分子遗传学基因治疗.ppt

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1、1,基因治疗 Gene therapy,2,（一）、基因治疗的发展简史、概念及背景（二）、基因治疗的基因导入系统（三）、基因治疗的途径（四）、基因治疗的靶细胞研究（五）、基因治疗在单基因遗传病、肿瘤和心血管疾病治疗上的应用（六）、基因治疗面临的问题和挑战（七）、基因治疗的发展方向,3,（一）、基因治疗的发展简史、概念及背景,4,基因治疗的发展简史,5,基因治疗的概念,经典：针对遗传病某一基因缺陷，将外源基因导入体内予以矫正；现在：凡是在基因水平上进行操作而达到治疗疾病的所有疗法,6,上世纪九十年代初，一位因ADA(腺苷酸脱氨酶)基因缺陷导致严重免疫缺损的四岁女孩，由美国国立卫生研究院用ADA基

2、因治疗，取得疗效。“基因治疗”研究热从此波及全世界，起而效颦，为保障人类健康展现了美好的前景。,7,8,截止到2012年1月，基因治疗试验的全球分布：,9,截止到2012年1月，基因治疗试验的国家分布：,10,基因治疗的疾病类型：,11,基因治疗试验的临床阶段：,12,1989-2012年1月，每年全球被批准的临床数目：,13,基因治疗选用的载体分类,14,世界第一个基因治疗药物在中国诞生,人民网深圳2003年10月22日15：30急电 正在这里召开的深圳市政府新闻发布会向世界公布了一项振奋人心的消息：“世界首个基因治疗药物在中国诞生”。深圳市赛百诺基因技术有限公司研制开发的抗癌新药“重组人p

3、53腺病毒注射液”（商品名“今又生”），10月16日获得国家仪器药品监督管理局颁发的新药证书。这标志着我国在基因治疗药物研制和产业化方面已达世界领先水平，在国际竞争中抢占了先机。赛百诺公司负责人说，这种新药是拥有自主知识产权的广谱肿瘤基因治疗药品，可望明年一月正式上市。,15,根据靶细胞的类型分类：1、生殖细胞（germ cell)基因治疗：2、体细胞（somatic cell)基因治疗 根据基因转移的途径分类：1、in vivo(活体直接转移或称一步法）2、ex vivo(回体转移或称二步法）,基因治疗的种类,16,1、基因置换基因置换就是用正常的基因原位置换病变细胞内的致病基因，使细胞内的

4、突变致病基因完全恢复正常状态，这种基因治疗方法最为理想。但这种方法是建立在同源重组技术基础上的，而目前同源重组虽然在技术上可行，但重组的效率很低，远没达到基因治疗要求的水平，在临床试验上就更无法实现了。,基因治疗的策略,17,2、基因修复基因修复是指将致病基因的突变碱基序列定点纠正，可用来治疗点突变导致的疾病。但由于纠错效率低的原因，实践中有相当的难度。,18,3、基因增补将目的基因导入患者体内，其表达产物能补偿缺陷细胞的功能，可用于隐性遗传病的治疗。,19,4、基因失活利用反义技术特异性封闭、抑制有害基因表达，可用于一些显性遗传病或肿瘤的基因治疗。,20,Andrew Z.Fire、Crai

5、g C.Mello,21,1998年Andrew Z.Fire、Craig C.Mello等发现将很少量的双链RNA注入秀丽线虫体内，即可高效、特异地阻断/抑制与双链RNA同源的基因表达，其阻断/抑制率比纯化后的反义RNA技术高若干个数量级。双链RNA导入细胞后引起与该段RNA同源的mRNA发生特异性降解，进而使相应基因抑制的转录后基因沉默现象称RNA干扰。,22,双链RNA特异性核酸内切酶（dsRNA-specific endonuclease，Dicer）切割，形成21-23nt的双链短干扰RNA（short-interference RNA，siRNA），siRNA链为5端磷酸化，3端有

