差异。2、对数生长期：悬

14、浮细胞贴壁后经过一段停滞后开始分裂。随着细胞数量增多，细胞间开始接触并连接成片，出现接触性抑制。3、停滞期：细胞长满载体表面，随着营养物消耗和代谢物积累，密度抑制现象出现，细胞开始退化。如不及时传代培养，细胞脱落死亡。,知识点回顾,微载体培养的操作过程：微载体培养动物细胞也经过以上四步。大致可以分为五个阶段，即培养初期阶段、黏附贴壁阶段、维持培养阶段、细胞收获阶段、微载体培养的放大阶段。,培养初期阶段：保证培养基与微载体处于稳定的p和温度，对数生长期细胞接种至1/3体积的培养基中。黏附贴壁阶段：缓慢加入培养液至工作体积，增加搅拌速度保证完全均质混合。维持培养阶段：随细胞增殖，微球变重，增加搅拌

15、速率。经过3天左右，培养液呈酸性，需换液。细胞收获阶段：排干培养液，缓冲液漂洗1次，加入酶，快速搅拌，解离收集细胞及其产品。微载体培养的放大阶段：增加微载体的含量或培养体积进行放大。,微载体培养的优点：1、表面积体积大，单位体积培养液的细胞产率高。2、把悬浮培养和贴壁培养融合，兼有两者的优点。3、可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况。4、培养系统占地面积和空间小；劳动强度小；放大容易，使大规模培养动物细胞成为可能。5、接种与收获方便，可循环、连续收获与培养，培养基利用率较高。,微载体培养的缺点：细胞生长在微载体表面，培养过程中连续搅拌会损伤微载体表面的细胞，而且培养后期细胞容易从微载体

16、上脱落下来。为克服传统的实心微载体的不足，现开发出大孔微载体。大孔微载体内部具有网状结构的小孔，细胞在其内部生长，保证细胞充分的生长空间，使细胞免受机械损伤，增加细胞贴壁的稳定性。,3、固定化培养 将动物细胞与水不溶性载体结合起来再进行培养的方法。具有细胞生长密度高，抗剪切力和抗污染能力强等优点，细胞易与产物分开，有利于产物分离纯化。在动物细胞培养中要考虑使用较温和的固定化方法，如吸附培养法、包埋培养法和微囊培养法。,（二）大规模培养技术的操作方式1、分批式培养2、流加式培养3、半连续式培养4、连续式培养 5、灌注式培养,将细胞和培养液一次性转入生物反应器内，培养过程中体积不变，不添加其他成分

17、，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基。,将终体积1/31/2的培养液装入反应器中，适宜条件下接种细胞，培养过程中流加浓缩的营养物或培养液，使细胞持续生长至较高密度、目标产品达到较高水平,在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间取出部分培养物，再用新培养液补足到原有体积，维持反应器内总体积不变,将细胞接种于一定体积的培养基，细胞达最大密度之前，以一定速度连续添加新鲜培养基，同时含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积恒定,细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断将部分培养基取出，同时连续不断地灌注新培养基。取出部分培养基

18、时，绝大部分细胞通过细胞截流装置保留在反应器内,灌注培养,1、细胞截流系统使细胞留在反应器内，维持较高细胞密度，提高产品的产量；2、细胞稳定处在好的营养环境中，有害代谢物积累少；3、反应速率容易控制，培养周期较长，可提高生产率，目标产品回收率高；4、可连续性收获产品。,第五节 动物细胞生物反应器,动物细胞生物反应器是整个动物细胞大规模培养过程的关键设备，它为动物细胞的生长代谢提供了一个最优化的环境，从而使其在生长代谢过程中产生出量足质优的所需产物。,一、理想的动物细胞生物反应器必须满足如下要求：1、在低剪切力及良好的混合状态下，能够提供充足的氧以供细胞生长及细胞进行产物的合成；2、生物反应器的

19、结构要有比较好的传质、传热以及密闭的性能，既能保证培养细胞的正常生长和产物的合成，又能避免外来污染；3、制造反应器所用的各种材料要对细胞无毒性；4、培养环境的各种物理化学参数能自动检测和调节控制，并且精度要高，以利于培养过程的检测和调节；5、反应器应便于操作和维修。,二、动物细胞培养的生物反应器1、搅拌罐式生物反应器2、气升式生物反应器3、中空纤维生物反应器,1、搅拌罐式生物反应器 气泡用丝网隔开，不与细胞直接接触。反应器既能保证混合效果又尽可能减小剪切力，以满足细胞生长的要求。,2、气升式生物反应器 用气流代替不锈钢叶片进行搅拌，因而产生的剪切力相对温和，对细胞损伤较小。另外，气升式生物反应

20、器采用完全封闭式设计，便于无菌操作，不易污染；直接喷射空气供氧，氧的传递效率高。,3、中空纤维生物反应器分为中空内腔与中空外腔两部分，每部分各有其进出口。新鲜培养液从中空内腔导入，气体在管体部分通过。细胞吸取从内腔渗出的营养物质，迅速生长繁殖。,柱式中空纤维生物反应器,板框式中空纤维生物反应器,中心灌流式中空纤维生物反应器,中空纤维生物反应器的优点：1、模拟细胞在体内生长的三维状态。2、既可用于悬浮细胞的培养，又可用于贴壁细胞的培养。细胞如果是贴壁型的，则附着在纤维外壳表面，培养结束后用胰酶将其消化冲出；若是非贴壁型的，应采用微滤材料将其截留在反应器内而让培养液排出。3、无剪切力影响，高密度培养，传质效率高。缺点：容易堵塞，价钱昂贵。,本章小结,1、动物细胞大规模培养的工艺流程主要包括哪些步骤？2、微载体的选择有何要求？3、理想的动物细胞生物反应器应满足哪些基本要求？试比较所介绍的几种生物反应器 各自的优缺点。,