NK杀伤实验.ppt

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1、实验一 肿瘤细胞增殖抑制实验,（细胞活力分析仪）,原 理,Vi-CELL XR活力分析仪是视频成像系统，用于分析培养基或悬浮液中的酵母、昆虫和哺乳动物细胞。该分析仪可自动执行目前已被广泛接受的台盼蓝染色排除法，适用于多种细胞类型的分析。当细胞死亡，细胞膜破裂，从而使台盼蓝染料能够透过。结果，死细胞或已失去活力的细胞颜色比活细胞要深一些。通过对这种色调的对比测量，从而能够测量到细胞活力。,台盼蓝染色排除法示意图,活细胞排除染料,染料透过死细胞,图像分析方案,贝克曼库尔特Vi-CELL XR系统可自动执行台盼蓝染色法。通过最新的视频捕获技术和样品处理法，Vi-CELL XR将抽取细胞样品转移到流动

2、池，然后照相机对其进行拍照。Vi-CELL XR至少可拍摄100张图像，以用于细胞活力检测。对细胞是否已吸收台盼蓝染料，可通过软件进行确定。吸收了台盼蓝染料的细胞，颜色要深一些，因此其灰度值较低。而具有高灰度值的细胞可视为活细胞。,与MTT法之间的比较,Vi-CELL细胞活力计数可对一个或多个实验组的总细胞数和死细胞数进行绝对计数，而MTT则通过测定活细胞所形成的甲臜溶解后的光密度值间接反映活细胞数量，二者的原理不同。由MTT还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被DMSO溶解后才能检测,会对实验结果的准确性产生一定影响；而且MTT从加入到进行检测需要4个小时，方法烦琐，耗时较长。Vi-CELL细胞

3、活力计数法可即时检测，相对简单。在进行贴壁细胞的检测时，MTT法可直接加入MTT，进行检测；而采用细胞活力计数法则必须将培养板中的细胞消化下来，再进行计数。,Vi-cell操作步骤,一、登陆样品 将至少为0.5mL（最多为2.0mL）的样品放入样品杯内。1.将样品杯置于下一个可用的样品架位置。2.单击Log in sample（登录样品）按钮，以登录样品。在样品架上选择样品杯位置（适用时）。输入Sample ID（样品ID）。注意不要使用特殊字符如、=、:、/等。选择Cell type（细胞类型）。如果样品已预先经过稀释，选择Dilution factor（稀释因子）。单击OK（确定）。,按下

4、Start queue（开始排列），即可开始进行分析。,二、选择细胞类型 在登录样品后，选择适当的细胞类型。如果细胞类型不存在，新建一个细胞类型。细胞类型可以通过单击导航栏上的细胞类型图标进行查看。细胞类型图标,细胞类型屏幕操作人员应对每种细胞类型预先设置仪器和测量参数，以确保分析结果准确。,三、记录数据,如图所示：活细胞为白色，周围有绿色线包围，死细胞为黑色，周围有红线包围。,注意事项：,1.细胞活力以百分比、浓度和细胞数表示。2.浓度检测范围在50,000-10,000,000个细胞/毫升。3.细胞直径在3-70m。容许的最小直径为3m。利用最 小直径可排除碎片和/或不需要的细胞。细胞类型

5、容许的 最大直径为70m。4.样品杯中样品至少0.5ml，最多2ml。5.试剂盒类型：绿色-缓冲液；红色-消毒剂；黄色-洗涤 剂；蓝色-台盼蓝试剂6.注意试剂盒试剂含量，更换备用试剂盒。7.处理废液注意安全,肿瘤细胞增殖抑制实验（MTT法）,原 理,四甲基偶氮唑盐(MTT)是一种黄色的染料。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，将淡黄色的MTT还原成蓝紫色、不溶于水的甲臜（Formazan）颗粒。该颗粒溶解后，其液体的吸光度值（A）与活细胞数及细胞代谢活性呈正相关。因此可根据光密度A值推测出活细胞的数目。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT 不会产生