6、二个碱基以非配对方式悬垂。,23,siRNA与由蛋白及酶类组成的RNA诱导沉默复合体（RNA-Induced Silencing Complex，RISC）结合后，由于RISC具有解旋酶活性，siRNA中的正义链和反义链解旋、解链。随后正义链被降解，而与RISC结合的反义链则按照碱基互补配对原则与靶mRNA中的同源序列结合，并由RISC发挥核酸内切酶作用，在距siRNA3断11或12个碱基处切割靶mRNA。,24,倍增放大作用：siRNA一方面可引导RISC特异性切割靶mRNA；另一方面，siRNA还可作为引物与靶mRNA结合，在RNA依赖性RNA多聚酶（RNA-dependent RNA p

7、olymerase，RdRp）的作用下合成新的ds-RNA，再次经Dicer酶切割，形成新的siRNA，并作用于靶mRNA。,25,RNA干扰,26,微小RNA（microRNA）,微小RNA（microRNA）大量存在人类基因组中的非编码RNA，能特异识别成熟mRNA的3非翻译区，抑制mRNA的翻译。微小RNA（microRNA）1993 年Lee等在对秀丽线虫进行突变体的遗传分析中首次发现的不能编码蛋白质，但能时序调控其胚胎后期发育基因表达的miRNA:Lin一4。,27,2000年Reinhart等在线虫中发现了另一 种重要的具有转录后调节作用的miRNA:let一7，后来发现了大量类似

8、RNA，2001年起统一称为miRNA。,28,miRNA通常来源于一个大小约为 1000bp的长链RNA初始转录产物(Pri一miRNA)，Pri一miRNA分子在细胞核中经过双链RNA特异性核酸酶Rnaselll一Drosha的作用形成70-100nt的具有茎环结构的RNA分子(pre一miRNA)。pre一miRNA在转运蛋白一5(Exportin一5)的作用下转运至胞质中，被另一个双链RNA特异性核酸酶Rnaselll一Dicer识别，进一步被切割成长约22nt的小分子RNA，即成熟的miRNA。成熟miRNA在RNA诱导的沉默复合物引导下，当与mRNA完美互补时，miRNA便指导mR

9、NA特异性切割;当两者没有足够的互补性时，miRNA则抑制mRNA转录后翻译。,29,随着人类后基因组计划的进一步开展，占类基因组90%以上的非编码序列越来越引起科学家的关注，据计算推测，人类基因组可能存在1000多个miRNA基因，单个miRNA可调控200多个靶基因，约1/3的蛋白编码基因受miRNA调控。,30,miRNA是调节真核生物基因表达的天然反义寡核昔酸链。研究表明，miRNA参与了生命过程中一系列的重要过程，包括发育进程、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡等，与许多疾病的发生、诊断、治疗和预后密切相关，miRNA也因而成为当前研究的新热点。,31,5、免疫调节 将抗原、抗体或细

10、胞因子基因导入患者体内，改变其免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。如可将白细胞介素-2（IL-2）导入肿瘤病人体内，提高病人（IL-2）的水平，激活体内免疫系统的活性。,32,许多肿瘤都能表达一些肿瘤特异的抗原，将这些在正常机体内并不表达的肿瘤特异抗原的编码基因转入肿瘤内，制备成肿瘤DNA瘤苗，再导入患者体内，通过其在机体内的表达可以激发机体对编码抗原的免疫反应。如黑色素瘤相关抗原MAGE、在多种肿瘤中表达的癌胚抗原CEA、病毒基因产物HPV-E6、E7等。,33,6、其他方法 增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。如向肿瘤细胞导入单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，然后给予病人无毒性核苷类似物GCV（甘昔洛

11、韦，ganciclovir）的药物前体，由于只有含单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的细胞才能将GCV转化成有毒的药物，因而肿瘤细胞被杀死，而对正常细胞影响不大。,34,由于基因治疗的人体试验引发了争论，为了规范这一新生事物，使其更好地为人类健康服务，但同时又在人类伦理学的接受范围内，1975年美国国立卫生研究院（NIH）召集和组织了重组DNA顾问委员会（Recombinant DNA Advisory Committee,RAC）,制定了一系列有关重组DNA研究的法规，接着RAC又任命了一个人体基因治疗的分委员会（Human Gene Therapy Subcommittee）,并于1985年颁布了一

