免疫学检测与免疫学技术.ppt

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1、免疫学检测与免疫学技术,一、抗原抗体的检测技术二、免疫细胞的检测三、细胞因子的检测四、免疫相关基因分析五、免疫标记技术六、免疫PCR(IM-PCR)技术 七、杂交瘤技术与T细胞克隆技术八、新型抗体的制备技术九、抗原的制备技术,一、概述 免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研究中的应用。免疫学技术的应用极为广泛,疾病的诊断、疗效评价及理论研究等。二、抗原抗体的检测技术*根据反应的基本原理与表现主要分为凝集反应、沉淀反应和补体参与的各种反应*根据抗原抗体反应设计的试验还有标记抗原(或抗体)检测相应物质的标记技术。,对机体

2、参与免疫应答的细胞进行鉴定,计数及功能测定(一)细胞计数1.荧光抗体染色2.免疫酶染色技术:*ABC法*APAAP法3.免疫金银染色法(IGSS)4免疫细胞化学法5四聚体法6TCR链测定,三、免疫细胞的检测,(二)免疫细胞功能的测定 1.T细胞功能测定：肿瘤，病毒感染，免疫缺陷，自身免疫病等(1)细胞增殖(转化)试验：可分为非特异性丝裂原和特异性抗原两类。*丝裂原主要有PHA、Con A和PWM；*抗原刺激物有破伤风类毒素、PPD和白色念珠菌等；*同种MHC及抗CD3单抗等*肿瘤细胞-自体淋巴细胞混合培养(2)T细胞介导的细胞毒试验：CTL(3)分泌功能检测(4)T细胞功能的体内检测法*接触性

3、超敏反应*移植物抗宿主反应(GVHR)*迟发型超敏反应(DTH),2.B细胞功能判定(1)B细胞增殖(转化)试验：*PWM、SAC，LPS（对小鼠B细胞）；*抗IgM抗体及EB病毒等(2)溶血空斑形成试验(3)反向溶血空斑试验(4)酶联免疫斑点法(ELISPOT):ELISPOT是一种可检测抗体分泌细胞，又可测定抗体分泌量的体外实验方法。*此法的主要优点是:稳定、特异，且抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定量测定；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。,3.NK细胞活性测定 体外检测NK细胞活性的方法有形态学检查法，放射性核素释放法，酶释放法，化学发光法及流式细胞术等。测定人NK

4、细胞活性常以K562细胞株作为靶细胞，测定小鼠NK细胞活性常用YAC1 细胞为靶细胞。(1)形态学检查法(2)放射性核素释放法：用放射性核素(51Cr、125I UdR)标记靶细胞。(3)酶释放法：测定靶细胞膜受损后从胞浆内释放至介质中的乳酸脱氢酶(LDH)活性。*NAG酶荧光比色法:NAG酶是细胞浆中存在的一种溶酶体酶,与其底物作用后,生成荧光产物,应用荧光分光光度计测定，敏感性明显高于LDH比色法。而且方法简单，结果稳定，重复性好。,(4)化学发光法(5)流式细胞术：应用FCM检测NK细胞活性是根据PI染料排斥法。PI渗入死亡细胞内与DNA和RNA结合，在488nm波长激发下产生绿色荧光。

5、此法既可以测定单个细胞毒活性，也可以用于总细胞毒活性试验。*还可利用荧光染料法,细胞光扫描法，双标记细胞毒法测定细胞毒性细胞的杀伤效应。,4吞噬细胞功能测定(1)中性粒细胞趋化功能测定：一般采用滤膜渗透法(Boyden小室法)或琼脂糖平板法。(2)中性粒细胞吞噬、杀菌功能测定1)显微镜检法2)NBT试验：此项试验是测定中性粒细胞吞噬、杀菌功能的一种简易方法。3)化学发光测定法：中性粒细胞在吞噬过程中出现呼吸爆发,产生活性氧代谢产物。此类活性氧化基团与细胞内杀菌作用密切相关，同时又能激发细胞内某些物质产生化学发光。,(4)巨噬细胞细胞毒测定:通常取小鼠腹腔巨噬细胞，以-干扰素为激活剂使其活化，作