6、甲臜。,实验方法:,取对数生长期的U937细胞，台盼蓝染色检测细胞活性。调细胞浓度为 5104/ml,接种于96孔板,每孔100l,将不同浓度药物经倍比稀释后分别加入各孔中，分别设200ug/ml,100ug/ml,50ug/ml三组,每种浓度3个复孔，另设细胞对照组。对照组：100l细胞 100l 培养液 各实验组：100l细胞 100l抗肿瘤药物溶液将培养板置于37,5%CO2孵箱孵育48h.,5.培养结束前4小时加入MTT（5mg/ml），10ul/孔。6.酶标仪检测各组A值，570nm为检测波长，630nm为参考波长。7计算不同浓度药物对U937细胞的增殖抑制率。抑制百分率=(对照组A

7、570-630实验组A570-630)/对照组A570-630 100%。8绘制增殖抑制曲线。,注意事项,1.严格无菌操作，避免污染。细胞计数、加板要准确。2.采用不同浓度药物溶液进行实验时，必须进行倍比稀释，使加样时每孔细胞溶液和药物溶液均为100ul。切勿使用移液器将未经稀释的药物原液直接加入96孔板内。,实验二 NK细胞杀伤功能测定,（MTT法）,淋巴细胞分离技术分离液密度梯度离心分离法,原 理 淋巴细胞分离液是由聚蔗糖（Ficoll）和泛影葡胺（Hypzue）按一定比例混合制成，其分子量大又无化学活性，20C时比重为1.077+0.002，淋巴细胞比重为1.070与之相似，而粒细胞和红

8、细胞比重为1.092左右。分离时，血液或其他细胞液层加于分离液上，形成清楚界面，通过离心，使一定比例的细胞按一定密度梯度分布：粒细胞和红细胞沉于分离液以下，淋巴细胞在清楚界面上形成纯细胞层，从而把淋巴细胞分离出来。,Ficoll-Hypaque-,Diluted blood-,-Plasma,-Lymphocyte,Monocyte,-Ficoll-Hypaque,Centrifugation,Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation,材料仪器1、肝素防凝人外周血（肝素500U/ml）2、淋巴细胞分离液、无Ca2+、Mg2+Hanks液（Ha

9、nks 液）、10%小牛血清RPMI1640培养液（1640培液）、白细胞稀释液、苔盼蓝染液3、可调式移液器、吸头、离心管、平口滴管、吸管、细胞计数板等4、生物安全柜（无菌操作时采用）、普通显微镜等,方 法1 肝素防凝人外周血加入1-4倍量Hanks液稀释混匀。2、取2ml淋巴细胞分离液加入10ml离心管中，将稀释的血 液用滴管沿离心管壁层加于分离液上（血：分离液=1-4：1），保持两者的清楚界面。3、水平离心2000rpm/15分，小心取出。4、用平口滴管小心吸出界面上白色雾状的淋巴细胞层，用 Hanks液洗二次，离心分别为第一次2000 rpm/10分；第二次1500 rpm/10分。5、

10、加1640培液0.5-1ml悬起、混匀细胞。,6、细胞活力测定：取少许混匀细胞加入苔盼蓝染液（细 胞:染液=1:1），低倍镜下观察，不着色者为活细胞，着色者为死细胞。计数200个细胞，计算活细胞百分率。7、细胞计数：混匀细胞，用白细胞稀释液做一定稀释后，灌 于细胞计数板的计算池内，低倍镜下计数，按下式计算每 ml细胞数：细胞数/ml=4个大方格细胞数4稀释倍数1048、用1640培液将细胞调至所需浓度备用。,注意事项1、分离细胞时严格保持血液/细胞悬液与分离液两 者的清楚界面，切勿形成气泡。2、细胞活力测定时，活细胞应达95%以上。,实验原理,四甲基偶氮唑盐(MTT)是一种黄色的染料。活细胞线