12、个权威性的文件，称为“人体细胞基因治疗方案的设计和提请批准的注意要点”，该文件要点如下：,基因治疗的守则,35,1、什么病可以采用基因治疗？即被治疗的疾病是否严重到必须要用这种全新和从未尝试过的疗法？试图增加一个人的能力而不是治疗疾病，将立即被否决。,36,2、该病目前是否有其他治疗方法？要求基因治疗必须用于目前尚无满意疗法的疾病，在其他所有因素均等同的情况下，基因治疗应较其他疗法更有效。,37,3、根据已有的实验室和临床研究，基因治疗对于患者及其子女和接触者的安全性如何估计？即基因治疗的安全性必须有保证。,38,4、根据已有的实验室和临床研究，基因治疗的疗效预计将如何？即基因治疗的有效性在进

13、行人体试验前要有足够的动物试验证据。,39,5、如果满意地回答了上述4个问题，那么如何公正地选择受试者？6、如果上述5个问题都有满意的答案，那么医生将如何把基因治疗的各种情况恰当正确地告知患者，以及他们将如何表达同意和不同意？即要保证患者的知情同意权。,40,7、在满意地回答了上述所有问题后，将采取什么步骤来保护接受基因治疗患者的隐私权？临床申请的基因治疗方案经过审议，如果不符合这些条件，则禁止实施。,（二）、基因治疗的基因导入系统,基因导入系统（gene delivery system）是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。,41,1.病毒载体系统用于基因治疗的病毒载体应

14、具备以下基本条件：1).携带外源基因并能包装成病毒颗粒；2).介导外源基因的转移和表达；3).对机体不致病。,42,大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。,43,病

15、毒载体产生的原理 病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期和分子生物学认识的基础之上。研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构和功能有充分的了解，最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区和非编码区。编码区基因产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；根据其对病毒感染性复制的影响，又可分为必需基因和非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。,44,各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量，即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小的105110。基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。最简单的做法是，将适当长度的外源DNA插入

16、病毒基因组的非必需区，包装成重组病毒颗粒。,45,然而，这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先，许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡；或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。,46,其次，插入外源DNA的长度受到很大限制，尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒相关病毒（AAV，4.7kb）、反转录病毒（810kb）、腺病毒（36kb），如果不去除病毒基因，可供外源DNA插入的容量就十分小。因此，必须删除更多的病毒基因以腾出位置插入较大的外源DNA。为了增加病毒载体插入外源DNA的容量，除了可以删除病毒的

17、非必需基因外，还可以进一步删去部分或全部必需基因，这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。,47,LTR,gag,pol,env,LTR,长末端重复序列,调节和启动转录,产生病毒核心蛋白,产生逆转录酶,产生病毒外膜蛋白,包装信号,以反转录病毒为例：DNA前病毒的结构特征,48,逆转录病毒载体的构建,常用的是莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMLV)构建的各类逆转录病毒载体,LTR,gag,pol,env,LTR,长末端重复序列,调节和启动转录,包装信号,目的基因,标记基因,49,LTR,gag,pol,env,LTR,Gag蛋白,PoL蛋白,Env蛋白,包装细胞系,LTR,LTR,靶细胞,目

18、的基因,标记基因,LTR,LTR,目的基因,标记基因,1,2,3,4,5,假病毒颗粒的产生并感染靶细胞,逆转录病毒载体,重组逆转录病毒(核酸部分是逆转录病毒载体),辅病毒,50,1）物理方法,（1）电穿孔法（electroporotion）将细胞置于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的DNA可渗进细胞，进而表达。瞬间细胞 细胞膜核膜通透性增加 高压脉冲 DNA渗入细胞,（2）显微注射法（microinjection）,利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核,不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。动物实验表明：接受注射外源D