6、为效应细胞。用125I-UdR标记的DBA/2小鼠肥大细胞瘤P815作为靶细胞。(3)巨噬细胞吞噬功能测定：中药斑蝥酒精浸液敷贴法诱发无菌性皮炎，从皮肤水泡渗出液中收集巨噬细胞，在体外进行鸡红细胞吞噬试验，计算吞噬率和吞噬指数，作为判断巨噬细胞吞噬功能的指标。,四、细胞因子的检测,（一）免疫学检测法 免疫学检测的基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。如免疫斑点法、ELISA法、RIA法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测。某些细胞因子含量甚微的样品(如脑脊液)可用免疫聚合酶链反应(immuno-PCR)进行检测。,（二）生物学测定法 根据细胞因子对特定的生物学活性,应用相应的指示系统,同时

7、与标准品对比测定,从而得知样品中细胞因子的活性水平,一般以活性单位(U/ml)表示。靶细胞可直接从组织中分离,如骨髓细胞的集落形成试验和胸腺细胞(脾细胞)的增殖试验,或用体外培养的依赖细胞因子才能生长的细胞因子依赖株及对细胞因子杀伤敏感的细胞作为靶细胞。,1.促进细胞增殖和增殖抑制法*多种IL、表皮生长因子、转化生长因子、神经生长因子、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子*各种CSF作用于造血系统的不同细胞,可促进其增殖及在半固体琼脂凝胶系统中克隆培养骨髓细胞的集落形成,故可采用集落形成试验研究CSF的水平*常用的检测细胞增殖的方法有3H-TdR掺入法、比色法、染色法和

8、直接计数法等。其中测定细胞代谢酶反应细胞增殖数的比色法包括 MTT、XTT、MTS和NAG等方法。,2.细胞毒活性测定法 许多细胞因子(TNF)针对转化的细胞及病毒感染的细胞具有溶细胞或抑制细胞生长的活性。,3.抗病毒活性测定法 常用于检测抗病毒活性的细胞株有WISH,Hep2/c,L929,A549和MDBK等。其中WISH和Hep2/c细胞株用以检测人干扰素,L929细胞株用于检测小鼠干扰素,Ratec细胞株用于检测大鼠干扰素,而MDBK细胞株则可用于检测多种族的IFN-和IFN-。常用于攻击细胞的病毒有滤泡性口炎病毒(VSV)、鼠脑心肌炎病毒(EMCV)以及Sindbis virus等病

9、毒。检测抗病毒活性的方法:测定细胞因子抑制病毒的致细胞病变效应(CPE)、抑制病毒蚀斑形成或抑制病毒的产量等。,4.趋化活性测定法 多种细胞因子具有趋化活性，分别能诱导中性粒细胞、单核/巨噬细胞和淋巴细胞定向迁移 趋化因子诱导细胞移动的方式包括趋化性和化学增活现象。趋化性(chemotaxis)是指诱导细胞向趋化因子化学浓度高的方向作定向移动,可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验测定细胞因子的趋化活性；化学增活现象(chemokinesis)是指增强细胞的随机运动,可采用琼脂糖小滴化学动力学试验检测。,(三)分子生物学测定法 RNA印迹法、核酸酶保护分析、原位杂交、PCR和Real Time PCR

10、等。亦可通过检测细胞内细胞因子的基因组成或mRNA量，推算出细胞因子的合成量。,(四)单个细胞产生细胞因子测定法 常用的方法有反向溶血空斑试验(RHPA)和反向ELISA斑点试验(1)反向溶血空斑试验(RHPA):RHPA是一种体外检测抗体分泌细胞的试验,亦可用于检测细胞因子。(2)酶联免疫斑点试验(ELISPOT):所用的包被抗体与酶标抗体应分别针对细胞因子的不同抗原决定簇,(五)细胞内细胞因子的检测 采用FCM免疫荧光技术可从单细胞水平检测不同细胞亚群中的细胞因子,用两种标记的荧光抗体可在一种细胞内同时测定两种不同的细胞因子。,细胞因子受体检测的基本技术,细胞因子的广泛生物学活性是通过与各

11、自相应的受体结合而发挥的。因此细胞因子受体的检测与细胞因子检测一样，已成为基础理论和临床免疫学研究的一个重要内容。,五、粘附分子的检测,某些粘附分子除表达于细胞膜表面外，还以可溶性形式存在于体液中。粘附分子的检测方法目前大多采用免疫学技术检查其在细胞膜上的分布和测定某些样品中的含量。,六、免疫相关基因分析,*包括各种类型的杂交技术，如转印杂交、斑点杂交、原位杂交等以及PCR技术等。杂交技术主要工具是核酸探针，它是指一段用放射性核素或其他标记物(生物素、荧光素、地高辛等)标记，并与目的基因互补的DNA片段或单链DNA、RNA。分为cDNA探针、寡核苷酸探针、基因组DNA探针及RNA探针等。*核酸

