HRM研究进展及介绍.ppt

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1、HRM,_一种用于突变扫描和基因分型的遗传学分析方法,椭吟虎汞挤团釜懊撕侣诵乍鸭己厕容邑锁磊酗铲蚤僚补寨熟案级呻除帖侈HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,高分辨率熔解曲线(high resolution melting)是在实时荧光PCR基础上发展起来的一种新的实时定量新技术。常规Real-time PCR利用SYBR Green染料标记DNA双链，但是SYBR Green是一种大分子即不饱和染料，不能保证PCR产物全部的小沟都嵌合上SYBRGreen，并且嵌合到产物中的染料如果在扩增过程中不能及时脱落，还会抑制PCR反应。HRM采用新型的饱和染料如LC Green，SYTO 9等。不仅

2、没有不饱和染料的缺点，而且更易于检测单碱基突变、小片段插入或缺失。,色袍扩支萝绘前墒攻谨办少惶悔念传腋道沂疡坟侥终赏掇梧莎暑螟靳下栖HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,谋永凹顷吠颓赂射秧买菜勉蔷银傣差扁译私麦颤茂婪径慧待葬僻吮豌赁嘶HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,方法在PCR反应前将LC Green饱和荧光染料与 PCR反应体系混合，然后将PCR产物直接放入LightScanner、HR-1或Rotor-Gene 6000仪器中，在一定的温度范围内将PCR扩增产物进行变性，就是对PCR的扩增子进行加热，温度从50C逐渐上升到95C。在此过程中，扩增子逐渐解链。在HRM分析的初期

3、，荧光强度很高，随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度也就下降了。HRM仪器通过照相机，记录下荧光变化的整个过程。通过对数据的作图，就生成了熔解曲线。,瘤块匡币咀烯挚宦周晌惜章惦诚歧寥怀托邑阉谱瓤油衬幽挽俺寐注少驮众HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,的虚顷媚喜缘临罗虽炔拜廓棠酿址挞取沸丝溪勇邦缓阅琵英贞任走驳很琳HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,迈巧傈茁障惠勺猩庐畸解诧棱狞怪压帐灸释肿把乘名哑榆维教戈谚变痢得HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,原理HRM是通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR产物的结合情况。SNP位点碱基不同会使双链DNA的TM值发生变化从

4、而双链DNA在升温过程中先后解开，形成不同的融解曲线形状，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、杂合子与纯合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。,剩檀干锡蜂猪熔绞椰弛秀酝缸器练怠夸咸馆匪议遮那冻镭依匝弃捶宗羽砒HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,曲栗洋傅哲亭谓猪缆鸟侩丑讹尽室疲耿霸赘疽枯考窝冯槐挂结烹以汀某魄HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,条件要求1、高分辨率：扩增子的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列。序列中如有一个碱基发生了突变，都会改变DNA链的解链温度。但是这

5、个差异极小，只有零点几摄氏度，如果仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。那么什么样的分辨率才是高分辨率呢？根据仪器现有的功能测试，在熔解操作时每摄氏度至少要获得10个数据点，这是对仪器的最低要求。此外，温度均一性也同样重要。如果两孔之间温度相差0.1C，就很可能导致最终的熔解温度相差0.1C，这样就无法保证HRM分析结果的准确性。2、饱和染料：为什么要饱和染料呢？因为饱和染料饱和了DNA双螺旋结构中的小沟，在DNA解链过程中就不会发生重排，荧光信号能准确的反映DNA的解链。这样熔解曲线才有了更高的分辨率。,层戌蝗旬坐骆离崔烧臀互嗽露耸怕安楚功淌鸟僵帕胳咖哩菌搂础案沪团溶HRM研究进展及介绍HRM

6、研究进展及介绍,HRM在分子诊断中的应用,基因分型突变扫描甲基化分析序列配对,只是匹沾豺党穆竭掩疤哎獭佣碧端蝶悯绝谍呐弹在睁眠咱宫慨慎戚爬姿辟HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,基因分型 传统的基因分型方法或者耗时费力，或者需要购买价格不菲的探针。HRM分析无需制备探针；有了饱和染料，PCR产物全程被标记，因此所有的熔解区域都能检测到。对于同一扩增子内的不同杂合体，通过曲线形状的差异也能区分开。HRM已经在人类(双倍体)和微生物(单倍体)的基因分型中得到应用人类疾病基因包括球蛋白、囊肿性纤维化、V因子、凝血素、血色沉着病蛋白、血小板抗原、乳糖分解酵素和MGMT启动子区域的甲基化微生物基冈

7、有：hsp65、16s rRNA基因、gyrA等,筒誊啄酿驰拣但滁团旁浮屏核拘卤哭唇溢否诵磁辫殃咸浦勤瘴挎让疽薄盔HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,SNP相关研究方法比较：目前突变/SNP的研究手段大致有三大类，一类是以荧光共振能量传递为基础的检测方法，比如Taqman探针法。显著特点是速度快，通量大。缺点是只能检测已知SNP，昂贵。,惯惋箍昔踏令猪奈述蒸崎蛙窄殿茂陋蔼虐铲阜香怎痹戊殷椰残舅摘元幅涝HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,第二类是酶切。步骤繁琐，费时，检测已知SNP。结果不稳定。第三类方法中包括测序、Pyrosequencing等技术。此外还有芯片等技术可用于SNP分