11、粒体中的琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，将淡黄色的MTT还原成蓝紫色、不溶于水的甲臜（Formazan）颗粒。该颗粒溶解后，其液体的吸光度值（A）与活细胞数及细胞代谢活性呈正相关。因此可根据光密度A值推测出活细胞的数目。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT 不会产生甲臜。,材料仪器,1、肝素防凝外周血（肝素500U/ml）、NK靶细胞：K562细 胞（人红白血病细胞株）2、淋巴细胞分离液、无Ca2+、Mg2+Hanks液（Hanks 液）、5mg/ml MTT、RPMI1640培养液、白细胞稀释 液、苔盼蓝染液、生理盐水3、96孔圆底、平底培养板、可调式移液器

12、、吸头、离心 管、滴管、吸管、细胞计数板等4、生物安全柜、CO2培养箱、酶标仪、普通显微镜、倒置 显微镜等,方 法,1、K562细胞传代培养，取生长旺盛的细胞备用。2、肝素防凝外周血常规分离淋巴细胞（见附：淋巴细胞分离 技术），Hanks液洗三次，计数及活力测定后，用1640培 液调细胞数为5、2.5106/ml。3、取预先培养好、生长旺盛的K562细胞，Hanks液 1500rpm/10分洗三次，生理盐水稀释计数及活力测定后，用1640培液调细胞数为1105/ml。4、将效靶比=50:1、25:1的淋巴细胞（效）、K562细胞（靶）加入96孔圆底板：实验组分别加入各效靶比的效、靶细胞 各10

13、0l/孔；同时设靶细胞孔及效应细胞孔作为对照孔。上述各组均设3个复孔。另加仪器调零孔1640培液200l/孔，1孔。,靶细胞 每孔靶细胞（1104）和1640培液各100l 效应细胞 50:1 每孔效应细胞（5105）和1640培液各100l 50:1 效应细胞(5105),靶细胞（1104）各100l效应细胞 25:1 每孔效应细胞（2.5105）和1640培液各100l 25:1 效应细胞(2.5105),靶细胞（1104）各100l 离心500rpm/5min，使效靶细胞密切结合。,5、置37、5%CO2培养箱培养4小时。6、每孔加入10l MTT(5 mg/ml)，继续孵育4小时。7、

14、3000rpm/10min，离心，弃上清，每孔加DMSO 150 l，充分混匀，10分钟内酶标仪检测570 nm波长A值。按下述公式计算杀伤率:杀伤率(%)=1(实验孔A值效应细胞孔A值)/靶细胞孔A值100%,结果判定,1、实验孔的A值应高于效应细胞和靶细胞对 照孔。2、人外周血NK细胞杀伤活性正常参考值：效靶比=50:1，男性48.65+17.29%；女 性50.10+15.33%注意事项 效靶细胞的计数及加样要准确。,实验三酶联免疫吸附实验,（ELISA）,ELISA是酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay)的简称。它是继免疫荧光和放射免疫

15、技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。,（一）基本原理,1、基本原理 先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原进行反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分，然后加入酶的作用底物催化显色，进行抗原或抗体的定性或定量检测。,2、常用方法（1）间接法 此法常用于测抗体。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗体）与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体（酶标抗抗体）和底物显色进行测定（图1）。,图1 间接法测抗体示意

16、图,（2）双抗体夹心法 此法常用于测抗原。将已知抗体吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗原）与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗体和底物显色进行测定（图2）。,图2 双抗体夹心法测抗原示意图,（3）竞争法 此法常用于测抗原和半抗原，也用于测抗体。以测抗原为例，将特异抗体吸附于固相载体，加入待测抗原和酶标已知抗原，使两者竞争与固相抗体结合，经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关，即待测抗原和酶标抗原颜色反应的差数是待测抗原的含量（图3）。,图3 竞争法测抗原示意图,试验管,对照管,3、ELISA方法新的改进和发展,ELISA方法由于灵敏、特异，操作简便、快速，实验设备要求较为