12、探针技术的操作主要包括：质粒DNA的提取；靶DNA片段的分离；靶DNA片段的标记；待测样品mRNA的提取；标记cDNA探针与待测样品进行杂交；放射自显影或显色分析。,(一)细胞因子基因组DNA或mRNA的检测 1.Northern杂交分析 2.斑点杂交法 3.原位杂交法 4.PCR扩增产物杂交分析 是将细胞因子的mRNA经过逆转录为cDNA，用特异性细胞因子引物进行PCR扩增，通过Southern blot后，再用标记探针检测特异细胞因子DNA的水平。5Southern印迹杂交 6.斑点及狭缝印迹杂交:将DNA变性后直接点样于硝酸纤维膜上再进行杂交 7.细胞因子mRNA表达的测定还可采用RT-

13、PCR、原位杂交与原位PCR,RNA半寿期的检测,进行中的转录分析等。,(二)BCR及TCR克隆性基因重排分析 1Southern印迹杂交法：仅适用于科研，而不适用于临床诊断。2.PCR扩增技术:正常多克隆淋巴细胞群DNA的扩增产物含有不同长度的片段，电泳检查呈现弥漫涂片状结构或多条带。而单克隆性基因重排经PCR扩增后，产生明显相同长度的片段，电泳呈现单一紧密折带状结构*应用PCR 扩增技术进行基因诊断具有特异、敏感(1/1041/105克隆性细胞)、快速(24h可完成)等优点。*用于恶性淋巴瘤和白血病等的临床诊断以及白血病治疗后微小残留病灶的检测。,(三)HLA基因分型技术 1序列特异性寡核

14、苷酸探针PCR(PCR-SSOP)或PCR-ASO:PCR-SSOP是目前应用最多的一种简单、快速而又精确的HLA-类抗原分型方法，能鉴定所有已知序列的HLA-DR、DQ、DP等位基因，精确地分析DNA的多态性。2限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术：此项技术特别适用于个别标本和小样本的检测。3单链构象多态性PCR（PCR-SSCP）：藉此可鉴别编码HLA-类抗原基因的多态性。应用PCR-SSCP可以直接比较供、受体之间HLA-类基因是否完全一致，且可精确到12个碱基之差，具有相对简捷而精确的特点。在异基因骨髓移植的配型中已初步应用于临床。,4序列特异性引物PCR技术(PCR-SSP)

15、：该法操作简单、快速、实验结果容易判断，杂合子也很易检出。不足之处在于，为检出所有的等位基因必须用多个引物进行扩增。5指纹图谱(PCR-fingerprinting)技术|：进行HLA-基因分型鉴定时，将供、受体的DNA扩增产物混合，电泳后得出一指纹图，再与二者各自的PCR指纹图谱进行比较，从中选择出指纹图一致的供、受体进行移植。*PCR指纹图谱在选择非亲缘关系的供、受体进行骨髓和器官移植配型时，可以节省大量时间。6.SNP(单个核苷酸多态性)分析(四)补体基因分析(五)抗体基因分析(六)细胞膜分子基因分析,七、免疫标记技术,(一)免疫荧光技术(二)放射免疫分析法(三)酶免疫技术(四)发光免疫

16、测定,八、免疫PCR(IM-PCR)技术,免疫PCR是将抗原抗体的特异性反应与PCR技术结合起来,用以检测微量蛋白质的方法。免疫PCR是用DNA分子标记特异性抗体，利用PCR可大量扩增DNA片段的特点，从而将检测灵敏度大大提高，最低检测值可达10-21mol/L。1.直接免疫PCR 是将抗原包被在固相载体上,用特异性单抗结合此抗原,再用生物素化抗体通过亲合素连接生物素化DNA,然后将后者进行PCR 2.间接免疫PCR 系将所测物的单抗包被在固相载体上,然后使所测抗原与之结合,再将特异性抗体生物素化,并通过亲合素连结生物素化DNA分子而将后者进行PCR,九、新型抗体的制备技术,(一)对鼠源性抗体

