克隆抗体制备技术.ppt

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1、第六讲 单克隆抗体制备技术,（一）单克隆抗体的概念,单克隆抗体是指由一个B细胞分化增殖的子代细胞（浆细胞）产生的针对单一抗原决定簇的抗体。1975年 Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术，这项技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度准确的新纪元。,免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强，亲和力大，滴度高的特异性抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交瘤细胞经无性繁殖而来的细胞群产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针

2、对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲和性也一致。,单抗与多抗的不同,表位A,表位B,表位C,抗原,克隆A,克隆B,克隆C,单克隆抗体制备过程,1、致敏淋巴细胞的准备2、骨髓瘤细胞的准备3、细胞融合4、选择性培养5、抗体分泌细胞的筛选6、克隆化过程7、单克隆抗体的制取,抗原,致敏淋巴细胞,骨髓瘤 细胞,融合,选择性 培养,抗体分泌细胞筛选,克隆化,单抗制取,单抗纯化,单抗鉴定,致敏淋巴细胞的准备,动物选择：品系、年龄、性别、健康状态抗原接种：方式体内、体外 剂量0.5-100g 次数视抗原而定 间隔视抗原而定 佐剂视抗原而定收集时间：末次接种后72h,骨髓瘤细胞的准备,细胞株处于良好的生长状态细

3、胞株保持HGPRT缺陷状态,HGPRT：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶,细胞融合,方式：物理、化学、生物PEG融合要点：（见图）,致敏淋巴细胞,骨髓瘤细胞,离心 1000rpm 10min,50%PEG 1ml,培养液 10ml,离心 1000rpm 7min,37。C摇动、由慢渐快1min、静止1.5min,加入HAT培养液悬浮细胞，置于培养孔内,选择性培养,随机融合后的细胞类型HAT选择培养原理,随机融合后的细胞类型,细胞组合 HGPRT 生长状态淋巴细胞+骨髓瘤+长期生长淋巴细胞+淋巴细胞+短期生长骨髓瘤+骨髓瘤 不能生长未融合淋巴细胞+短期生长未融合骨髓瘤 不能生长,HAT选择培养原理

4、,核苷酸从头合成途径（de novo synthesis）,核苷酸补救合成途径（salvage synthesis）,核苷酸,DNA,氨基碟呤（A）,次黄嘌呤（H）,胸腺嘧啶核苷（T）,抗体分泌细胞的筛选,对筛选方法的要求：多大量样品一次检测 快迅速取得检测结果 准检测结果可靠性高 灵检测方法灵敏度高常用筛选方法：ELISA、IFA等,克隆化过程,概念：建立单一细胞克隆方法：有限稀释法克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔饲养细胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞,有限稀释法,计数,103/ml,102/ml,10/ml,0.5-2/孔,单克隆抗体的制取,制取方式：体外培养罐法体内腹腔接种纯化

5、：盐析、层析、制备型HPLC鉴定：特征鉴定Ig类型、亲和力、效价、特异性决定簇鉴定是否针对同一决定簇,多抗与单抗制剂的比较,多抗 单抗 单抗（血清）（腹水）（培养上清）特异性抗体含量（mg/ml）无关Ig含量（mg/ml）10 0.5-1 其他血清蛋白 大量 极少 均一性+特异性 多决定簇 单决定簇 单决定簇稳定性 较好 略差 略差重复性 差 好 好,单克隆抗体的特性,1、理化性状高度均一2、抗原结合性高度特异3、生物活性高度单一,杂交瘤技术制备单抗,单抗的应用,1在血清学技术方面 提高了方法的特异性、重复性、稳定性和敏感性，同时使一些血清学技术得到标准化和商品化，即制成诊断试剂盒。自单克隆抗

6、体技术问世以来，已研制出很多病原微生物的单克隆抗体，可取代原有的多克隆抗体，用于传染病的诊断及病原的分型，避免了多克隆抗体引起的交叉反应。,单抗的应用,2在免疫学基础研究方面 对抗体结构和氨基酸顺序的分析应用单克隆抗体对淋巴细胞表面标志以及组织细胞组织相容性抗原的分析:用单克隆抗体对淋巴细胞CD抗原进行分析，可以对淋巴细胞进行分群。,单抗的应用,3在肿瘤免疫治疗方面 通过采用杂交瘤技术，制备出肿瘤细胞特异性抗原的单克隆抗体，然后与药物或毒素连接制成免疫毒素（immunotoxin），又称生物导弹，用于肿瘤的临床治疗，这在医学上已获初步成效。,单抗的应用,在抗原纯化方面 利用单克隆抗体的特异性，可将单克隆抗体与琼脂糖等偶联制成亲和层析柱，可从混合组分中提取某种抗原成分。此技术可与基因工程疫苗的研究相结合，即先用单克隆抗体作为探针，筛选出保护性抗原成分或决定簇，然后再采用DNA重组技术表达目的抗原。,展望,自1975年以来，单克隆抗体技术本身也取得了极大的发展，T细胞杂交瘤、T-B细胞杂交瘤、人-人B细胞杂交瘤、人T细胞杂交瘤以及用于制备双特异性抗体的三源杂交瘤和四源杂交瘤等技术相继问世、进一步促进和推动了免疫学及其它相关学科的发展。,