17、简单，应用范围广泛，无放射性污染等优点，成为目前普及应用最广，发展最快的免疫学技术之一。生物素-亲合素系统（BAS）是在ELISA中应用的常见技术（BAS-ELISA），其中ABS-ELISA法更为常用，其基本原理为，固相抗体+待测抗原+生物素化抗体+亲合素-酶标生物素复合物+底物显色。,ABS-ELISA法,ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子量60,000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产

18、物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）。,在LAB中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点，在ELISA应用中有替代

19、前者的趋势。科研项目中检测血清或培养上清中的微量成分,如细胞因子常采用本法。,人白细胞介素2（IL-2）检测（双抗体夹心-ELISA法）,原 理,双抗体夹心ABC-ELISA法。抗人IL-2单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的人IL-2会与单抗结合，游离的成分被洗去。同时加入生物素化的抗人IL-2抗体和辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合；抗人IL-2抗体与结合在单抗上的人IL-2结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色剂，若反应孔中有人IL-2，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测A值，人IL-2浓度与A450值之间呈正比，可通过绘制标

20、准曲线求出标本中人IL-2浓度。,图4 人白细胞介素2（IL-2）检测（ABC-ELISA法）原理示意图,材料仪器,1、人IL-2 ELISA试剂盒 1a 标准品 1支(1000pg，冻干)4 1b 标准品和标本稀释液(黄色)1瓶(16ml)4 2a 浓缩生物素化抗体 2/1支*(60l)4 2b 生物素化抗体稀释液 1瓶(16ml)4 3a 浓缩酶结合物 2/1支*(60l)4(避光)3b 酶结合物稀释液(红色)1瓶(16ml)4 4 浓缩洗涤液100(兰色)1瓶(10ml)4 5a 显色剂A 1瓶(6ml)4 5b 显色剂B 1瓶(6ml)4(避光)6 终止液 1瓶(6ml)4 抗体包被板

21、条812 或 86 4 封板胶纸 1张 说明书 1份*:96/48 Test,2、酶标仪(450nm)3、高精度加液器及吸头：2-20,20-200,200-1000l 4、双蒸水或去离子水，坐标纸等,标本收集1、收集血液的试管应为无热原和内毒素试管。血浆抗凝剂为EDTA。标本应清澈透明，避免溶血，高血脂，如有悬浮物应离心去除。2、标本收集后若不及时检测，按一次用量分装，冻存于20，避免反复冻融。,方 法,1、提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未用完的放 回4。3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻干标准 品(1a)

22、,静置15分钟后混匀(浓度为1000pg/ml),根据需 要进行倍比稀释。未用完的复溶标准品放入-20保存,稀释的标准品不应重复使用。4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释（可做预实 验，以确定稀释倍数）。,5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回46、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/孔加入 板条的相应孔中，标准品和标本应作双复孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37孵箱孵育90分钟。7、洗板4次。8、除空白孔外，加入稀释好的生物素化抗体工作液 100ul/孔，封住板孔，37孵箱孵育60分钟。9、洗板4次。,10、除空白孔外，加入酶结合物工作液 100ul/孔，封住板孔，

23、37孵箱孵育30分钟。11、洗板4次。12、各孔加入显色剂100ul/孔，避光37孵箱孵育 10-15分钟。(视显色深浅灵活掌握)13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测A450 值(5分钟内)。,结果判断及计算,1、每个标准品和标本的A值应减去零孔的A值。2、绘制标准曲线，以标准品浓度作横坐标，A值作纵坐 标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的A值 可在标准曲线上查出其浓度。3、若标本A值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计 算浓度时应乘以稀释倍数。4、试剂盒灵敏度：最小可测人IL-2达2pg/ml.,标准曲线示意图,注意事项:1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350l，静 止30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干，洗4次。2、冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，加 热溶解后再配制。3、装量极少的试剂(2a和3a)应先离心或用手甩几下，以使 管壁液体沉于管底。4、不同批号的试剂盒组份不能混用。5、检测标本如为组织培养液，应用培养液作为标准品/样品 稀释液。6、充分混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使 用最低频率)，如无微量振荡器，可在反应过程中每10分 钟手工混匀一次。,