19、NA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。1.将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%40%；2.将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；3.肌内注射凝血因子基因，可产生血友病所需的凝血因子等等。,基因直接注射法的优点,1.制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易；2.排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；3.导入的基因不需整合即可表达，避免了逆转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点；4.基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。,例：转基因动物

20、的制备,重组基因 DNA 微注射（体外）小鼠受精卵 回植 假妊娠 仔 鼠 动物模型：转基因鼠(每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传),clone sheep Dolly体细胞 提取 核 重组细胞 回植 Dolly卵细胞 去核 细胞,（3）微粒子轰击法,利用亚微粒的钨和金能吸附DNA，并将其包裹起来形成微粒，通过物理途径获得高速度，微粒瞬间既可进入靶细胞，达到转移目的基因的目的，而不损伤靶细胞。该方法可使目的基因在皮肤、肝、胰、胃及乳腺等细胞中表达。,2）化学法,磷酸钙沉淀法：目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条

21、件下得以表达。,磷酸钙+DNA 混合微细颗粒 沉淀反应2030min 细胞在沉淀物中暴露 524h 方法简单，但转化效率低。,3 脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。,人工脂质体膜具有如下特点：与体细胞相容，无毒性和免疫原性可生物降解，不会在体内堆积可制成球状(0.0350 m)，包容大小不同的生物活性分子可带有不同的电荷具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适应不同的生理要求,64,脂粒与细胞膜之间四种可

22、能的相互作用形式1、膜间传递 2、吸附 3、细胞吞噬 4、融合,（2）受体介导转移技术,将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。,受体介导转移技术示意图,(三)、基因治疗的途径,根据基因转移的途径分类：1、ex vivo(回体转移或称二步法）将人体细胞从体内取出,基因改造,再移植到人体中。2、in vivo(活体直接转移或称一步法）直接将基因转移

23、到人体中,如DNA注射,口服,喷雾等。有如普通治疗药物,商业化发展方向所在。,68,69,基因治疗的ex vivo 途径,家族性高胆固醇血症是由于肝细胞表面低密度脂蛋白（LDL）受体缺乏所致。取出一小部分肝脏，打碎体外培养，用反转录病毒携带的LDL受体基因转染培养细胞，将整合有LDL受体基因的肝细胞通过门静脉输回肝脏。,70,基因治疗就向打针和吃药一样.,基因治疗的in vivo 途径,71,在大多数基因治疗临床试验中，来自患者血液或骨髓的细胞在实验室中培养。这些细胞被暴露在带有目的基因的病毒中。病毒进入细胞后，目的基因就成为宿主细胞DNA的一部分。这些细胞在实验室培养后，通过静脉注射重新回到

24、患者体内。这类基因治疗被称为ex vivo，就是体外的意思。基因是被运送到患者细胞中，但这些细胞存在于患者体外。在其他研究中，载体被用于将目标基因运送到患者体内的细胞中。这种基因治疗被称为“体内，in vivo。,72,（四）、基因治疗的靶细胞研究,73,基因治疗的靶细胞/器官,1.基因缺陷的细胞:如受体缺陷细胞,肿瘤细胞等原位细胞.2.广泛的细胞类型:造血干细胞 皮肤成纤维细胞 血液淋巴细胞 肌细胞 肝细胞 骨髓基质细胞,74,根据靶细胞的类型分类：1、生殖细胞（germ cell)基因治疗 2、体细胞（somatic cell)基因治疗,75,(1)生殖细胞基因治疗：生殖细胞基因治疗(ge

25、rm cell gene therapy)是将正常基因转移到患者的生殖细胞（精细胞、卵细胞、早期胚胎中）使其发育成正常个体。由于有着床前诊断技术，生殖细胞基因治疗已无必要。,76,(2)体细胞基因治疗：体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)是指将正常基因转移到体细胞，或整合到染色体上，或独立于染色体外，使之表达基因产物，以达到治疗目的。这种方法的理想措施是将外源正常基因导入靶体细胞内染色体特定基因座位，用健康的基因确切地替换异常的基因，使其发挥治疗作用，同时还须减少随机插入引起新的基因突变的可能性。对特定座位基因转移，目前还有很大困难。,77,（五）、基因治疗在单