17、的改造 1人-鼠嵌合抗体(chimeric antibody)：鼠源性单抗的V区，人免疫球蛋白的C区。,2人源化抗体 将鼠抗体的互补决定区(CDR)与人IgFR和C连接构建“人源化抗体”。(1)模板替换:使用与鼠对应部分有较大同源性的人FR替换鼠FR区,例如可通过CDR移植构建“改型抗体”(2)表面重塑:对鼠CDR及FR表面残基进行重塑或镶饰,使之类似于人抗体CDR的轮廓或人FR的型式。(3)补偿变换:在人FR选择与CDR有互补作用、与抗体的亲和力有密切关系或对FR空间结构折叠起关键作用的残基进行改变,以补偿完全的CDR移植(4)定位保留:通过计算机模建从现有的人源抗体保守序列中搜寻与鼠FR区

18、最类似的序列,根据最简位置模板确定鼠可变区的关键位置残基,并保留所有这些位置而将其余部分进行人源化。,3.小分子抗体(1)ScFv：由VH和VL中间连以1415个小肽,常用的连接肽为(Gly4Ser)3(2)VH与VL适当部位各引入一个半胱氨酸形成以二硫键固定的Fv段而构成的DsFv(3)将ScFv中两个可变区之间的接头缩短,使两分子间VH和VL配对形成双价小分子抗体(Diabody)(4)将两种不同特异性的V基因交叉配对,则可得到双特异性Diabody(5)在ScFv的一端加上一个双聚化结构亦可构建不同类型的双价或双特异性小分子抗体,如Minibody等,(二)抗体库技术(三)产生嵌合抗体的

19、小鼠和产生人抗体的小鼠 利用基因打靶和取代的方法以及转基因技术产生嵌合抗体。通过转基因、基因缺失及杂交和选择等一系列过程，获得双转染基因(人H、链基因)的纯合小鼠。其脾、淋巴结、骨髓中的B细胞可表达人的链。,(四)细胞内抗体*细胞内抗体是指在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体,亦称为内抗体(intrabody)。*若在抗体基因的N端或C端加入引导序列就能使抗体表达定位亚细胞部位,如胞浆、线粒体、内质网或细胞核部位。*若在细胞内表达特异识别与肿瘤发生有关的癌基因编码的抗体,即可抑制癌基因编码产物的表达,可用于肿瘤的治疗。*细胞内免疫用于病毒性疾病的治疗*抗EGFR胞外区的ScFv-R IR,并在

20、ScFv-R IR的C-末端连接KDEL肽,提供ER滞留,(五)基因工程抗体衍生技术 1双特异性抗体(BsAb)或称双功能抗体(BfA)。2.抗体的抗原化技术：借助人源化抗体的构建方法，以抗体V区作为分子载体来表达生物学相关的多肽或外源性抗原表位，即抗原化抗体(antigenized antibody,AbAg)。3抗体重组免疫毒素 4.催化抗体(catalytic antibody)或抗体酶(abzyme)：将催化活性引入抗体的结合部位,产生一种具有抗体和酶双功能的蛋白质,称为抗体酶或程序性酶(programmable enzyme)。,十、杂交瘤技术与T细胞克隆技术,一、杂交瘤技术 1.B

21、细胞杂交瘤技术与单抗的制备 2.T细胞杂交瘤技术与其功能的研究二、T细胞克隆技术*按其特异性分为抗原特异性和非特异性T细胞克隆。*按其功能则可分为辅助性和细胞毒性T细胞克隆。(一)抗原特异性T细胞克隆(二)抗原非特异性T细胞克隆的制备(三)同种反应性TH和CTL克隆的制备(四)肿瘤抗原特异性CTL克隆,细胞凋亡的检测,一、概述细胞凋亡(apoptosis,Apo)是生物体内无用的、老化的一些损伤细胞自动死亡的一种形式，是指在一定的生理和病理情况下,机体为维护内环境的稳定,通过基因调控而使细胞自动消亡的过程。,二、细胞凋亡与细胞坏死的区别*细胞坏死是细胞膜,线粒体膜结构、流动性、渗透性及受体等均