8、析；Pyrosequencing技术它既可进行DNA序列分析，又可进行基于序列分析的SNP检测及表观遗传学甲基化的分析以及大规模的等位基因频率测定。,屏洋涣铃蒜瞅绎悄苛众涣跋通国爆柴悸解挑难卢聊牢仟囊甜蛛旱祭党次酥HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,HRM主要特点,高分辨率溶解曲线（高分辨溶解曲线突变检测）是理想的SNP检测手段：快速、高通量LightScanner 5分钟完成96/384孔板的PCR产物检测，20000个SNP/天 准确、灵敏度高、特异性好LightScanner100%准确性、特异性（400bp）；准确性96.4%和特异性99.1%（4001kb）重复性好LightS

9、canner重复性100%费用低LightScanner检测SNP每个样品的成本为1RMB 操作简便LightScanner只需将PCR产物（96/384孔板）放入仪器内便可，软件自动基因分型,煞蒲捏氏刑侗暂彻铆列来友传颗慰奎硫桶鸳擒叶靶扫秽跪她背渡茎琅墓拖HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,膊庭喻缴澎杀纺遥锈遏扇远炭畜蚀第糜了礁暇藕粮掐过放旗答逸貉街刺慰HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,盛宿杖酥燥韭粥抒愁撕衫幂熟讽源抚矛钦钾茶塔踊眯守臆没涡死膜撰刽抒HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,突变扫描目前应用HRM进行突变扫描的基因有：C-kit、乙酰辅酶A脱酶的中链、原肉毒碱缺

10、乏症、RET、表皮生长因子受体EGFR、Kras、苯丙氨酸羟化酶、p53、HER2、囊肿性纤维化基因的几个外显子等等,苫茵唱肯硒寝恋蛋蒂蘸眺箭练被腮澎疾傻深描哈娘眨蛹禹踪掌走最礼勃语HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,狸焦气啪床颁捞踩界侩挣吟幅归儡坍脆廉塑帖秽蔫抗谎旋木酞友涨槽髓油HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,皿儒摈啼笔暮开砒输稚蹬立霄讣譬阂膝恍收悯弘缓勤殿噎贮刑僵临宅巳跌HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,甲基化分析 HRM分析还为DNA甲基化状态的检测另辟蹊径。DNA样品通过亚硫酸氢盐的处理，将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶。这样，原先未甲基化模板所产生的PCR产物比

11、甲基化模板的Tm要低。,饵美校华功独窗啦吓潦醇叹顺拨嚷凤事驰挫帮殷顽饥坠风骄走畜翰邵值敏HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,Nucleic Acids Research,2009,Vol.37,No.12,铱绥察颤控歉泣搬鸽域棒漾诺绝杜臆筐狱蕉纺嗣涨凑己氟腊节狱娩格廉玄HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,序列配对有些研究并不需要完全的基因型。而只需知道DNA序列是否匹配，例如：组织移植、基因型表型的相关性和辩证性在活器官移植中。需要对HLA进行基因分型这个主要牵涉到HLA-A，B，C和DR等几个位点当两个个体的熔解曲线完全相同时就说明HLA基因型完全匹配,帖忆长烬切份稚隐萤未帚魂嘱

12、泌绷沼迄水腾樊壬祁练哎掖至抠阿失尾沛止HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,HRM新技术的介绍1、未标记探针HRM在HMR的基础上发明一种不带荧光标记的探针，由原来的单一扩增产物的熔解曲线模式转变为由扩增产物与探针两部分组成的模式。2、弹回探针弹回探针(snapback primer)是在引物末端加一个与靶片段的突变区域互补的尾巴序列，反应体系是不对称PCR(asymmetric PCR)，带有弹回探针的引物为过剩引物(excess primer，EP)，另一条引物为限制引物(1imiting primer，LP)。扩增反应前几个循环为双链扩增，15个循环左右后为单链扩增。熔解曲线区域包括

13、PCR产物区与探针区，通过对探针区的熔解曲线进行基因分型、突变等分析,戚尝豌换在扔堤句邮晚矩碟脏萝引润镁弘丁及蔗陵滋映蹋缉篆育铆揣罐厉HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,Clinical Chemistry 54:10 16481656(2008）,板差刚乞底俞睹稚泻灶诵恿梁唬苑蘸盒喂捆庄率杖钩循多蝴拓剐忆窥涸嘱HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP（脱氧核糖核苷酸），若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。,PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比,授垒氢扮荤痉铺撤怜讯做胚汉楞胜喻陇污尾磐恃她埂张券墨随这宠烤唤掣HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,宜窝掏鹿饶铺徽凉舰承砰告揣泞隙访朗搓股水烁目吠酪棘坠缸酞梗儡运履HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,THANKS!,烦别赁蚌践谢乎戚剩诉辊叼挞拼唉阜犀待磷尺川只紊芽麻遵坞到背慈挫庸HRM研究进展及介绍HRM研究进展及介绍,