26、基因遗传病、肿瘤和心血管疾病治疗上的应用,遗传病的治疗,遗传病的治疗分为三个层次：（1）生理水平的治疗对症治疗 苯丙酮尿症限制膳食中苯丙氨酸含量 白 化 病戴帽子和墨镜,（2）蛋白质水平治疗 向病人体内补充缺失的蛋白质。如：血友病补充凝血因子。有时，补充必要的酶也很起作用。纤维性囊泡化病（CF）是美国白色人种中较为常见的遗传病。病儿从肺、胰腺等处分泌粘液，阻碍呼吸、消化等功能。5岁前可能因呼吸阻碍致死。,CF病儿吸入基因工程法制备的 DNA 酶粉，症状大为改善。,(3）基因治疗 遗传病的根治应该是基因治疗，但是基因治疗的难度很高。1990 年第一例基因治疗临床试验使腺苷酸脱氨酶（ADA）基因进

27、入骨髓细胞，再送回病人体内，治疗严重综合免疫缺失症（SCID）获得初步效果。,基因治疗的策略,1.替代缺失的基因（CFTR for CF）2.正常或外源基因的异常表达(insulin)3.靶细胞中表达毒素（TK gene）4.封闭靶细胞中有害基因的表达（antisense）5.核酶（ribozyme）,实施基因治疗的必要步骤如下：找到致病基因 克隆得到大量与致病基因相 应的正常基因 采取适当方法把正常基因放回 到病人身体内去 进入体内的正常基因应正常表达,腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症,ADA缺乏症是一种罕见的遗传病，患者没有正常的ADA基因，他们的缺陷基因不能产生功能性ADA酶。ADA缺乏的孩子

28、一出生就有严重的免疫缺陷，十分容易受感染，有生命的危险。虽然ADA缺乏症能用PEG-ADA治疗，但这种药物十分昂贵（一年要花60000美元），而且必须通过静脉注射来维持生命。,严重联合免疫缺失症（SCID）患儿从出生时起就必须生活在隔离室中。,ADA缺乏症被选为第一个基因治疗试验有以下几点原因：这种疾病是由单个基因的缺陷导致的，基因治疗成功的可能性高；基因调控很简单，总是开启的状态，不像许多其他基因，调控很复杂；ADA的数量无需精确调控。即使很少量的酶也能受益，即使数量很多也能忍受。,腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症,1990年9月14日，安德森将经过改造的含有健康基因的白细胞输入因腺苷脱氨酶缺乏造

29、成先天性免疫功能不全，只能生活在无菌的隔离帐里的4岁女孩的左臂静脉血管，以后的10个月内她又接受了7次同样的治疗。1991年1月，另一名患同样病的女孩也接受了同样的治疗。两患儿经治疗后，免疫功能日趋健全，走出了隔离帐，过上了正常人生活，并进入普通小学上学。,基因治疗遗传病,继安德林之后，法国巴黎奈克儿童医院的费舍尔博士与卡波博士也对两例SCID患儿成功地进行了基因治疗。,基因治疗遗传病,89,2）、血友病B：是基因治疗的模式病种之一。常规治疗以输血和血制品为主，既会引起严重输血反应，还容易感染病毒，此外还因凝血因子在血液中半衰期短，需要经常性输入，不仅不方便而且治疗费用昂贵。基因治疗为血友病B

30、的治疗开辟了一条新的途径。,90,血友病B是基因治疗的理想病种，其发病的生化和遗传机制已被阐明，而且hFIX是分泌型蛋白，能在多种组织中被表达、加工和分泌，基因治疗的靶组织选择范围广。另外，血友病B的基因治疗对靶细胞表达量的要求不高，只要达到正常人hFIX血浆浓度的10%（约500ng/mL）左右，就能治愈患者凝血功能的缺陷，同时血友病B有基因剔除的动物模型，有成熟的hFIX表达量和凝血活性的测定方法，便于进行基因治疗的疗效评价。,91,目前，血友病B的基因治疗取得了一定的进展，但在大动物和人体试验的结果还不够理想，需进一步提高hFIX的表达水平以提高治疗的有效性和安全性。,2、肿瘤基因治疗,