22、受损,进而细胞溶解、坏死；而细胞凋亡时上述结构和功能均保持不变；*细胞坏死时,ATP和蛋白质合成抑制及终止;细胞凋亡时,ATP、mRNA和蛋白质合成依旧,细胞第二信号系统仍活动;*细胞坏死时,细胞DNA随机降解,电泳不呈梯状图谱;细胞凋亡时,DNA多降解成180200bp或其倍数的梯状片段,电泳呈梯状图谱;*细胞坏死时,细胞内容物外溢,引起局部炎症反应或组织损伤;细胞凋亡时,细胞内容物不外溢,所以不引起炎症反应或局部损伤;*细胞坏死时,往往是成团细胞死亡;细胞凋亡时,在组织中呈分散状态分布。,三、研究细胞凋亡的意义1.细胞凋亡在肿瘤形成和治疗中具有重要作用。*凋亡基因与抗凋亡基因突变 易形成肿

23、瘤；*免疫效应细胞表达FasL,肿瘤细胞表达Fas诱导肿瘤细胞凋亡 抗肿瘤*肿瘤细胞高表达FasL诱导免疫细胞凋亡 抑制免疫功能逃避免疫监视*肿瘤细胞低表达或不表达Fas 逃避免疫监视,2.细胞凋亡与免疫学的关系*细胞凋亡与T细胞在胸腺的发育*细胞凋亡与成熟T细胞：AICD*细胞凋亡与与B细胞*细胞凋亡与胞毒效应3.细胞凋亡参与自身免疫病的发生4.细胞凋亡与病毒感染*抗病毒免疫防御*细胞凋亡与AIDS*细胞凋亡与病毒性肝炎,细胞凋亡的检测方法,一、形态学方法 1普通光学显微镜检测法 2荧光显微镜检测法 材料：石蜡切片;冰冻切片;细胞学涂片。方法一：PI染液：碘化丙啶(propidium iod

24、ide,PI)；DAPI染液；AO染液：*荧光显微镜下观察。PI染色选用600nm的激发光,DAPI选用460500nm的激发光,AO染色选用520nm的激发光。*HE染色核DNA呈蓝色,而PI染色呈红色,DAPI染色呈蓝白色,AO染色呈黄绿色。凋亡细胞呈现核浓缩,染色加深,或核染色质呈新月形聚集于核膜一边;晚期凋亡细胞表现为核碎裂成大小不等的圆形小体被细胞膜包绕,即凋亡小体。,方法二：Hoechst 33342/PI双标记法*在荧光显微镜下观察，凋亡细胞的蓝色荧光比活细胞和非凋亡细胞都要强，其光散射能力则降低，将二者结合起来，可以很好地鉴定凋亡细胞。坏死细胞则由于PI复染，呈红色荧光。是目前

25、细胞凋亡最满意的形态学分析方法。*样品来源 培养细胞或离体细胞制成的单个细胞悬液。,方法三：碘化丙啶（PI）和Hoechst 33342(HO)双染法PI和HO均可使用紫外光激发，其荧光分别为红光和蓝光。对照活细胞的HO蓝色荧光最强，而早期凋亡细胞由于其DNA降解和丢失，其HO蓝色荧光较弱，也有很弱的PI红色荧光。晚期凋亡细胞PI红色荧光增强，坏死细胞PI红色荧光最强，而HO蓝色荧光较弱。,3凋亡小体的电镜观察 小体系由细胞膜卷曲、脱落形成的小泡,其内包含有完整的细胞器及核片段。,二、生物化学方法 电泳法 DNA梯带(DNA ladder)。,三、免疫学方法(ELISA法)*细胞凋亡的发生,是

26、由于内源性核酸内切酶的激活,核小体间区双链DNA解开,产生单/低聚核小体片段,而核小体DNA由于与组蛋白H2A、H2B、H3和H4形成紧密复合物而不被核酸内切酶裂解。采用双抗体夹心酶免疫法,应用小鼠抗DNA和抗组蛋白的单克隆抗体,与核小体片段形成夹心结构,可特异性检测细胞溶解物中的单/低聚核小体。,四、原位末端转移酶标记技术(TdT或TUNEL)凋亡细胞由于内源性核酸内切酶的激活,核DNA被切割成许多双链DNA片段以及高分子量DNA单链断裂点(缺口),暴露出大量3羟基末端,如用(TdT)将标记的-dUTP进行缺口末端标记,则可原位特异地显示出凋亡细胞。(一)荧光标记法*采用美国Oncor公司ApopTag TM 试剂盒，或德国Boehringer Mannheim公司In Situ Cell Death Detection试剂盒(二)酶标记法*采用美国Oncor公司ApopTagTM-Peroxidase试剂盒,