31、肿瘤基因治疗是通过将外源基因导入目的细胞并有效表达从而达到治疗肿瘤的目的。按目的基因的功能分为以下几种：,92,1）、抑癌基因的导入和癌基因的反义核酸导入疗法肿瘤形成的分子机制涉及到癌基因的激活和抑癌基因的失活。近年来相继克隆了Rb、p53、NF1、DCC、ERBA、APC、MTS等抑癌基因。Rb基因缺陷会导致视网膜母细胞瘤、小细胞肺癌和膀胱癌等肿瘤，将正常的Rb基因导入视网膜母细胞瘤中，该细胞将失去致瘤能力。,93,在超过50%的肿瘤中都发现有p53基因的突变。将野生型p53基因转染肿瘤细胞，肿瘤细胞会发生凋亡，在动物体内致瘤能力下降。Clayman等采用腺病毒携带p53基因治疗头颈部肿瘤取

32、得了较好的疗效。,94,在癌基因的反义基因治疗中，目前已经选取的靶基因很广泛，癌基因包括c-src、c-fos、H-ras、K-ras、c-myc等；自分泌的生长因子及其受体基因包括IGF-1、IGF-1受体、EGF、TGF-等。Amini等首先将表达src反义基因的质粒导入v-src过度表达的转化细胞，结果该细胞的致瘤性下降。Laird将带有TGF-反义基因的反转录病毒转染肝癌细胞株，细胞在裸鼠体内的致瘤性下降；Lian将IGF-1反义基因导入C6大鼠胶质瘤细胞，该细胞致瘤性下降。,95,2）、免疫基因疗法由于在肿瘤的发生发展过程中存在机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫耐受状态，而这种状态可能源于

33、肿瘤细胞本身的免疫原性不强（如MHC表达量不足），也可能源于抗原递呈细胞不能提供足够的共刺激信号（如B7）或者机体免疫因子分泌不足等。因此可以通过以下方法纠正机体肿瘤的免疫耐受状态。,96,（1）、MHC抗原MHC抗原与免疫识别和免疫应答有关，只有T细胞识别了抗原呈递细胞上的MHC抗原后，才能识别外来抗原并产生免疫应答。由于肿瘤细胞存在功能性MHC I类抗原和/或共刺激信号表达较少，因而可能逃避免疫系统的监视。可以将一些与免疫识别有关的基因（如HLA、B7等）转染到体外培养的肿瘤细胞，经照射后再植入患者体内；或将表达HLA、B7的病毒载体或质粒DNA与脂质体复合物直接注射到瘤体内，以增强肿瘤细

34、胞对机体免疫系统的免疫原性，激活机体的抗肿瘤免疫活性。,97,（2）、制备肿瘤DNA瘤苗 许多肿瘤都能表达一些肿瘤特异的抗原，将这些在正常机体内不表达的肿瘤特异抗原的编码基因导入患者体内，通过其在机体内的表达从而可以激发机体对编码抗原的免疫反应。如黑色素瘤相关抗原MAGE、酪氨酸酶、癌基因融合基因产物P210bcl-abl和病毒基因产物HPV-E6、E7及癌胚抗原CEA等，这些肿瘤特异性抗原编码基因可用于制备肿瘤DNA瘤苗。肿瘤DNA瘤苗的转移途径包括重组病毒感染、直接注射等。,98,99,（3）、细胞因子基因转移抗肿瘤免疫效应细胞将细胞因子基因（如IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL

35、-7、IL-12、INF-、TNF-、G-CSF、GM-CSF等）导入抗肿瘤的免疫效应细胞（如TIL(tumor infiltrating lymphocyte,肿瘤浸润淋巴细胞)、LAK（lymphokine activated killer cell，淋巴因子活化的杀伤细胞）及CTL（cytotoxotity T lymphcyte，细胞毒T淋巴细胞）中，以提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和反应能力，这实际上是免疫治疗和基因治疗技术的组合，一定程度上克服了细胞因子注射疗法需反复多次、副作用大等缺点，疗效也有所提高。肿瘤免疫细胞因子基因治疗因其简单、有效、安全，已成为肿瘤免疫基因治疗研究的最

36、常用方法。,100,（4）细胞因子基因转移肿瘤细胞 肿瘤细胞经过细胞因子转移后，其MHC抗原分子表达增强，成为免疫原性更强的瘤苗，使多种免疫细胞在肿瘤局部浸润，增强机体对肿瘤的免疫功能。,101,（5）“自杀基因”疗法 将“自杀基因”（suicide gene)导入肿瘤细胞，其能将无毒性前体药物在肿瘤细胞内代谢为毒性产物，进而选择性的杀伤肿瘤细胞。能够编码产生将非活性或无毒性前体药物转化成活性活毒性药物的酶的基因，称“自杀基因”。,自杀基因的作用机制,TK/GCV 单纯疱疹病毒（herps simplex virus,HSV）型胸苷激酶（thymidine kinase,tk）基因编码胸苷激酶

37、，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir,GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。,CD/5-FC 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase,CD）基因，在细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）转变成毒性产物5-氟尿嘧啶（5-FU）。,1.自杀基因系统,旁观者效应:“自杀基因”治疗不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。,2.旁观者效应,105,3、心血管疾病基因治疗,心血管基因治疗:VEGF165（血管内皮生长因子）对于血管的生成具有重要作用,而一些心脑血

38、管疾病由于血管堵塞,狭窄导致,可以采用该策略进行血管再生,旁路再通,使病人免受开刀搭桥之苦.美国已经有多项方案进入临床试验,临床试验结果显示:新血管生长、心肌血流灌注和室壁功能改善，大多数病人的心绞痛减轻。,（六）基因治疗面临的问题和挑战,基因治疗的发展经历了“乐观与热情失望与怀疑理性与挑战”的过程，这是符合事物发展规律的。目前，基因治疗领域存在的主要问题是有效性和安全性。,106,主要表现为：(1)基因导入系统缺乏靶向性，效率也较低。如以腺病毒为载体的p53基因转移治疗恶性肿瘤的方案中，只能直接将腺病 毒注射到肿瘤局部。若静脉注射，病毒颗粒将很快被清除，真正能够到达肿瘤组织的很少，难以达到治

39、疗效果，且增加了副作用。前面提到的第一例逆转录病毒介导ADA 基因转移成功治疗SCID 的病例，因为导入效率较低，前后经历了11 次体外转导和回输。,107,(2)目前针对遗传性疾病的基因治疗方案大多采用逆转录病毒载体，其插入或整合到染色体的位置是随机的，有引起插入突变及细胞恶性转化的潜在危险。而理想的基因治疗方案应该是在原位补充、置换或修复致病基因，或者将治疗基因插入到宿主细胞染色体上不致病的安全位置。,108,(3)理想的基因治疗应能根据病变的性质和严重程度不同，调控治疗基因在适当的组织器官内和以适当的水平或方式表达。但目前还达不到这一目标，其主要原因是：现有的基因导入载体容量有限，不能包

40、容全基因或完整的调控顺序，同时人们对导入的基因在 体内的转录调控机理的认识有限。,109,1999年9月份，18岁美国青年Jesse Gelsinger因一种在医学上称为鸟氨酸转氨甲酰酶不足症的罕见遗传性疾病而在美国宾夕法尼亚州大学人类基因治疗中心接受基因治疗时不幸死亡，成为被报道的首例死于基因治疗中的患者。,基因治疗出现的问题,2002年，法国患有重症联合免疫缺陷病11名儿童基因治疗获得成功。但是，没过多久，检查出1名儿童患上某种类似白血病，有关专家认为这是由基因治疗引起的。这立刻引起各国的广泛关注。,基因治疗出现的问题,治疗基因插入逆转录酶病毒载体，再进入患者细胞中与DNA结合。这些病毒载

41、体虽经过处理可防止感染，但无法控制病毒载体在DNA上的插入位置。担心病毒载体会破坏重要基因，导致“插入型突变”。如果破坏的是负责调控细胞生长和分裂的基因，就会产生癌症。但也有人认为，不能排除有些病人是后发生癌症的可能。此前基因治疗没有发生类似问题。可通过改造逆转录酶病毒减少插入变异的风险。可行的办法是给载体安上“自杀”基因。用特定抗病毒药物让病毒“自杀”，将癌症消灭在萌芽阶段。,基因治疗出现的问题,目前，基因治疗已从最初的单基因缺陷病，发展到帕金森综合征、心脏病和艾滋病，其中大约三分之二的临床试验是针对癌症的。美国费城杰弗逊医学院的研究人员已经成功地在动物身上实现了用基因治疗的方法预防胃癌。科

42、学家的下一步目标是进行口服基因试剂的试验。,基因治疗的发展,基因治疗3个阶段：19801989年为准备期。在临床前研究和舆论准备。19901995年为狂热期。1990年9月第一例成功，带来一片狂热。一些关键技术没有解决，在临床应用中碰壁也是正常的。1996年进入理性期。对临床试验进行评估，提出关键问题进行研究，从狂热转入理性化的正常轨道。,基因治疗的发展,将人基因图记录在光盘上。医生打开光盘，检查几个“候选基因”，并把重要区域、重要基因、重要位点搞清楚。针对个体差异，医生开出“特效药”就行了。迄今所有的药物，都是通过修饰基因的结构，调节、改变人体的基因表达，改变基因产物的功能从而达到治疗的目的

43、，是间接的“基因治疗”。真正的“基因治疗”是把治病的基因直接送到人体细胞中而发挥治疗功效，基因治疗不仅要找到致病的等位基因与正常的等位基因的区别，还要有“治疗基因”。,基因治疗的发展,白细胞介素-2：肾肝胰腺癌，慢性肝炎，黑色素瘤等辅助治疗表皮细胞因子(EGF)：表皮生长，治疗烧伤人生长激素(hGH)：儿童生长激素缺乏粒状细胞集落刺激因子(GDSF)：促白细胞生长，增加免疫，治疗白血病、爱滋病粒状嗜细胞集落刺激因子(GMGGSF)：IL-3配合促白细胞生长，治疗再生障碍性贫血,基因工程产品,基因工程产品,缺乏生长激素造成的侏儒症,巨人症患者,促红细胞生长素(EFG)：促红细胞生长链激酶(CSK

44、)：溶血栓尿激酶原(pro-UK)：溶血栓-干扰素：抗病毒人肿瘤坏死因子(TNF)：治疗癌症酶：工业用酶，分析、临床检测用酶，工具酶,基因工程产品,尿激酶,尿激酶溶解血栓过程,在胚胎发育的最早阶段（受精卵）引入外源基因，经整合，使发育的个体携带外源基因的动物。,转基因动物,转基因羊,羊受精卵,凝血因子基因,代母亲,乳汁含治疗血友病的凝血因子,将基因注入受精卵,带有人凝血因子基因的转基因羊,羊奶可治血友病,携带鸡IBDV基因（传染性法氏囊病毒）的绵羊,携带人mAAT蛋白（抗胰蛋白酶）基因的转基因山羊,转大鼠生长激素基因的“超级”小鼠,转基因超级兔,转基因鱼,转基因观赏鱼,抗CMV甜椒,转基因蔬菜,发展与展望,基因定向进化：点突变，基因重构基因设计：根据蛋白质设计进行高效表达系统构建：新的宿主及表达系统，基因表达调控，满足不同需要多基因的共克隆与表达代谢工程的设计生物发生器或生物反应器,基因治疗在临床上能寅际应用，应符台下列条件:有效性、安全性、经济性、容易操作等，同时从科学的观点可以预测较其它治疗为优。,发展与展望,